专利名称：一种硒化卡拉胶及其制备方法
一种硒化卡拉胶及其制备方法
技术领域：
本发明属于多糖类化合物技术领域。更具体地，本发明涉及一种硒化卡拉胶，还涉及所述硒化卡拉胶的制备方法。
背景技术：
硒化卡拉胶Geleno-carrageennan)是无机硒(亚硒酸钠、亚硒酸、硒酸钠、硒粉) 和卡拉胶(以红藻类植物为原料制备的多糖)通过化学合成制备的一种含硒的多糖类化合物。它作为一种新型的有机硒化合物，广泛应用于生物医药、保健食品、美容化妆、食品、饲料添加剂、生态农业等领域，由于其用途不断被开发，市场潜力巨大，极具发展前景。硒化卡拉胶集有机硒与多糖诸多生理功能于一体，可增加机体的抗氧化能力、提高人体免疫功能、 清除体内自由基、抗衰老、防癌、抗癌、防治心脑血管疾病等，尤其是具有抗艾滋病毒(HIV) 的效果，更引起人们的高度重视(于占洋侯哲主编《微量元素与疾病诊断与治疗》人民卫生出版社，2001)。我国是世界上缺硒最严重的地区之一，根据中华人民共和国《地方疾病与环境因素图集》揭示，从东北三省向西南蔓延至云贵高原，存在一条宽广的缺硒、低硒带，加之西北和其它地区，使缺硒、低硒地带占我国国土面积的72%。我国22个省市的部分地区，有7 亿人口生活在低硒地区，进而引发多种疾病的发生。1976年国际硒营养学会推荐每天摄入标准为60 μ g，1980年中国营养学会推荐日采摄标准为50 μ g。(徐辉碧编著《生物微量元素-硒》华中工学院出版社，1984)研究表明无机硒毒性较大，中毒量与需要量之间范围小，使用量需要严格控制。 目前日本、美国等发达国家已禁止作为食品添加剂使用。而有机硒毒性、副作用远比无机硒低，动物试验表明，有机硒化卡拉胶LD5tl为4. 92g/Kg，同类亚硒酸钠LD5tl为7mg/Kg，其毒性降低700多倍，毒性最大耐受量(MIC)为16g/Kg，属无毒级，同时使用剂量容易控制，可缓慢释放、吸收，生物利用率高，1992年经全国食品添加剂标准化技术委员会批准，作为新型食品添加剂，有望替代亚硒酸钠在食品、保健品和临床治疗方面应用，因此如何将无机硒转化为有机硒有很强的现实意义。国外未见硒化卡拉胶研究和专利报道，国内有一些有关有机硒的专利申请，例如 CN88103347、CN92107669、CN00111262、CN200410067065、CN200910161061、 CN200910162003.CN200610045481等，其中CN92107669涉及硒化多糖及其制备方法。该方法包括富硒酵母一提取一分离一加碱勻浆一中和一浓缩一乙醇沉淀一精制一成品等步骤。 该方法涉及菌种选育、培养、提取、分离等步骤，对环境条件要求较严、制备工艺相对复杂、 硒含量较低，为400 μ g. Se/g0 CN88103347涉及硒化卡拉胶的制法。该方法包括以浓硝酸溶解硒粉，配制成硒液；再配制卡拉胶溶液。将两种溶液混合，在温度50-8(TC下进行硒化反应2-4h，接着在温度20-30°C下反应12-Mh，加乙醇沉淀，过滤，洗涤，干燥，得到硒含量 8-12mg · Se/g的硒化卡拉胶。该方法制备的硒化卡拉胶除硒含量较低外，同时使用硒粉与浓硝酸反应，生成的硒化氢副产物是剧毒化合物，对人体危害较大。CN00111262公开了硒化多糖化合物及其制备方法。该方法包括将多糖类化合物(红藻多糖及卡拉胶、壳聚糖、褐藻糖)与亚硒酸在酸性溶液中经Ba2+、H+的催化作用，加热10-100°C，恒温反应5_10h，降至室温。用硫酸沉淀Ba2+，滤液加三氯化铁溶液除去未反应的亚硒酸根离子，放置过夜，离心分离沉淀物，用不同浓度的乙醇分级沉淀，沉淀物真空干燥，得粗制品。粗制品经不同膜径超滤设备精制，得硒化多糖精品，硒含量15-125mg · k/g。该法制备的硒化卡拉胶，虽然硒含量比前者大大提高，但步骤较多，周期较长3-4天，制备过程中卡拉胶和硒的损失量较大， 卡拉胶的回收率为17. 5-29. 4%，硒的回收率为1. 8-4. 6%，造成大量的资源消耗和环境污染，同时使用钡盐作催化剂，存在一定毒性。为了解决现有的技术不利之处，本发明人经过多次试验，研究完成了本发明的方法。
