专利名称：山芝麻提取物在制备抗乙型肝炎药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及中药山芝麻提取物的用途，具体地说是以山芝麻水提取物、醇提取物、 三萜类化合物为原料在制备抗乙型肝炎药物中的应用。
背景技术：
乙型肝炎是感染乙型肝炎病毒Ofepatitis B Virus,HBV)引起的一种常见传染病和多发病，易转化为慢性，甚至发展为肝硬化、肝癌。该病发病的复杂性及转变为慢性的难治性，尤其是发展至肝癌的严重性，使其成为当前医学界，尤其是我国医务人员广泛关注的焦点之一。目前研究表明，乙型肝炎的发病主要与免疫力低下、病毒持续感染以及进行性肝细胞损伤有关，而某些中药提取物可三方面并重，从而提高了疗效。我国中草药资源丰富， 在防治乙型肝炎方面积累了大量的经验，加之中草药不良反应小，价格便宜，因而从传统中药和天然药物资源中寻找有效的抗乙型肝炎病毒药物是一个行之有效的途径。山芝麻系梧桐科植物山芝麻(Helicteres angustifolia L.)的根，能清热解毒， 主要用于感冒发热、肺热咳嗽、咽喉肿痛、麻疹等。至今，对山芝麻公开报道的研究主要集中在其化学成分的分离、鉴定方面，其药效学研究很少，抗乙型肝炎的研究则未见报道。我们首次对山芝麻提取物(水提取物、醇提取物、三萜类化合物)在治疗乙型肝炎方面进行了系列的实验研究，发现其提取物具有良好的抗乙肝病毒的作用，疗效稳定，停药后没有出现反跳现象，且毒副作用小，具有非常好的研发前景。
发明内容
本发明的目的是提供中药山芝麻提取物(水提取物、醇提取物、三萜类化合物)在制备抗乙型肝炎药物中的应用，其中山芝麻水提取物和醇提取物是分别用水和75%乙醇按常规法提取得到的物质，而山芝麻三萜类化合物则是依次用乙醇提取、AB-8大孔树脂柱分离得到的三萜类化学物质的混合物，即总三萜类。本发明是基于发明人的实验研究而完成的。研究分两大部分一、山芝麻提取物的制备1、山芝麻水提取物的制备山芝麻药材饮片，加10倍量水提取2次，每次1.证，合并提取液，60°C减压恒温干燥即得山芝麻水提取物。2、山芝麻醇提取物的制备山芝麻药材饮片，加10倍量75%乙醇浸泡30min，第1次回流提取2h，回收乙醇； 接着再用8倍量75%乙醇回流提取1. 5h，回收乙醇，合并两次提取液，60°C减压恒温干燥即得山芝麻乙醇提取物。3、山芝麻三萜类化合物的制备山芝麻药材，用乙醇回流提取，上AB-8大孔树脂柱分离，最后60°C减压恒温干燥即得山芝麻三萜类化合物，以齐墩果酸为对照品，以5%香草醛-冰醋酸和高氯酸为显色剂，采用分光光度法在550nm测定样品的吸光度，测得山芝麻三萜类化合物纯度为79. 8% (三萜类化合物含量测定方法参考文献陆震鸣，陶文沂，许泓瑜，等.樟芝菌粉三萜类化合物含量的测定，中成药[J]，2008，30 (3) :402-405)。二、山芝麻提取物治疗乙型肝炎的实验研究1、动物体内实验山芝麻提取物对乙型肝炎病毒的抑制作用采用健康成年的广西麻鸭产的蛋孵化的1日龄雏鸭，经腹腔注射DHBV-DNA强阳性病毒血清建立麻鸭乙肝动物模型，分别给予山芝麻水提取物、醇提取物和三萜类进行治疗14天，并于用药前第0天(Od)、用药第7天(7d)、用药第14天(14d)、停药第7天(P7)， 分别从胫静脉采血，分离血清，采用FQ-PCR法、ELISA法、生化指标试剂盒法分别检测血清 DHBV-DNA、DHBsAg和肝功能生化指标(包括清谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)和超氧化物歧化酶(SOD)的含量)。此外，于停药第7天(P7)，分别剖杀各组试验动物，各取小块肝组织固定于10%甲醛溶液，石蜡切片，用HE染色，病理检查。实验结果发现，山芝麻水提物、醇提物和三萜类能明显降低鸭血清乙型肝炎病毒 DHBV-DNA水平、乙肝血清标志物DHBsAg含量和ALT/AST的含量，显著提高血清SOD的活性， 3种提取物作用程度均与用药剂量及用药时间呈正相关，并且停药后没有出现反跳现象。