筛选结核杆菌抑制剂的细胞模型及筛选方法

专利名称：筛选结核杆菌抑制剂的细胞模型及筛选方法
技术领域：
本发明属于生物学和药学领域，涉及筛选结核杆菌抑制剂的细胞模型及筛选方法。
背景技术：
近年来结核病在全球范围内卷土重来，結核菌的耐药成为当前结核病治疗中所面临的最严重问题。筛选、发现和验证抗结核药物的分子靶标，从靶标上实施突破，是获得新型高效低毒抗结核药物、解决结核治疗特别是耐药结核治疗问题的关键所在。核糖体是细胞内蛋白质合成的场所，而细胞生命的维持依赖于蛋白质功能的正 常行使，因此核糖体成为药物研发的重要祀标(Huntington K M, et al. Synthesis andantibacteria丄 activityof peptide deformylase inhibitors. Biochemistry,2000，39(15) :4543-4551 ；Sinha R R，et al. Thiazoleand oxazole peptides !biosynthesis andmolecular machinery. NatProd Rep，1999，16 (2) :249-263.)。蛋白-蛋白的相互作用是生命活动中广泛而重要的相互作用，是蛋白质正常行使其功能的重要条件，因此蛋白-蛋白相互作用是药物靶标研究的另一重要方向。微生物核糖体蛋白由50S大亚基和30S小亚基组成，大亚单位含有23SrRNA，5SrRNA与30多种蛋白质，小亚单位含有16SrRNA与20多种蛋白质。这些蛋白复合并与核糖组成核糖体正常行使其功能。在微生物核糖体组成蛋白中，众多蛋白作为组成型或功能型亚基协同发挥作用。目前，已经发现多个蛋白间的相互作用机制，如通过共结晶方法证实E.coli核糖体大亚基组成蛋白L12和LlO存在相互作用(Gudkov, A. T. The L7/L12 ribosomaldomain of the ribosome !structural andfunctional studies. FEBS Lett，1997，407 :253-256.)。L12(L7/L12)(编码基因是rplL)是核糖体组成蛋白中唯一的多拷贝蛋白，其中L12是正常的，L7是N末端丝氨酸氨酰化的蛋白，二者以4 I比例的ニ聚体形式存在，简称L12。在核糖体中L12对于转录的有效性和精确性是重要的，井能够激发转录因子的GTP激酶活性。在L12的N末端有两个与LlO结合的部位，L12功能的发挥依赖LlO (编码基因是 rplj)将其锚定于大亚基(Mihaela Diacnu, et al. Structural Basis for theFunctionof the Ribosome L7/L12 Stalk in Factor Binding and GTPaseActivation.Cell，2005，121 :991-1004 ;Griaznova 0，Traut RR. Deletion of C-terminal residuesof Escherichia coli ribosomalprotein LlO causes the loss of binding of one L7/L12 dimer ribosomes with one L7/L12 dimer are active. Biochemistry,2000,39(14)4075-4081.) oL12和LlO在结核杆菌中与E. coli中具有高度的保守性，S. T. Cole的研究也表明结核杆菌中的L12与LlO具有相互作用(S.T.Cole，R. Brosch, J. Parkhill, etal. Deciphering the biology ofMycobacterium tuberculosis from the completegenome sequence. Nature，1998，393，537-544.)。L12 与 LlO 相互作用的正常进行是结核杆菌正常生长所必须的；而L12和LlO的编码基因在結核杆菌内具有保守性并且与人类基因具有很低的同源性，因此具备作为抗结核药物靶标的基本条件。尽管L12和LlO的相互作用已经通过共结晶方法进行验证，但是能否能在生物模型中验证结核杆菌的L12和LlO相互作用，这种相互作用能否用于新型抗结核药物筛选，仍需要进ー步的研究。