发明内容[要解决的技术问题]本发明的目的是提供一种硒化卡拉胶。本发明的另一个目的是提供一种硒化卡拉胶的制备方法。[技术方案]本发明是通过下述技术方案实现的。本发明涉及一种硒化卡拉胶的制备方法。所述方法的步骤如下(1)配料用1000-5000重量份水溶解100-500重量份卡拉胶，然后加入0. 1-0. 8重量份 α -淀粉酶或糖化酶，搅拌均勻，再加入20-80重量份硒化合物或硒粉，搅拌均勻；(2)酶解硒化反应用0. 8-1. 2Μ碱水溶液和0. 8-1. 2Μ酸水溶液将步骤(1)得到的反应混合物的ρΗ 调节到3-7，然后在温度40-70°C与搅拌的条件下进行酶解硒化反应0. l-30h ；(3)灭活将步骤(2)酶解硒化反应液加温至80_95°C，搅拌反应0. 5_lh，使酶失去活性，终止反应，再放置降至室温；(4)絮凝反应再用8-12% (重量/体积)醋酸钠水溶液将步骤C3)终止的酶解硒化反应液的 PH调节至5-9，然后加入4-100重量份的0. 1-2% (重量/体积)絮凝剂，在温度30-50°C 与搅拌的条件下反应2-10h，然后放置过夜，得到絮凝状产物；(5)离心分离步骤(4)得到的絮凝状产物进行离心，除去絮凝剂与未反应游离硒结合的沉淀物；(6)乙醇沉淀往步骤( 得到的离心上清液中加入乙醇溶液，将乙醇在整个溶液中的浓度控制在60-80% (体积/体积)进行沉淀，然后减压抽滤，得到的滤饼采用喷雾或真空干燥法进行干燥，得到硒含量20-100mg. Se/g的硒化卡拉胶。
根据本发明的另一种优选实施方式，所述的硒化合物是亚硒酸钠、亚硒酸或硒酸钠。根据本发明的另一种优选实施方式，所述的α-淀粉酶的酶活是4000-20000IU/ g，所述的糖化酶的酶活是50000-100000IU/g。根据本发明的另一种优选实施方式，所述的絮凝剂选自聚合氯化铝、聚合硫酸铝、 聚合氯化铁或聚合硫酸铁。根据本发明的另一种优选实施方式，在步骤(6)乙醇沉淀时，在整个沉淀溶液中不同的乙醇浓度得到不同平均分子量的硒化卡拉胶(1)乙醇浓度为70-80 % (体积/体积)，硒化卡拉胶的平均分子量为 100-3500Da ；(2)乙醇浓度为65-70 % (体积/体积)，硒化卡拉胶的平均分子量为 3500-8000Da ；(3)乙醇浓度为60-65 % (体积/体积)，硒化卡拉胶的平均分子量为SOOODa以上。根据本发明的另一种优选实施方式，所述的碱选自氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钠或碳酸氢钠；所述的酸选自盐酸、硫酸、硝酸或磷酸。根据本发明的另一种优选实施方式，所述的喷雾干燥是将所述滤饼用水调节至固形物含量10-20% (重量/体积)，然后通过喷雾干燥机，控制其进口温度为170-200°C，出口温度为 160-190 。根据本发明的另一种优选实施方式，所述的真空干燥是把所述的滤饼直接放入真空干燥箱内，在真空度大于0. 09Pa与温度50-70°C的条件下进行干燥。根据本发明的一种优选实施方式，所述的滤饼用水溶解后进行膜超滤分离，得到精制硒化卡拉胶，其不同分子量精制硒化卡拉胶的硒含量如下(1)分子量100_3500Da的硒化卡拉胶的硒含量为60_150mg. Se/g ；(2)分子量3500_8000Da的硒化卡拉胶的硒含量为50_100mg. Se/g ；(3)分子量8000Da以上的硒化卡拉胶的硒含量为30_60mg. k/g。