病理检查显示一定剂量的山芝麻提取物(水提物、醇提物和三萜类)可改善病变的肝脏组织。 拉米夫定阳性对照药治疗，在治疗过程中可明显抑制乙肝病毒量，但停药后即显著回升，病毒含量变化总体表现为用药时持续下降、停药即出现反跳的规律。山芝麻提取物(水提物、 醇提物和三萜类)与拉米夫定比较，总体上看起效比较慢，但其抑制病毒的作用平稳而持久且没反跳现象，提示山芝麻提取物抑制体内乙肝病毒的机制不同于拉米夫定，在长期服药用于治疗慢性乙型肝炎方面具有明显的优势。2、体外细胞实验山芝麻提取物对乙肝病毒的抑制作用采用H印G2.2. 15细胞模型，运用荧光定量PCR法、ELISA法，检测山芝麻提取物 (水提物、醇提物和三萜类)对乙肝病毒DNA、HBSAg/HBeiVg的抑制作用。结果表明，山芝麻提取物对HBV DNA、HBsAg/HBeAg具有显著的抑制作用，并且随着药物浓度和作用时间的增加，其抑制作用逐渐增强，呈现一个明显的量效和时效反应关系。体外实验的结果与动物实验的结果基本相符，都说明了山芝麻提取物具有明显的抑制乙肝病毒的作用。3、提高机体免疫实验观察山芝麻提取物对免疫性肝损伤的保护作用静脉注射刀豆蛋白A(Con Α)造成小鼠免疫性肝损伤，采用流式细胞术测定给予山芝麻提取物治疗后全血中⑶广、CD4+、细胞亚群比率。结果显示，山芝麻提取物(水提物、醇提物和三萜类)各剂量组外周血OT3+和细胞百分率及OT4VtD8+比值明显高于模型组(ρ < ο. 05或ρ < ο. 01)，而细胞百分率明显低于模型组。提示，一定剂量的山芝麻提取物(水提物、醇提物和三萜类)能提高外周血τ淋巴细胞亚群(⑶3+、CD4+和⑶// CD8+)的比率，减少其向肝脏的浸润，从而减小其细胞毒性作用对肝细胞的损伤。总之，本发明首次对山芝麻提取物(水提物、醇提物和三萜类化合物)进行了抗乙型肝炎的研究，体外和体内实验表明，山芝麻提取物可明显抑制乙肝病毒，减轻乙肝炎症， 缓解肝脏组织细胞损伤，且作用稳定持久，没有反跳现象，优于目前临床常用的西药拉米夫定，对防治乙肝具有独特优势。山芝麻提取物用于治疗乙肝具有非常好的研发前景。可用于生产片剂、颗粒剂、合剂等剂型的治疗乙肝的中药制剂。
具体实施例方式实验例一、山芝麻提取物的制备1、山芝麻水提取物的制备山芝麻药材饮片1000g，W 10升水提取2次，每次1.证，合并提取液，60°C减压恒温干燥得268. 9g山芝麻水提取物。2、山芝麻醇提取物的制备山芝麻药材饮片1000g，W 10升75%乙醇浸泡30min，第1次回流提取2h，回收乙醇；接着再用8升75%乙醇回流提取1. 5h，回收乙醇，合并两次提取液，60°C减压恒温干燥即得山芝麻乙醇提取物113. 5g。3、山芝麻三萜类化合物的制备山芝麻lOOOg，加60 %乙醇浸lh，回流提取，第1次8000ml提浊，第2次8000ml 提1. ，合并提取液，减压回收乙醇至无乙醇味，将浓缩物加蒸馏水溶解过滤。将滤液上 (40mmX800mm) AB-8大孔树脂柱，用2倍量的蒸馏水洗涤树脂柱，再用2倍量80%乙醇洗脱，流脱流速为50-60滴/min (约2_2. 5ml/min)。收集乙醇洗脱液，减压回收乙醇，在60°C 的减压恒温干燥箱中浓缩、干燥，得16. 326g山芝麻三萜类化合物。树脂柱用3倍量的甲醇再生。以齐墩果酸为对照品，以5%香草醛-冰醋酸和高氯酸为显色剂，采用分光光度法在550nm测定样品的吸光度，测得山芝麻三萜类化合物纯度为79. 8% (三萜类化合物含量测定方法参考文献陆震鸣，陶文沂，许泓瑜，等.樟芝菌粉三萜类化合物含量的测定，中成药[J]，2008，30 (3) :402-405)。 二、山芝麻提取物治疗乙型肝炎的实验研究1、动物体内实验山芝麻提取物对乙型肝炎病毒的抑制作用实验方案(1)广西麻鸭乙肝动物模型的建立采用健康成年的广西麻鸭产的蛋孵化的1日龄雏鸭，经腹腔注射O.aiil DHBV-DNA强阳性病毒血清。接种7d后，分别从胫静脉采血约 0. 2-0. 3ml左右，装入一次性EppendofT管中，整个过程注意不要交叉污染。4000rpm离心 5min，取血清。-20°C保存备用。