发明内容
本发明人经过创造性的劳动和大量的试验，首次利用酵母双杂交的方法(Fieldsb, Song O. A novel genetic system to detect protein—protein interaction. Nature,1989,340 :245-246 ；M Yang,Z ffu,an dFields S.Protein-peptide interactions analyzedwith he yeast two-hybrid System. Nucleic Acids Res, 1995, 23 :1152-1156.)证明了结核杆菌L12和LlO之间的相互作用。并且惊奇地发现，L12和LlO在酵母细胞中能够相互作用，使得酵母双杂交系统载体中的真核转录因子的DNA结合结构域和转录激活结构域在空间上也相互接近，形成完整的转录因子，从而激活宿主菌报告基因的表达。本发明人基于此建立了 L12和LlO相互作用阻断剂的体外高通量筛选模型(图I)，并利用此模型对4000个化合物进行筛选，成功发现了具有体外抗结核活性的阳性候选化合物。由此提供了下述发明本发明的ー个方面涉及ー种细胞，其表达结核杆菌核糖体蛋白L12和L10，其中，L12的编码基因与转录因子的转录激活结构域(AD)位于ー个表达载体，LlO的编码基因与转录因子的DNA结合结构域(BD)位于另ー个表达载体。所述的两个表达载体是不同的。具体地，所述载体可以是pGBKT7、pGADT7等。根据本发明任一项所述的细胞，其为酵母细胞。根据本发明任一项所述的细胞，其中，所述转录因子为GAL4。根据本发明任一项所述的细胞，其中，L12蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0:1所示，LlO蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示。MAKLSTDELLDAFKEMTLLELSDFVKKFEETFEVTAAAPVAVAAAGAAPAGAAVEAAEEQSEFDVILEAAGDKKIGVIKVVREIVSGLGLKEAKDLVDGAPKPLLEKVAKEAADEAKAKLEAAGATVTVK(SEQ ID NO 1)MARADKATAVADIAAQFKESTATLITEYRGLTVANLAELRRSLTGSATYAVAKNTLIKRAASEAGIEGLDELFVGPTAIAFVTGEPVDAAKAIKTFAKEHKALVIKGGYMDGHPLTVAEVERIADLESREVLLAKLAGAMKGNLAKAAGLFNAPASQLARLAAALQEKKACPGPDSAE(SEQ ID NO 2)根据本发明任一项所述的细胞，其中，L12蛋白的编码基因的核苷酸序列序列如SEQ ID NO :3(rplL，GeneID :888078)所示，LlO蛋白的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:4(rplJ, GeneID :888049)所示。