专利名称：一种胶原原液及润眼液的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种胶原原液及润眼液的制备方法。
背景技术：
角膜结膜干燥症又称干眼症，是由于泪液质和量的异常或泪液流体动力学异常引起的泪膜不稳定和眼表损害，从而导致眼部不适症状的一类疾病。干眼是多因素的病因，其中，长期使用含有防腐剂的润眼液或护理液是现代人产生眼部干眼症的最主要原因之一。润眼液中添加一定含量的防腐剂虽利于制剂保存，但长期使用可导致正常人眼角膜表浅性刺激或损伤，从而引发或加重干眼症状。新洁尔灭作为常规防腐剂被广泛应用于各类润眼液中，一般添加量为0. lg/ml，有研究发现，长期使用含新洁尔灭的润眼液，会对眼角膜上皮细胞造成不可逆的损伤，开始时出现视力下降，眼睛充血或视物模糊等症状，继而引起上皮细胞变性、脱落，严重可导致角膜溃疡或者糜烂。胶原由三条肽链拧成螺旋形的纤维状的细胞外蛋白质，占全身蛋白质的30%以上，具有独特的生理活性。胶原蛋白富含人体必需的甘氨酸、脯氨酸、羟脯氨酸等氨基酸，是细胞外基质中最重要的组成部分，具有强的生物活性及生物功能，能参与细胞的迁移、分化和增殖，使骨腱、软骨和皮肤具有一定的机械强度，且由于其微弱的抗原性和良好的生物相容性，在烧伤、创伤、眼角膜疾病、美容、硬组织修复、创面止血等医药卫生领域用途广泛，在眼组织中主要分布于角膜和巩膜。胶原虽具有较好的生物学性能，但作为一种天然活性蛋白，生产中若处理工艺不当，极易变性丧失活性，无法达到治疗或保健的目的。同时由于胶原富含营养，非常容易滋生微生物，在这种情况下，一般需要在胶原溶液中添加防腐剂和/或抗生素，以保证胶原溶液在贮存期间不发生变质。但是添加防腐剂和/或抗生素，又会引起耐药性、刺激性等副作用，严重者可能引起干眼症、青光眼等发生。在眼用制剂中，胶原膜虽然已被广泛的应用于眼部损伤治疗研究，但用于眼部日常保健和护理产品，目前尚未有成熟的产品推出市场。要获得可实际应用的胶原蛋白润眼液，需要一种可大规模制备无菌无害，且可保持胶原活性的胶原蛋白液的方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种胶原原液及润眼液的制备方法。本发明所采取的技术方案是 一种胶原原液制备方法，包括如下步骤
1)将原料用新洁尔灭溶液浸泡，之后使用过氧乙酸与乙醇混合溶液浸泡，进行消毒和无害化处理；
2)将消毒和无害化处理的原料清洗干净，用醋酸溶液浸泡12 48小时，得到胶原原液。优选的，所述新洁尔灭溶液的浓度为0. 1 0. 5%。
优选的，所述新洁尔灭溶液的浸泡时间为10 25min。优选的，过氧乙酸与乙醇混合溶液中，过氧乙酸的体积浓度为0. 1 0. 3%，乙醇的体积浓度为70 75%。优选的，所述过氧乙酸与乙醇混合溶液的浸泡时间为10 30min。优选的，所述醋酸溶液的浓度为0. 05 1. 0M。一种一次性胶原润眼液的制备方法，包括以下步骤
1)将上述方法制得的胶原原液酸溶、纯化，得到胶原蛋白液；
2)调节胶原蛋白液的浓度和渗透压，无菌条件下灌装、密封，得到一次性胶原润眼液。优选的，所述一次性胶原润眼液的规格为0. 1 aiil/支。所述一次性胶原润眼液适用于眼球的清洗、润滑保湿、干眼症的日常护理及角膜损伤创面的止血修复。本发明的胶原原液的制备方法，可有效地杀灭原料中的各种微生物及有害物质。 同时，不会使胶原的活性失活，保证制得的各种胶原产品具有良好的生物活性。本发明方法制得的润眼液，由胶原蛋白、渗透压调节剂和注射用水组成，对干眼症有良好的疗效，可有效的修复角膜，适用于眼球的清洗、润滑保湿、干眼症的日常护理及角膜损伤创面的止血修复。润眼液中不含防腐剂、抗生素，有效地避免了防腐剂、抗生素对眼睛的伤害。