采用PCR法检测筛选出感染阳性鸭。(2)实验分组及用药经PCR法检测筛选出感染阳性鸭，饲养至13日龄作为实验动物进行药物治疗试验。将80只鸭随机分为8组，每组10只。①模型组等量的生理盐水；②拉米夫定组灌胃给予拉米夫定50X 10_3g. kg"1. Cf1 ；③山芝麻水提取物高剂量组 2. 689g. kg—1. Cf1 ；④山芝麻水提取物低剂量组1. 345g. kg—1, cf1 ；⑤山芝麻乙醇提取物高剂量组1. 135g. kg-1· cf1 ；⑥山芝麻乙醇提取物低剂量组:0. 568g. kg-1· cf1 ；⑦三萜类高剂量组0. 163g. kg—1· cf1 ；⑧三萜类低剂量组:0. 081g. kg—1· cf1。各组每天早上8-9点钟左右灌胃给药，1天1次，连续14d，实验期间动物自由取食和饮水。并于用药前0d、用药7d、用药 14d、停药7d(P7)时，分别从胫静脉采血，每只0. 5ml左右，分离血清，于_20°C保存备用。(3) FQ-PCR检测血清DHBV-DNA ①DHBV-DNA提取采用直接加热法。每次取血清 100 μ 1，沸水浴 IOmin, IOOOOrpm 离心 5min。②加样:2XSYBR PremixEx Taq 12. 5μ 1 ；ΙΟμΜ上游引物Ι.Ομ 1 ；ΙΟμΜ下游引物1. O μ 1 ；加无菌双蒸水至23μ 1 ；血清提取物 2.0μ 1。③FQ-PCR反应条件95°C变性10s，55°C退火20s，72°C延伸30s，共反应45个循环。④FQ-PCR的结果判读扩增过程及数据的储存和分析均由仪器及自带的软件自动完成。(4)血清DHBsAg值检测采用ELISA快速法、酶标仪(美国Bio-Rad公司， Model450) 490nm 读取 0. D 值。(5)肝功能生化指标测定各组血清，用全自动分析生化仪测各组鸭血清谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)和超氧化物歧化酶(SOD)的含量。(6)各组肝脏病理(HE染色)检测于停药7d分别剖杀各组试验动物，各取小块肝组织固定于10%甲醛溶液，石蜡切片，用HE染色，病理检查。实验结果(1)对乙肝病毒的的抑制作用与模型组比较，山芝麻水提物、醇提物和三萜类各剂量组在给药7d、14d和停药7d 鸭血清DHBV-DNA拷贝数均有明显降低(P < 0. 05或P < 0. 01)，下降程度与用药剂量及用药时间相关，并且停药后没有出现反跳现象，仍能维持在较低水平(P < 0. 05)。拉米夫定组用药后，血清DHBV-DNA拷贝数开始明显下降，第14d下降到最低值，停药7d后DHBV-DNA拷贝数即显著回升，病毒含量变化总体表现为用药时持续下降、停药即出现反跳的规律。山芝麻提取物(水提物、醇提物和三萜类)组与拉米夫定组比较，总体上看起效比较慢，但其抑制病毒复制的作用平稳而持久，提示山芝麻提取物抑制体内乙肝病毒复制的机制不同于拉米夫定，在长期服药用于治疗慢性乙型肝炎方面具有明显的优势。实验结果见表1。表1治疗前后鸭血清DHBV-DNA水平比较(7± S x 1 O8, η = 10Copy/ml)
刹量DHBV-DNA
(g-kg'-d"')T0T7T丨4P7模型对照2.51±1.092.83 士 1.042.76 士 0.982.51 ±0.87拉米夫定50x10°2.73±1·.351.16 士 0.81"δδ0.67 士 0.32*,'ΔΔ1.72±0.83水提取物低剂量1.3452.35±].151.77±0.98"·1.26±0.83*'"Δ1.56±0.75*水提取物高剂量2.6892.59 士 1.201.59±0.7Γδ1.05±0.88""仏厶1.23±0.84*"'ΔΔ醇提取物低剂量0.5682.69±1.081.83 土 0.86*1.43 士 0.78*' ΔΔ1.60±0.65*'Λ醇提取物高剂量1.1352.56±1.11*蚌Λ 1.37士0.84 Δ1.12±0.53*'ΔΔ1.31±0.77" ΔΔ三萜类低剂量0.0812.46 士 1.131.80±0.92*1.41±0.87*'"Δ].69±0.89三萜类高剂量0.1632.62 士 1.181.62 士 0.83-δ1.23 土 0.85*' ΔΔ1.38±0.86*'"ΔΔ注与模型组比较:*P< 0. 05，**P < 0. 01 ；与用药前比较:Δρ < 0. 05，ΔΔρ < 0. 01(3)对血清DHBsAg的抑制作用