ATGGCAAAGCTCTCCACCGACGAACTGCTGGACGCGTTCAAGGAAATGACCCTGTTGGAGCTCTCCGACTTCGTCAAGAAGTTCGAGGAGACCTTCGAGGTCACCGCCGCCGCTCCAGTCGCCGTCGCCGCCGCCGGTGCCGCCCCGGCCGGTGCCGCCGTCGAGGCTGCCGAGGAGCAGTCCGAGTTCGACGTGATCCTTGAGGCCGCCGGCGACAAGAAGATCGGCGTCATCAAGGTGGTCCGGGAGATCGTTTCCGGCCTGGGCCTCAAGGAGGCCAAGGACCTGGTCGACGGCGCGCCCAAGCCGCTGCTGGAGAAGGTCGCCAAGGAGGCCGCCGACGAGGCCAAGGCCAAGCTGGAGGCCGCCGGCGCCACCGTCACCGTCAAGTAG(SEQ ID NO 3)ATGGCCAGGGCTGACAAGGCCACCGCCGTCGCAGACATCGCAGCGCAGTTCAAGGAGTCGACCGCGACGTTGATCACCGAATACCGCGGCTTGACGGTGGCCAACCTGGCCGAGCTACGCAGGTCTCTGACGGGGTCGGCGACCTACGCGGTGGCCAAAAACACACTCATCAAGCGGGCGGCCTCCGAGGCCGGCATCGAGGGCCTCGACGAACTGTTTGTGGGCCCCACCGCGATCGCGTTCGTCACCGGTGAGCCGGTCGACGCCGCCAAGGCCATCAAGACCTTCGCCAAGGAGCACAAGGCGCTGGTCATCAAGGGCGGCTACATGGACGGCCACCCATTGACCGTGGCCGAAGTCGAGCGCATCGCCGACCTGGAGTCCCGCGAGGTGTTACTGGCCAAGCTGGCCGGTGCGATGAAGGGCAACCTGGCCAAGGCGGCCGGGTTGTTCAACGCGCCGGCCTCGCAGCTGGCCCGGCTCGCGGCCGCCCTGCAGGAAAAGAAGGCCTGCCCAGGCCCAGACTCAGCCGAGTAG(SEQ ID NO :4)根据本发明任一项所述的细胞，其中，所述细胞能够在缺陷性培养基SD/-Trp-Leu_Hi s-Ade 上生长。在本发明的一个实施方案中，所述细胞为经共转化能表达LlO和L12蛋白并且能检测此二者相互作用的酵母菌AH109 (AD-L12+BD-L10)。在本发明的一个实施方案中，所述的筛选模型中能共表达LlO和L12蛋白并且能检测这两个蛋白相互作用的重组酵母菌AH109(AD-L12+BD-L10)是通过如下方法制备 的使用酵母菌AH109、GAL4DNA结合域表达载体pGBKT7 (BD)，GAL4DNA激活域表达载体PGADT7 (AD)(均购自clontech酵母双杂交系统)。将重组质粒AD-L12+BD-L10通过LiAc方法共转化入感受态酵母菌AH109中，在缺陷性培养基SD/-Trp-Leu上培养。挑取阳性克隆进行L12和LlO相互作用的验证将阳性克隆转接到缺陷性培养基SD/-Trp-Leu-His-Ade上，能够正常生长。通过半乳糖苷酶活性检测，进ー步验证了 L12和LlO的相互作用，将此阳性克隆命名为ΑΗ109 (AD-L12+BD-L10)，可以加上筛选阴性对照ΑΗ109 (AD-T+BD-53)(购自clontech酵母双杂交系统)以及筛选空白对照AH109 —起作为高通量筛选的模型。本发明的另一方面涉及ー种用于筛选结核杆菌L12蛋白和LlO蛋白相互作用阻断齐U、抗结核杆菌药物、或者治疗和/或预防结核病的药物的细胞模型，其包含本发明中任一项所述的细胞。根据本发明任一项所述的细胞模型，其还包含空白对照细胞和/或阴性对照细胞；优选地，所述空白对照细胞为不转染有任何载体的空白酵母细胞，所述阴性对照细胞为染有两个不同的表达载体(可以与本发明的细胞中的两个表达载体相同)的酵母细胞，两个表达载体中各插入有不同的基因，该两个不同的基因表达的蛋白能够相互結合，并且表达的蛋白不是L12和LlO ;更优选地，所述细胞模型包含AH109(AD-L12+BD-L10)、AH109 (AD-T+BD-53)(阴性对照)以及AH109 (空白对照)。本发明的还一方面涉及本发明中任一项所述的细胞或者细胞模型在筛选结核杆菌L12蛋白和LlO蛋白相互作用阻断剂、抗结核杆菌药物、或者治疗和/或预防结核病的药物中，或者測定抗结核杆菌活性中的用途。