图1是动物实验中模型对照眼的病理图2是使用本发明方法制备的润眼液用于动物实验研究中的治疗眼的病理图； 图3是本发明方法制备的润眼液用于眼角膜创伤修复的治疗研究效果图； 图4是本发明方法制备的润眼液的紫外吸收峰定性检测图； 图5是本发明方法制备的润眼液的高效液相色谱法定性检测图； 图6是本发明方法制备的润眼液的SDS-PAGE电泳图。
具体实施例方式一种胶原原液制备方法，包括如下步骤
1)将原料用新洁尔灭溶液浸泡，之后使用过氧乙酸与乙醇混合溶液浸泡，进行消毒和无害化处理；
2)将消毒和无害化处理的原料清洗干净，用醋酸溶液浸泡12 48小时，得到胶原原液。优选的，所述新洁尔灭溶液的浓度为0. 1 0. 5%。优选的，所述新洁尔灭溶液的浸泡时间为10 25min。优选的，过氧乙酸与乙醇混合溶液中，过氧乙酸的体积浓度为0. 1 0. 3%，乙醇的体积浓度为70 75%。优选的，所述过氧乙酸与乙醇混合溶液的浸泡时间为10 30min，更佳的，浸泡时间为10 20min。
优选的，所述醋酸溶液的浓度为0. 05 1. 0M，优选为0. 05 0. 2M。醋酸溶液的浸泡时间优选为36 48小时。一种一次性胶原润眼液的制备方法，包括以下步骤
1)将上述方法制得的胶原原液酸溶、纯化，得到胶原蛋白液；
2)调节胶原蛋白液的浓度和渗透压，无菌条件下灌装、密封，得到一次性胶原润眼液。优选的，所述一次性胶原润眼液的规格为0. 1 aiil/支，方便不同人群的使用，避
免浪费。所述一次性胶原润眼液适用于眼球的清洗、润滑保湿、干眼症的日常护理及角膜损伤创面的止血修复。制备胶原蛋白的原料，是本领域技术人员所熟知的，常用的有新鲜鼠尾、猪、牛筋腱等。当然，根据本领域技术人员的基本常识，在进行消毒无害化处理前，需要先对这些原料进行清洗，以去除不需要的皮毛、血清、脂肪及其他污渍。为了保证原料的处理效果，优选在洁净条件下进行处理，如在GMP万级条件下或更为洁净的环境下进行消毒无害化处理。当然，根据本领域技术人员的基本常识，为保护润眼液是无菌的，灌装、密封处理应该在局部百级的条件下进行。 下面结合实施例，进一步说明本发明。通常采用牛或猪的筋腱、皮、骨等材料、鼠尾进行I型胶原的提取和制备。提取前， 原料进行相应的去毛、去脂处理和彻底清洗后，以醋酸进行提取。上述材料质地致密、含有可溶性和不溶性胶原。新鲜鼠尾中胶原组织疏松、为可溶性胶原，提取制备后的原液均一性好，但是提取的胶原同样易被化学试剂破坏。不论采用何种材料制备胶原，原料的消毒和无害化处理的方法对提取的胶原的质量影响非常大。以下实施例中，以新鲜鼠尾为例，说明如何制备得到胶原原液和润眼液。以下实施例中，所述的百分浓度，除过氧乙酸、乙醇的百分浓度为体积浓度外，其他均指质量百分浓度。胶原原液的制备实施例1
1)将新鲜鼠尾用水清洗干净，除去血清及皮毛上的污渍、血清；
2)将清洗干净的鼠尾于0.5%新洁尔灭溶液中浸泡15min，洗净后于0. 3%过氧乙酸联合75%乙醇进行浸泡IOmin ；
3)将鼠尾脱皮抽提筋腱，清洗干净，于0. 05M醋酸低温浸泡提取处理48h，得到胶原原液。实施例2
1)将新鲜鼠尾用水清洗干净，除去血清及皮毛上的污渍、血清；