本发明还涉及采用本发明制备方法得到的硒化卡拉胶。所述的硒化卡拉胶具有下述特征(1)平均分子量100-20000Da ；(2)硒含量:20-150mg · Se/g ；(3)旋光度+30_+90 度；(4)光谱特性①紫外光谱在波长^lnm处有特征吸收峰；②红外光谱在波长1383. 90cm"1和607. 83cm"1处有特征吸收峰；③核磁共振氢谱在化学位移4. 8734ppm和1. 9200ppm处有特征吸收峰；④核磁共振碳谱在化学位移76. 744ppm和76. 576ppm处有特征吸收峰。下面将更详细地描述本发明。本发明涉及一种硒化卡拉胶的制备方法。所述方法的步骤如下
(1)配料用1000-5000重量份水溶解100-500重量份卡拉胶，然后加入0. 1-0. 8重量份
α -淀粉酶或糖化酶，搅拌均勻，再加入20-80重量份硒化合物或硒粉，搅拌均勻。卡拉胶，又称为鹿角菜胶、角叉菜胶。卡拉胶是从某些红藻类海草中提炼出来的亲水性胶体，它的化学结构是由半乳糖及脱水半乳糖所组成的多糖类硫酸酯的钙、钾、钠、铵盐。由于其中硫酸酯结合形态的不同，可分为κ型(kappa)、ι型(Iota)、λ型(lambda)。 它不溶于冷水，但可溶胀成胶块状，不溶于有机溶剂，易溶于热水成半透明的胶体溶液；在钾离子存在下能生成热可逆凝胶；浓度低时形成低粘度的溶胶，接近牛顿流体，浓度升高形成高粘度溶胶，则呈非牛顿流体。α -淀粉酶(EC3. 2. 1. 1.)能水解淀粉、糖原和有关多糖中的0_葡萄糖键的酶，例如山东隆大生物工程有限公司、河南仰韶生化工程有限公司、连云港元升实业股份有限公司生产的α-淀粉酶。糖化酶Gluco-Amylase又称葡萄糖淀粉酶(EC3. 2. 1. 3)，是以黑曲霉变异菌株经发酵制得的高效生物催化剂。糖化酶能在常温条件下将淀粉分子的α "I. 4和α -1. 6糖苷键切开，而使淀粉转化为葡萄糖。凡是以淀粉为原料又需糖化的生产过程，均可使用糖化酶以其提高淀粉糖化收率。其系列产品有固体和液体两种类型，适用于淀粉糖、酒精、酿造、味精、葡萄糖、有机酸和抗菌素等工业，例如四川省山野生物科技有限公司、北京东华强盛生物技术有限公司、邢台万达生物工程有限公司生产的糖化酶。酶活力定义为1克酶粉或Iml酶液于40°C与pH4. 6的条件下，1小时分解可溶性淀粉产生Img葡萄糖的酶量为1个酶活单位。在本发明中，使用的α -淀粉酶的酶活是4000-20000IU/g。优选地，使用的α -淀粉酶的酶活是8000-15000IU/g。使用的糖化酶的酶活是50000-100000IU/g。优选地，使用的糖化酶的酶活是60000-80000IU/g。根据本发明，100-500重量份卡拉胶使用0. 1-0. 8重量份α -淀粉酶或糖化酶， 即每克卡拉胶原料投放5-20IUCI-淀粉酶；每克卡拉胶原料投放50-300IU糖化酶。如果 100-500重量份卡拉胶使用的α-淀粉酶或糖化酶低于0. 1重量份，则会使酶解硒化反应时间加长；如果100-500重量份卡拉胶使用的α-淀粉酶或糖化酶高于0.8重量份，则会高效水解，使硒化卡拉胶多糖回收率降低。在本发明中，所述的硒化合物选自亚硒酸钠、亚硒酸或硒酸钠。优选地，所述的硒化合物是亚硒酸钠或硒酸钠。所述硒粉的粒度通常是80-200目，优选地100-150目。根据本发明，100-500重量份卡拉胶使用20-80重量份硒化合物或硒粉。如果 100-500重量份卡拉胶使用的硒化合物或硒粉低于20重量份，则会使有机硒结合率偏低； 如果100-500重量份卡拉胶使用的硒化合物或硒粉高于80重量份，则会使硒原料浪费，造成环境污染。优选地，100-500重量份卡拉胶使用30-60重量份硒化合物或硒粉。更优选地， 100-500重量份卡拉胶使用40-50重量份硒化合物或硒粉。(2)酶解硒化反应用0. 8-1. 2Μ碱水溶液和0. 8-1. 2Μ酸水溶液将步骤(1)得到的反应混合物的ρΗ 调节到3-7，然后在温度40-70°C与搅拌的条件下进行酶解硒化反应0. l-30h。