本发明的还一方面涉及ー种筛选结核杆菌L12蛋白和LlO蛋白相互作用阻断剂、抗结核杆菌药物、或者治疗和/或预防结核病的药物的方法，一种或者測定抗结核杆菌活性的方法，包括下述步骤I)将本发明的任一项所述的细胞或者细胞模型接种并进行培养；2)分别向步骤I)中培养的细胞中加入待测化合物或组合物，使化合物或组合物的终浓度为 ο μ g/m，继续进行培养12-36小时；3)观察细胞的生长情况，找出对模型细胞具有抑制作用的化合物或组合物，得到初筛阳性的化合物或组合物。具体地，当加入的化合物或组合物后，通过与不加入待测化合物或者组合物的对照组的生长情况相比较，可将化合物的作用分为三类(图2):特异性阻断作用只有本发明的细胞例如生长受到抑制；非特异性阻断作用只有本发明的细胞和阴性对照受到抑制；潜在的抗真菌作用本发明的细胞、阴性对照、空白对照都受到抑制。阴性对照、空白対照的定义如前面所描述。在ー个具体的实施方案中，本发明的细胞为AH109(AD-L12+BD_L10)，阴性对照为AH109 (AD-T+BD-53)，空白对照为 AH109。根据本发明的任一项所述的方法，其还包括下述步骤 4)将初筛阳性的化合物或组合物进行β -半乳糖苷酶活性抑制检测。在本发明的一个实施方案中，所述方法包括下述步骤I)收集对数生长期的细胞 ΑΗ109 (AD-L12+BD-L10)、ΑΗ109 (AD-T+BD-53)以及ΑΗ109，用缺陷性培养基 SD/-Trp-Leu-His-Ade 将筛选模型 AH109 (AD-L12+BD-L10)、筛选阴性对照AH109(AD-T+BD-53)以I : 100转接入96孔板，用培养基YH)将筛选空白对照AH109同样以I : 100接种至96孔板。每孔加入细胞培养液198 μ I ;2)将筛选模型 ΑΗ109 (AD-L12+BD-L10)、筛选阴性对照 ΑΗ109 (AD-T+BD-53)、筛选空白对照ΑΗ109孔中，加入2 μ I (lmg/ml)化合物或组合物，使化合物或组合物的终浓度为lOyg/m。同时设立对照组，每孔中含有198μ I细胞培养液，加入2μ I相应的培养基。将96孔板放入30°C培养箱中培养；3)24h后，取出96孔板观察每孔中细胞的生长情况；4)将初筛阳性的化合物或组合物，做β_半乳糖苷酶活性抑制检测。将筛选模型ΑΗ109 (AD-L12+BD-L10)、筛选阴性对照ΑΗ109 (AD-T+BD-53)在缺陷性培养基SD/-Trp-Leu-His-Ade中30°C过夜培养至对数生长期。之后，将50 μ I过夜培养细胞以I 100比例转接至5ml缺陷性培养基SD/-Leu/-Trp中，同时，加入相应浓度(终浓度为50、10、5、1、0. 5、0. lyg/ml)的化合物，继续培养。24h后收集细胞，做β -半乳糖苷酶活性定量检测。本发明的还一方面涉及式I或式II所示的化合物或其药学上可接受的盐在制备结核杆菌L12蛋白和LlO蛋白相互作用阻断剂、抗结核杆菌药物、或者治疗和/或预防结核病的药物中的用途。
丫々 H0J U \OH hYoh
NH2
式 I (T766 )式 II (T054 )本发明的还一方面涉及ー种抑制结核杆菌的方法，包括使用有效量的式I或式II化合物或其药学上可接受的盐的步骤。本发明的还一方面涉及ー种治疗或预防结核病发方法，包括给予有效量的式I或式II化合物或其药学上可接受的盐的步骤。在本发明中，L12和LlO的相互作用是指L12的N端与LlO的C端能够结合。术语“DNA结合结构域”是指DNA特异性结合功能域。GAL4的DNA结合结构域靠近羧基端，含有至少ー个锌指结构，可激活酵母半乳糖苷酶的上游激活位点(UAS)。术语“转录激活结构域”是指与其他调控蛋白相互作用的激活功能域。GAL4的转录激活结构域可与RNA聚合酶或转录因子TFIID相互作用，提高RNA聚合酶的活性。发明的有益效果
本发明的细胞或者细胞模型能够有效地用于筛选结核杆菌L12蛋白和LlO蛋白相互作用阻断剂、抗结核杆菌药物、或者治疗和/或预防结核病的药物，并且省去了相互作用蛋白的纯化，筛选过程简单、经济，适合于高通量筛选。