模型组在整个实验过程中血清DHBsAg OD值基本稳定，拉米夫定组用药7_14d血清DHBsAg OD值持续降低(P<0.01)，至停药7d后出现回升现象。山芝麻提取物(水提物、醇提物和三萜类)组从用药7d开始血清DHBsAg OD值显有著降低(P < 0. 05或P < 0. 01)；停药后，山芝麻提取物组DHBsAg OD值与给药前比较，仍有显著性差异(P < 0. 05 或P < 0. 01)。实验结果提示，山芝麻提取物能明显降低乙型肝炎的血清标志物HBsAg，进一步证实了山芝麻提取物具有明显的抑制乙型肝炎病毒的作用。结果见表2。表2治疗前后鸭血清DHBsAg OD值的变化情况(^ts, η = 10)
剂量DHBsAg OD值
祖力丨J/g-kg1T0T7T14P7模型对照组0.85±0.210.82 士 0.190.87±0.130.86 士 0.17拉米夫定组50 χ IO"30.87±0.240.62±0.11*δ0.42 土 0.15**δδ0.78 士 0.12水提取物低剂量1.3450.88±0.260.71 士 0.140.67±0.12*λ0.70±0.13*水提取物高剂量2.6890.86±0.190.61 士 0.18*δδ0.43±0.12**δδ0.51±0.10**λδ醇提取物低剂量0.5680.84±0.150.80±0.160.71±0.13*0.73±0.11醇提取物高剂量1.1350.89±0.180.70 士 0.1 4δ0.56 士 0.13**δδ0.62±0,11**λδ三萜类低剂量0.0810.87±0.200.68±0.150.60 土 0.10**ΔΔ0.66±0.12**δδ三萜类高剂量0.1630.85±0.140.58±0.11**δδ0.40±0.10**δλ0.47±0.09**αδ注与模型组比较:*Ρ< 0. 05，**Ρ < 0. 01 ；与用药前比较:ΔΡ < 0. 05，ΔΔρ < 0. 01(4)对肝脏炎症的抑制作用与模型组比较，山芝麻提取物(水提物、醇提物和三萜类)组、拉米夫定组用药后 7d-14d，血清ALT、AST的含量均明显降低、而SOD活性明显升高(P < 0. 05或P < 0. 01)； 停药后7d,山芝麻提取物高剂量组ALT、AST仍能维持在较低水平(P < 0. 05)，而拉米夫定组ALT、AST则出现明显反跳现象。实验结果提示，山芝麻提取物能抑制乙型肝炎引起的炎症，对损伤的肝细胞具有明显的保护作用。结果见表3-表5。表3治疗前后鸭血清ALT水平变化情况(J土, η = 10)
权利要求
1.山芝麻水提取物在制备治疗乙型肝炎药物中的应用。
2.山芝麻醇提取物在制备治疗乙型肝炎药物中的应用。
3.山芝麻三萜类化合物在制备治疗乙型肝炎药物中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种中药山芝麻提取物在制备抗乙型肝炎的药物中的应用。本发明首次对山芝麻提取物包括水提物、醇提物和三萜类化合物进行了抗乙型肝炎的研究，体外和体内实验表明，山芝麻提取物可明显抑制乙肝病毒，减轻乙肝炎症，缓解肝脏组织细胞损伤，且作用稳定持久，没有反跳现象，优于目前临床常用的西药拉米夫定，对防治乙肝具有独特优势。山芝麻提取物用于治疗乙肝具有非常好的研发前景。可用于生产片剂、颗粒剂、合剂等剂型的治疗乙肝的中药制剂。
文档编号A61P31/20GK102188461SQ20111010215
公开日2011年9月21日 申请日期2011年4月22日 优先权日2011年4月22日
发明者何敏, 廖明, 张士军, 林兴, 黄仁彬, 黄权芳 申请人:林兴