所述的碱选自氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钠或碳酸氢钠。优选地，所述的碱选自氢氧化钠、氢氧化钾或碳酸钠。所述的酸选自盐酸、硫酸、硝酸或磷酸。优选地，所述的酸是盐酸或硝酸。所述碱水溶液和酸水溶液的浓度并不关键，只需便于调节反应混合物的pH。优选地，所述的酶解硒化反应在pH4-6与温度45_60°C的条件下进行2_15h。更优选地，所述的酶解硒化反应在PH4. 5-5. 5与温度50-55°C的条件下进行l_10h。在该反应中， 搅拌的目的在于反应过程中能够使反应物始终保持充分接触，从而保证反应按照我们的预期进行，并保证反应加速进行。(3)灭活将步骤( 酶解硒化反应液加温至80_95°C，搅拌反应0. 5-lh，使酶失去活性，终止反应，再放置降至室温。酶是活性蛋白质，在高温下蛋白质变性，酶失去水解催化能力。(4)絮凝反应再用8-12% (重量/体积)醋酸钠水溶液将步骤( 终止的酶解硒化反应液的 PH调节至5-9，然后加入4-100重量份的0. 1-2% (重量/体积)絮凝剂，在温度30-50°C 与搅拌的条件下反应2-10h，然后放置过夜，得到絮凝状产物。根据本发明，所述的絮凝剂应该理解是这样一些无机高分子化合物，它们通过吸附、架桥、交联作用与反应混合物中未结合的游离硒生成絮凝物，从而能够有效清除这些游离硒。所述的絮凝剂选自聚合氯化铝、聚合硫酸铝、聚合氯化铁或聚合硫酸铁。优选地， 所述的絮凝剂选自聚合氯化铝、聚合硫酸铝或聚合氯化铁。上述无机高分子絮凝剂是20世纪80年代后期发展起来的一类新型自来水处理剂，目前美、日、西欧及国内青岛已进行工业化生产，与传统的氯化铝、硫酸铝、氯化铁相比， 能提供大量的络离子，絮凝效能提高多倍。在本发明中，所述絮凝剂的浓度是0. 1-2% (重量/体积)。如果所述絮凝剂的浓度低于0.1% (重量/体积)，则游离硒清除率降低。如果所述絮凝剂的浓度高于2% (重量/体积)，则浪费絮凝剂。所述的絮凝反应在pH 5-9与温度30_50°C的条件下反应2-10h;优选地，所述的絮凝反应在PH 5. 5-8. 0与温度35-45°C的条件下反应4_8h，更优选地，所述的絮凝反应在pH 6. 0-7. 0与温度38-42°C的条件下反应5_6h。(5)离心分离步骤(4)得到的絮凝状产物进行离心，除去絮凝剂与未反应游离硒结合的沉淀物。在本发明中，使用离心机将反应液与絮凝状产物分离。本发明使用的离心机是目前市场上销售的人们普遍使用的离心机。(6)乙醇沉淀往步骤( 得到的离心上清液中加入乙醇溶液，将乙醇在整个溶液中的浓度控制在60-80% (体积/体积)进行沉淀，然后减压抽滤，得到的滤饼采用喷雾或真空干燥法进行干燥，得到硒含量20-100mg. Se/g的硒化卡拉胶。在用乙醇沉淀硒化卡拉胶时，控制沉淀溶液不同乙醇浓度60-80 % (体积/体积)可以得到不同平均分子量的硒化卡拉胶。(1)乙醇浓度为70-80 % (体积/体积)，硒化卡拉胶的平均分子量为 100-3500Da ；(2)乙醇浓度为65-70 % (体积/体积)，硒化卡拉胶的平均分子量为 3500-8000Da ；(3)乙醇浓度为60-65 % (体积/体积)，硒化卡拉胶的平均分子量为SOOODa以上。在本发明中，所述的减压抽滤通常是靠水流泵吸走空气，使抽滤瓶内减压，瓶内与布氏漏斗液面上形成压力差，从而能加快过滤速率。