图I :模型筛选策略示意图。图2 :用筛选模型筛选化合物的結果。其中，+指的是加入待测化合物，-指的是没有加入待测化合物图3 rplL(L12的编码基因)、rplj (L10的编码基因)基因的PCR扩增結果。其中，泳道I :rplL的PCR产物；泳道2 rplL的空白对照；泳道3，rplj的PCR产物；泳道4，rplj的空白对照,泳道Μ,分子量marker。图4 :从左至右依次是 AD-L12，BD-LlO, AD-LlO, BD-L12 质粒的 NdeI，BamHI 双酶切結果。泳道I :AD-L12的双酶切；泳道2 =AD-LlO的双酶切；泳道3 BD-L12的双酶切；泳道4 =BD-LlO的双酶切；泳道M为分子量marker。图5 :筛选模型酵母菌 AH109 (AD-L12+BD-L10)，筛选阳性对照 AH109 (AD-T+BD-53)以及酵母双杂交假阴性菌AH109 (AD-L10+BD-L12)，酵母双杂交自激活检测AH109 (AD+BD-L10)、AH109 (AD-L12+BD)，酵母双杂交阴性对照 AH109 (AD-T+BD-53)在缺陷性培养基SD/-Trp-Leu-His-Ade上的生长情況。图中A代表AD-T+BD-53 ;B代表AD-L12+BD-L10 ；C 代表 AD-L10+BD-L12 ；D 代表 AD-L12+BD ；E 代表 AD+BD-L10 ；F 代表AD_T+BD_lam。图6 :筛选模型酵母菌 AH109 (AD-L12+BD-L10)，筛选阳性对照 AH109 (AD-T+BD-53)以及酵母双杂交假阴性菌AH109 (AD-L10+BD-L12)，酵母双杂交自激活检测AH109 (AD+BD-L10)、AH109 (AD-L12+BD)，酵母双杂交阴性对照 AH109 (AD-T+BD-53)的 β -半乳糖苷酶活性定性检测。图7 :筛选模型酵母菌 ΑΗ109 (AD-L12+BD-L10)，筛选阳性对照 ΑΗ109 (AD-T+BD-53)以及酵母双杂交假阴性菌ΑΗ109 (AD-L10+BD-L12)，酵母双杂交自激活检测ΑΗ109 (AD+BD-L10)、AH109 (AD-L12+BD)，酵母双杂交阴性对照 ΑΗ109 (AD-T+BD-53)的 β -半乳糖苷酶活性定量检测。图8 :阳性化合物Τ766和Τ054的β -半乳糖苷酶活性抑制检测。图8Α，Τ766 ;图8Β, Τ054。
图9 :蛋白His-LlO及His_L12的表达及纯化。His-LlO的SDS-PAGE检测以及Western blotting分析。图 9A, His-LlO 的 SDS-PAGE检测以及Western blotting分析,其中泳道M,marker ;泳道I,经诱导的pET_16b(+)全菌蛋白上清；泳道2,经诱导的pET16b_L10全菌蛋白上清；泳道3，纯化的His-LlO蛋白。图9B，His-L12的SDS-PAGE检测以及Westernblotting分析,其中泳道M, marker ;泳道I,经诱导的pET_16b (+)全菌蛋白上清；泳道2,经诱导的pET16b-L12全菌蛋白上清；泳道3，纯化的His_L12蛋白。图10:图10A，蛋白His_L12与His-LlO相互作用的Biacore检测結果；图10B，蛋白His-L12与化合物T766相互作用的Biacore检测结果(从上往下每条曲线以此对应于加入如下的化合物T766的量情形40μΜ、20μΜ、10μΜ、5μΜ、2· 5μΜ、0μΜ);图10C，蛋白His-L12与化合物T054相互作用的Biacore检测结果(从上往下每条曲线以此对应于加入如下的化合物T054的量情形:40μΜ、20μΜ、10μΜ、5μΜ、2· 5μΜ、0μΜ);图10D，化合 物Τ766和Τ054对蛋白His-L12与His-LlO相互作用的阻断。图IOA-D中，纵坐标中的RU (response unit)表示反应单位，I个RU相当于I个反应单位。