2)将清洗干净的鼠尾于0.1%新洁尔灭溶液中浸泡25min，洗净后于0. 1%过氧乙酸联合70%乙醇进行浸泡20min ；
3)将鼠尾脱皮抽提筋腱，清洗干净，于0.IM醋酸常温浸泡提取处理36h，得到胶原原液。
实施例3
1)将新鲜鼠尾用水清洗干净，除去血清及皮毛上的污渍、血清；
2)将清洗干净的鼠尾于0.洲新洁尔灭溶液中浸泡20min，洗净后于0.3%过氧乙酸联合70%乙醇进行浸泡30min ；
3)将鼠尾脱皮抽提筋腱，清洗干净，于0.3M醋酸常温浸泡提取处理Mh，得到胶原原液。实施例4
1)将新鲜鼠尾用水清洗干净，除去血清及皮毛上的污渍、血清；
2)将清洗干净的鼠尾于0.3%新洁尔灭溶液中浸泡15min，洗净后于0.洲过氧乙酸联合75%乙醇进行浸泡IOmin ；
3)将鼠尾脱皮抽提筋腱，清洗干净，于0.5M醋酸常温浸泡提取处理30h，得到胶原原液。实施例5
1)将新鲜鼠尾用水清洗干净，除去血清及皮毛上的污渍、血清；
2)将清洗干净的鼠尾于0.4%新洁尔灭溶液中浸泡lOmin，洗净后于0.3%过氧乙酸联合75%乙醇进行浸泡12min ；
3)将鼠尾脱皮抽提筋腱，清洗干净，于IM醋酸常温浸泡提取处理12h，得到胶原原液。依据中国药典2010版第三部无菌检测方法对上述实施例制得的胶原原液进行取样检测，结果显示合格，表明胶原原液为无菌。润眼液的制备润眼液A
1)取实施例1制备得到的胶原原液，百级层流罩下按常规方法进行盐析、透析，纯化得到胶原蛋白液；
2)使用葡萄糖溶液和注射用水调节胶原蛋白液的浓度为0.5mg/ml，渗透压为等渗；
3)百级条件下，采用吹灌封一体化设备进行0.8ml/支灌装、封口，一体成型，得到一次性胶原润眼液。润眼液B
1)取实施例2制备得到的胶原原液，百级层流罩下按常规方法进行盐析、透析，纯化得到胶原蛋白液；
2)使用葡萄糖溶液和注射用水调节胶原蛋白液的浓度为:3mg/ml，渗透压为等渗；
3)百级条件下，采用吹灌封一体化设备进行2. Oml/支灌装、封口，一体成型，得到一次性胶原润眼液。疗效试验试验1
摘除兔眼的泪腺，合并使用0. 1%新洁尔灭溶液进行干眼症造模。治疗组给予润眼液A治疗，3次/d，模型组给予生理盐水，连续14d ；眼表观察及虎红角膜染色、眼睑组织病理检查。结果治疗组眼充血、水肿症状较模型组受试眼轻，虎红着色评分值与对照组相比均进行性减少。对照组的病理图如图1所示，治疗组的病理图如图2所示。从图中可以看出，对照组中，眼睑上皮下血管扩张充血，睑板内腺体增生；治疗组中，眼睑上皮为含有杯状细胞的柱状上皮，上皮下血管未见明显扩张，睑板内腺体未见明显增生，间质未见明显炎细胞浸润。治疗组兔眼角膜上皮细胞层次增多，内皮层细胞空泡变性少，眼睑组织上皮下血管扩张充血程度及睑板内腺体增生程度均较对照组轻。上述实验结果表明，本发明方法制备的润眼液可通过对眼球的保湿润滑和促进眼周组织再生修复等途径对干眼症起到一定的缓解和改善作用。试验2
模型兔角膜机械损伤模型；
以结膜分泌物及水肿度、洲荧光素角膜染色评分、损伤愈合率等指标，评价润眼液B对损伤角膜的修复作用。结果对照组滴加生理盐水，对照组所有动物手术后结膜分泌物增多，水肿严重， 第3天的角膜损伤愈合率为39. 7士沈.1%，第13天愈合率85. 5士 14. 1% ；治疗组所有动物术后应用胶原润眼液，结膜分泌物较少，无严重的水肿和充血，第3天的角膜损伤愈合率为 42.4 士 23.2%，第13天愈合率为100%。自第9天起，实验组和对照组角膜损伤愈合具有显著性差异(P<0. 05)，如图3。图3中的左图是对照组使用生理盐水后第14天的角膜损伤情况；右图为实验组使用胶原润眼液14后，角膜损伤基本愈合。结果显示与对照组相比，治疗组在各个观察时间点的角膜损伤愈合率均高于对照组，该润眼液能够加快兔损伤角膜的修复作用，提示该制剂可以应用于临床角膜手术病人的术后修复和护理。胶原的鉴定