因此，所述的减压抽滤是本技术领域的技术人员熟知的减压抽滤方法。本发明使用的减压抽滤设备包括布氏漏斗、抽滤瓶、安全瓶和水流泵，也是本技术领域的技术人员通常使用的减压抽滤设备。所述的喷雾干燥是将所述滤饼用水调节至固形物含量10-20% (重量/体积)，然后通过喷雾干燥机，控制其进口温度为170-200°C，出口温度为160-190°C。所述的喷雾干燥机例如是上海世远生物设备工程有限公司、常州市统一干燥设备有限公司、上海达程实验设备有限公司生产的喷雾干燥机。所述的真空干燥是把所述的滤饼直接放入真空干燥箱内，在真空度大于0.09 与温度50-70°C的条件下进行干燥。所述的真空干燥箱例如是北京利康达圣科技发展有限公司、常州市统一干燥设备有限公司、嘉兴中新医疗仪器有限公司生产的真空干燥箱。根据本发明的一种优选实施方式，所述的滤饼用水溶解后进行膜超滤分离，得到精制的硒化卡拉胶，其不同分子量精制硒化卡拉胶的硒含量如下在本发明中采用超滤膜过滤方法进行过滤。超滤膜过滤是一种采用超滤膜以压力差为推动力的膜过滤方法。超滤膜一般由纤维素及其衍生物、聚碳酸酯、聚氯乙烯、聚偏氟乙烯、聚砜、聚丙烯腈、聚酰胺、聚砜酰胺等制成，例如招远金汇膜科技有限公司、北京海德能公司生产的超滤膜。不同分子量精制硒化卡拉胶的硒含量如下(1)分子量100_3500Da的硒化卡拉胶的硒含量为60_150mg. Se/g ；(2)分子量3500_8000Da的硒化卡拉胶的硒含量为50_100mg. Se/g ；(3)分子量8000Da以上的硒化卡拉胶的硒含量为30_60mg. k/g。上述硒化卡拉胶的平均分子量用高效液相凝胶色谱(HPGPC)法测定，多糖分子量 M与分配系数Kav = Ik2In M有关，Ic1J2为常数，M为分子量，具体操作参考(缪锦来等， 硒化卡拉胶理化性质和分子结构的研究，海洋生物活性物质的研究与开发2002)。本发明还涉及采用本发明制备方法得到的硒化卡拉胶，其特征在于它具有下述特征(1)平均分子量100-20000Da ；(2)硒含量:20-150mg · Se/g ；(3)旋光度+30-+90 度;(4)光谱特性①紫外光谱在波长^lnm处有特征吸收峰；
②红外光谱在波长1383. 90CHT1和607. 83cm"1处有特征吸收峰；
权利要求
1.一种硒化卡拉胶的制备方法，其特征在于所述方法的步骤如下(1)配料用1000-5000重量份水溶解100-500重量份卡拉胶，然后加入0. 1-0. 8重量份α -淀粉酶或糖化酶，搅拌均勻，再加入20-80重量份硒化合物或硒粉，搅拌均勻；(2)酶解硒化反应用0. 8-1. 2Μ碱水溶液和0. 8-1. 2Μ酸水溶液将步骤(1)得到的反应混合物的ρΗ调节到3-7，然后在温度40-70°C与搅拌的条件下进行酶解硒化反应0. l-30h ；(3)灭活将步骤O)的酶解硒化反应液加温至80-95°C，搅拌反应0.5-lh，使酶失去活性，终止反应，再放置降至室温；(4)絮凝反应再用8-12% (重量/体积)醋酸钠水溶液将步骤(3)终止的酶解硒化反应液的ρΗ调节至5-9，然后加入4-100重量份的0. 1-2% (重量/体积)絮凝剂，在温度30-50°C与搅拌的条件下反应2-10h，然后放置过夜，得到絮凝状产物；(5)离心分离步骤(4)得到的絮凝状产物进行离心，除去絮凝剂与未反应游离硒结合的沉淀物；(6)乙醇沉淀往步骤( 得到的离心上清液中加入乙醇溶液，将乙醇在整个溶液中的浓度控制在 60-80% (体积/体积)进行沉淀，然后减压抽滤，得到的滤饼采用喷雾或真空干燥法进行干燥，得到硒含量20-100mg. Se/g的硒化卡拉胶。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述的硒化合物是亚硒酸钠、亚硒酸或硒酸钠。