具体实施例方式下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。实施例I :酵母双杂交系统的构建l.rplL (L12编码基因)、rplj (L10编码基因)基因的制备以结核杆菌H37Rv总cDNA (本室保存；也可商购菌株然后用本领域人员熟知的方法例如cDNA提取试剂盒制备得到结核杆菌H37Rv总cDNA)为模板，设计引物I和2，引物3和4，使用TaKaRa公司的高保真PrimeSTAR HS DNA聚合酶，通过PCR方法得到rplL (L12的编码基因)、rplj (L10的编码基因)。具体克隆方法及引物如下I)扩增rplL(L12的编码基因)的引物引物I 5，-TCCATATGGCAAAGCTCTCCACCGACG-3，(SEQ ID NO 5)(下划线部分为 NdeI酶切位点)引物2 :5’ -GCGGATCCACACGCTGGGCAGAGCTAC-3’ (SEQ ID NO :6)(下划线部分为BamH I酶切位点)2)扩增rplj (L10的编码基因)的引物引物3 :5’ -TCCATATGGCCAGGGCTGACAAG-3’ (SEQ ID NO :7)(下划线部分为 Nde I酶切位点)引物4 :5’ -GCGGATCCTGGGTGACTACTCGG-3，(SEQ ID NO 8)(下划线部分为 BamH I酶切位点)PCR方法按照TaKaRa公司的高保真PrimeSTAR HS DNA聚合酶的说明书推荐的步骤进行。将一部分PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳验证，电泳结果如图3所示，大小与预期ー致。PCR产物回收后，与pEASY-Blunt simple载体连接后测序鉴定，测序结果正确。2.重组表达载体的构建
上述各片段经酶切后，回收酶切产物。BD、AD载体经Nde I,BamHI双酶切后，回收线性载体，并分别与rplL(L12的编码基因)、rplJ(L10的编码基因)各片段连接，成功构建表达载体AD-L12，BD-LlO, AD-LlO, BD-Ll2, Nde I，BamH I的酶切鉴定(琼脂糖凝胶电泳)结果见图4，大小与预期一致。其中酶切体系如下
质粒4.0 μ
Nde I1.0 μ
Ban/λ I1.0 μ
IOx Buffer2.0 μ
ddH2012.0 μ
总体积20.0 μ 。连接体系如下
基因片断7.0 μ
表达载体1.0 μ
IOxBuffer1.0 μ
Τ4连接酶1.0 μ
CldH2O1.0 μ
总体积10.0 μ103.酵母感受态细胞的制备I)将6ml酵母培养液在室温下5，OOOg离心5min。2)弃上清，用I. 5ml超纯水浮起洗涤，室温6，OOOg离心5min。3)弃上清，沉淀溶于20 μ I 10ΧΤΕ、20μ1 I X LiAc、160 μ I超纯水吹起弹起，SP为酵母感受态细胞(Ih内用完)。4.共转化在I. 5ml离心管中加入O. I μ g上面构建的AD质粒DNA和O. I μ gBD质粒DNA、以及100 μ g鲑精DNA(鲑精DNA使用前用沸水煮20min后快速置于冰浴)，混匀，加入O. Iml酵母感受态细胞，混匀，再加入0.6ml灭菌的PEG/LiAc溶液(体积比10XTE IOXLiAc 50%PEG4000 = I I 8)，高速振荡 IOs 以混匀，之后，30°C，200rpm 培养 30min，42°C 热激 15min，再置于冰上冷却l-2min，14，OOOrpm室温离心5s，去上清。沉淀用200 μ I灭菌水重悬后涂布在SD/-Leu-Trp (DO/-Trp_Leu O. 64g，YNB 6. 7g,葡萄糖20g，加超纯水定容至1000ml，112°C灭菌20min。固体培养基含Difco Agar20g/L。)平板上，30°C倒置培养。