Sigma公司出产的胶原是纯度高，性能稳定，目前被用作标准胶原。取润眼液A进行紫外吸收峰定性检测，检测结果如图4所示，由图可知，润眼液中的胶原在紫外225nm处有一特征吸收峰，与Sigma公司对照品相当。取润眼液A进行高效液相色谱法定性检测，检测结果如图5所示，由图可知，在保留时间2 3s处有一特征峰，且纯度高达99. 9%。取润眼液A和Sigma公司出产的胶原进行SDS-PAGE电泳，电泳图如图6所示，由图可知，润眼液中所含胶原具有特征性的4 6条带，与Sigma对照品相当。以上试验可知，使用本发明的胶原原液生产得到的胶原润眼液，其中的胶原纯度高，保留了胶原的生物活性。
权利要求
1.一种胶原原液制备方法，包括如下步骤1)将原料用新洁尔灭溶液浸泡，之后使用过氧乙酸与乙醇混合溶液浸泡，进行消毒和无害化处理；2)将消毒和无害化处理的原料清洗干净，用醋酸溶液浸泡12 48小时，得到胶原原液。
2.根据权利要求1所述的一种胶原原液制备方法，其特征在于所述新洁尔灭溶液的浓度为0. 1 0. 5%O
3.根据权利要求1或2所述的一种胶原原液制备方法，其特征在于所述新洁尔灭溶液的浸泡时间为10 25min。
4.根据权利要求1所述的一种胶原原液制备方法，其特征在于所述过氧乙酸与乙醇混合溶液中，过氧乙酸的体积浓度为0. 1 0. 3%，乙醇的体积浓度为70 75%。
5.根据权利要求1或4所述的一种胶原原液制备方法，其特征在于所述过氧乙酸与乙醇混合溶液的浸泡时间为10 30min。
6.根据权利要求1所述的一种胶原原液制备方法，其特征在于所述醋酸溶液的浓度为 0. 05 1. OM0
7.一种一次性胶原润眼液的制备方法，包括以下步骤1)将权利要求1 6任意一项所述方法制得的胶原原液酸溶、纯化，得到胶原蛋白液；2)调节胶原蛋白液的浓度和渗透压，无菌条件下灌装、密封，得到一次性胶原润眼液。
8.根据权利要求7所述一种一次性胶原润眼液的制备方法，其特征在于所述一次性胶原润眼液的规格为0. 1 aiil/支。
9.根据权利要求7所述一种胶原润眼液的制备方法，其特征在于所述一次性胶原润眼液适用于眼球的清洗、润滑保湿、干眼症的日常护理及角膜损伤创面的止血修复。
全文摘要
本发明公开了一种胶原原液及润眼液的制备方法。胶原原液通过将原料用新洁尔灭，之后使用过氧乙酸与乙醇混合溶液浸泡，进行消毒和无害化处理；清洗干净，用醋酸溶液浸泡得到胶原原液。胶原原液酶解、纯化，得到胶原蛋白液；调节胶原蛋白液的浓度和渗透压，无菌条件下灌装、密封，得到一次性胶原润眼液。本发明的胶原原液的制备方法，可有效地杀灭原料中的各种微生物和有害物质，不会使胶原失活。本发明方法制得的润眼液，对干眼症有良好的疗效，可有效的修复角膜，适用于眼球的清洗、润滑保湿、干眼症的日常护理及角膜损伤创面的止血修复。
文档编号A61K38/39GK102178936SQ20111011690
公开日2011年9月14日 申请日期2011年5月7日 优先权日2011年5月7日
发明者佟刚, 林玉泉, 赵澎, 陈淡嫦, 雷静, 黄冬晶, 黄胜 申请人:广州创尔生物技术有限公司