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述的α-淀粉酶的酶活是 4000-20000IU/g,所述的糖化酶的酶活是 50000-100000IU/g。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述的絮凝剂选自聚合氯化铝、聚合硫酸铝、聚合氯化铁或聚合硫酸铁。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于在步骤(6)乙醇沉淀时，在整个沉淀溶液中不同的乙醇浓度得到不同平均分子量的硒化卡拉胶(1)乙醇浓度为70-80%(体积/体积)时，硒化卡拉胶的平均分子量为100-3500Da ；(2)乙醇浓度为65-70%(体积/体积)时，硒化卡拉胶的平均分子量为3500-8000Da ；(3)乙醇浓度为60-65%(体积/体积)时，硒化卡拉胶的平均分子量为SOOODa以上。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述的碱选自氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钠或碳酸氢钠；所述的酸选自盐酸、硫酸、硝酸或磷酸。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述的喷雾干燥是将所述滤饼用水调节至固形物含量10-20% (重量/体积)，然后通过喷雾干燥机，控制其进口温度为 170-2000C，出口温度为 160-190°C。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述的真空干燥是把所述的滤饼直接放入真空干燥箱内，在真空度大于0. 09Pa与温度50-70°C的条件下进行干燥。
9.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述的滤饼用水溶解后进行膜超滤分离，得到精制硒化卡拉胶，其不同分子量精制硒化卡拉胶的硒含量如下(1)分子量100-3500Da的硒化卡拉胶的硒含量为60_150mg.Se/g ；(2)分子量3500-8000Da的硒化卡拉胶的硒含量为50_100mg.Se/g ；(3)分子量8000Da以上的硒化卡拉胶的硒含量为30_60mg.k/g。
10.根据权利要求1-9中任一项权利要求所述制备方法得到的硒化卡拉胶，其特征在于它具有下述特征(1)平均分子量100-20000Da；(2)硒含量:20-150mg· Se/g ；(3)旋光度:+30-+90度；(4)光谱特性①紫外光谱在波长^lnm处有特征吸收峰；②红外光谱在波长1383.90cm-1和607. 83cm"1处有特征吸收峰；③核磁共振氢谱在化学位移4.8734ppm和1. 9200ppm处有特征吸收峰；④核磁共振碳谱在化学位移76.744ppm和76. 576ppm处有特征吸收峰。
全文摘要
本发明涉及一种酶解絮凝法制备硒化卡拉胶的方法。该方法包括配料、酶解硒化反应、灭活、絮凝反应、离心分离、乙醇沉淀与干燥等步骤。该方法催化效率高，反应体系稳定，温度温和，pH适中，工艺简单，成本低廉，无腐蚀性，安全性能好，有机硒结合率高。所述的硒化卡拉胶能充分发挥硒和卡拉胶彼此协调和促进作用，它既是食品添加剂，又能提高免疫性能和防癌、抗癌、抗病毒功能。
文档编号A61P35/00GK102174119SQ20111005134
公开日2011年9月7日 申请日期2011年3月4日 优先权日2011年3月4日
发明者周华生, 张连龙, 成恒嵩, 戴舒春 申请人:张连龙, 无锡健特药业有限公司