把在 SD/-Leu-Trp 平板上生长的阳性克隆接种在 SD/-Leu-Trp-His_Ade (D0/-Trp-Leu_His-AdeO. 6g, YNB 6. 7g,葡萄糖20g,加超纯水定容至1000ml, 112°C灭菌20min。固体培养基含Difco Agar 20g /L。)上，如果在SD/-Leu-Trp-His_Ade平板上酵母菌能够生长，则说明L12和LlO蛋白有相互作用(图5)。5. β -半乳糖苷酶活性检测I) β -半乳糖苷酶活性定性检测将在SD/-Leu-Trp-His-Ade上生长的酵母菌落用无菌牙签挑到一张干净的滤纸上，菌落面朝上，置于液氮中10s，室温解冻后，将滤纸放入事先浸泡于Z buffer/X-gal溶液中的另ー张干净的滤纸上，30°C孵育，观察菌落是否出现蓝色，以8h之内出现蓝色为阳性，没有颜色变化的为阴性(图6)。由图6可见，AD-L10+BD-L12的菌落没有变蓝色(因此不能够作为本发明的细胞模型)，只有AD-L12+BD-L10的菌落变蓝。2) β -半乳糖苷酶活性定量检测a)收集在液体培养基SD/-Leu-Trp-His-Ade中生长的酵母菌，漩涡混匀测量0D_值。b)将姆一管菌液转移至3个I. 5ml的EP管中，14，OOOrpm离心30s。弃去上清，在每个 EP 管中加入 1.5ml Z buffer (O. IM Na2HPO4, 35mM NaH2PO4, IOmM KCl，and ImM MgSO4,pH 7.0),重悬细胞。再次14，OOOrpm离心30s,弃去上清。用300 μ I Z buffer重悬细胞。c)将O. Iml细胞悬液重新置于另ー个干净的EP管中。并将此EP管放入液氮
O.5-lmin，之后37°C水浴O. 5-lmin。反复冻融2次以上，确保细胞完全裂解。用100 μ I Zbuffer设置一空白对照。d)在每ー个EP管中(包括空白对照)加入O. 7ml Z buffer(含有O. 27%的β-巯
基こ醇)Oe)迅速加入160 μ I ONPG(用Z buffer溶解,4mg/ml)至姆个EP管中，并将EP管放入30°C。开始计吋。当EP管中出现黄色后，在每管中加入0.4ml IM Na2CO3，終止反应。记录所用的时间t。f)将EP管中的液体14，OOOrpm离心lOmin，之后，将上清转移至干净的比色皿中(不要吸入沉淀，以免影响比色)，测量OD42tl(与空白对照管相对比)。OD42tl应在O. 02-1. O之间。g)计算β -半乳糖苷酶活性。β-gal units = 1000 X OD420/ (t X VX OD600) V = O. Iml X 5h)如图7为AH109 (AD-L12+BD-L10)的β -半乳糖苷酶活性定量检测。实施例2 :初筛阳件化合物的β -半乳糖苷酶活件抑制检测I.将筛选模型 ΑΗ109 (AD-L12+BD-L10)、筛选阴性对照 ΑΗ109 (AD-T+BD-53)在缺陷性培养基SD/-Trp-Leu-His-Ade中30°C过夜培养至对数生长期。2.将50 μ I过夜培养细胞以I : 100比例转接至5ml缺陷性培养基SD/-Leu/_Trp中，同时，加入相应浓度(终浓度为50、10、5、1、0·5、0· lyg/ml)的化合物，继续培养。3. 24h后收集细胞，做β -半乳糖苷酶活性定量检测。方法參照实施例I中所述。求得 β _gal units。4.将没有加阳性化合物的筛选模型AH109 (AD-L12+BD-L10)、筛选阴性对照AH109 (AD-T+BD-53)求得的β-gal units (O)值作为100%，加入不同浓度化合物的筛选模型 AH109(AD-L12+BD-L10)、筛选阴性对照 AH109(AD-T+BD-53)求得的 β -gal units (50,
10、5、1、0· 5、0· I)值分别与 β-gal units (O)相除，得到 β-gal units% (50、10、5、1、0· 5、
O.I)，进行统计学分析。其中筛选的化合物为4000种(本实验室的化合物库，也可以使用商购的化合物库或者任何待测的样品，例如化合物或组合物)。初筛阳性化合物Τ766和Τ054的结构式分别如下面的式I和式II所示
权利要求
1.一种细胞，其表达结核杆菌核糖体蛋白L12和L10，其中，L12的编码基因与转录因子的转录激活结构域位于ー个表达载体，LlO的编码基因与转录因子的DNA结合结构域位于另ー个表达载体。
2.根据权利要求I所述的细胞，其满足如下的(1)-(3)中的一项或者多项 (1)所述细胞为酵母细胞； (2)所述转录因子为GAL4； (3)L12蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO :1所示，LlO蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
3.根据权利要求I所述的细胞，其中，L12蛋白的编码基因的核苷酸序列序列如SEQIDNO 3所示，LlO蛋白的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO 4所示。
4.根据权利要求I所述的细胞，其中，所述细胞能够在缺陷性培养基SD/-Trp-Leu_Hi s-Ade 上生长。
5.一种用于筛选结核杆菌L12蛋白和LlO蛋白相互作用阻断剂、抗结核杆菌药物、或者治疗和/或预防结核病的药物的细胞模型，其包含权利要求1-4中任一项所述的细胞。
6.根据权利要求5所述的细胞模型，其还包含空白对照细胞和/或阴性对照细胞；优选地，所述空白对照细胞为不转染有任何载体的空白酵母细胞，所述阴性对照细胞为染有两个不同的表达载体的酵母细胞，两个表达载体中各插入有不同的基因，该两个不同的基因表达的蛋白能够相互結合，并且表达的蛋白不是L12和LlO ;更优选地，所述细胞模型包含 AHlO9 (AD-L12+BD-L10)、AH109 (AD-T+BD-53)以及 AH109。
7.权利要求1-4中任一项所述的细胞或者权利要求5或6所述的细胞模型在筛选结核杆菌L12蛋白和LlO蛋白相互作用阻断剂、抗结核杆菌药物、或者治疗和/或预防结核病的药物中，或者測定抗结核杆菌活性中的用途。
8.ー种筛选结核杆菌L12蛋白和LlO蛋白相互作用阻断剂、抗结核杆菌药物、或者治疗和/或预防结核病的药物的方法，或者測定抗结核杆菌活性的方法，包括下述步骤 1)将权利要求1-4中任一项所述的细胞或者权利要求5或6所述的细胞模型接种并进行培养； 2)分别向步骤I)中培养的细胞中加入待测化合物或组合物，使化合物或组合物的终浓度为10 μ g/m,继续进行培养12-36小时； 3)观察细胞的生长情况，找出对模型细胞具有抑制作用的化合物或组合物，得到初筛阳性的化合物或组合物； 可选地，还包括下述步骤 4)将初筛阳性的化合物或组合物进行β_半乳糖苷酶活性抑制检测。
9.式I或式II所示的化合物或其药学上可接受的盐在制备结核杆菌L12蛋白和LlO蛋白相互作用阻断剂、抗结核杆菌药物、或者治疗和/或预防结核病的药物中的用途。
10.ー种抑制结核杆菌的方法，包括使用有效量的式I或式II化合物或其药学上可接受的盐的步骤。
全文摘要
本发明属于生物学和药学领域，涉及筛选结核杆菌抑制剂的细胞模型及筛选方法。具体地，本发明涉及一种细胞，其表达结核杆菌的L12蛋白和L10蛋白，其中，L12的编码基因与转录因子的转录激活结构域位于一个表达载体，L10的编码基因与转录因子的DNA结合结构域位于另一个表达载体。本发明还涉及式I或式II所示的化合物在制备结核杆菌L12蛋白和L10蛋白相互作用阻断剂、抗结核杆菌药物、或者治疗和/或预防结核病的药物中的用途。本发明的细胞模型能够有效地用于抗结核杆菌药物的筛选。
文档编号A61K31/5415GK102719368SQ20111007978
公开日2012年10月10日 申请日期2011年3月31日 优先权日2011年3月31日
发明者司书毅, 李妍, 林媛, 洪斌, 王彦昶, 肖春玲, 蒋建东, 高娜娜 申请人:中国医学科学院医药生物技术研究所