专利名称：一种用于结核分枝杆菌疫苗制备的核苷酸序列及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于基因工程和免疫学结合领域，更具体地是涉及利用人偏爱密码子优化结核分枝杆菌MPT64基因的核苷酸序列，及其在制备结核分枝杆菌疫苗上的应用。
背景技术：
结核病是由结核分枝杆菌(Mycobacteria tuberculosis, MTB)引起的一种慢性传染病，是世界上最严重的传染病之一，世界近三分之一的人口感染过结核菌，其中每年有 800万新感染的结核患者，有200万人死亡。卡介苗(bacille calemette guerin，BCG)是当前唯一可用的结核疫苗，但其免疫保护作用差异很大，并且存在较大副作用，因此，卡介苗不是一种令人满意的疫苗，寻找一种比卡介苗免疫保护作用更好的人结核分枝杆菌疫苗已成为国内外研究热点。结核分枝杆菌结构复杂，其菌体表面覆盖一层由长链脂肪酸、糖脂和其他成分组成的蜡样细胞壁。其基因组DNA总长约4. 41Mb，蛋白编码基因3959个(占编码基因90% )， 假基因6个(不含插入序列)，明确功能的基因M41个，有606个基因目前尚不知其功能。 利用基因组总DNA芯片技术比较分枝杆菌属基因组成特点，已鉴定出1 个结核杆菌特异性读码框(ORF)。其中，MPT64蛋白是最早被发现的结核杆菌特异性抗原(Thomas et al, 1994)，可被大多数结核患者和结核感染者的免疫系统所识别，它既能刺激细胞免疫反应， 又能诱导体液免疫反应，因此MPT64基因成为研制结核分枝杆菌新型疫苗的主要候选基因之一。目前试验研究表明，利用天然的结核分枝杆菌MPT64基因构建的DNA疫苗免疫BALB/ c小鼠能产生一定水平的体液免疫和细胞免疫，但普遍存在免疫水平较低等问题，究其原因可能是由于密码子偏好性不同，导致天然MPT64基因在哺乳动物体内的蛋白表达量不高， 进而造成免疫效果不佳。本发明采用人偏爱密码子优化结核分枝杆菌MPT64基因的核苷酸序列，并构建结核分枝杆菌疫苗，以提高其免疫原性。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种用于结核分枝杆菌疫苗制备的核苷酸序列，该核苷酸序列如SEQ ID No 1或者是SEQ ID No 1经过1个或多个核苷酸的取代、缺失或添加而不改变其编码蛋白的核苷酸序列。本发明的另一目的在于将所述的核苷酸序列应用于结核分枝杆菌疫苗的制备，具体包括以下步骤将所述的核苷酸序列克隆到真核表达载体pcDNA3. 1 (+)中，构建 pcDNA3. 1 (+) -MPT64A DNA疫苗，或者克隆到腺病毒载体中，构建pAd_MPT64A重组腺病毒疫苗。为实现上述发明目的，发明人在编码蛋白不变的前提下，将天然结核分枝杆菌 MPT64基因采用人偏爱密码子将其核苷酸序列优化并采用基因合成仪合成优化后的序列 (MPT64A)。再将优化的MPT64A基因克隆到真核表达载体pcDNA3. 1 (+)，或者克隆到腺病毒载体pAd。用构建的pcDNA3. l(+)-MPT64A DNA疫苗或者pAd_MPT64A重组腺病毒疫苗免疫BALB/c小鼠。通过间接ELISA实验及淋巴细胞增殖实验检测其免疫效果。本发明采用简单、快捷的方法将结核分枝杆菌MPT64基因改造为在人体内具有更强免疫效果的优化基因，并证实在BALB/c小鼠体内其具有优良的免疫原性，从而为研制结核分枝杆菌疫苗提供了更好的抗原基因。有益效果与常规结核分枝杆菌疫苗采用天然基因不同，本发明基于所研发的疫苗将最终用于人体内，故在保证氨基酸序列不变的前提下，用人偏爱密码子取代结核分枝杆菌MPT64基因的天然密码子，再以优化后的结核分枝杆菌MPT64基因研制DNA疫苗及重组腺病毒疫苗，这样可以使结核分枝杆菌MPT64基因的蛋白表达量增加从而增强其疫苗在人体内的免疫效果以达到良好的预防效果。
图1显示的是DNA疫苗免疫小鼠后，MPT64抗体的检测结果；图2显示的是重组腺病毒疫苗免疫小鼠后，MPT64抗体的检测结果；图3显示的是DNA疫苗免疫小鼠后，MPT64抗原特异性淋巴细胞增殖的检测结果；图4显示的是重组腺病毒疫苗免疫小鼠后，MPT64抗原特异性淋巴细胞增殖的检测结果。
具体实施例方式下面通过具体的实施例进一步说明本发明是如何实现的，以下说明不用于限制本发明的范围。实施例1.优化结核分枝杆菌MPT64基因序列的合成。在结核分枝杆菌MPT64蛋白氨基酸序列不变的前提下，采用人偏爱密码子将结核分枝杆菌MPT64基因序列(Gene bank可查)优化，并利用基因合成仪合成优化后的序列， 命名为MPT64A(如序列表SEQ ID No:l所示)。序列优化由本实验组人员完成。优化序列的合成工作委托杭州贤至生物科技有限公司完成，并最终将合成的MPT64A基因连接质粒载体PMD19-T (宝生物工程大连有限公司)。实施例2. pcDNA3. 1 (+) -MPT64A、pcDNA3. 1 (+) -MPT64 重组质粒的构建1) MPT64A 的 PCR 扩增以MPT64A基因序列为模板序列，设计合成上游引物MPT64A-F和下游引物 MPT64A-R，并分别添加酶切位点BamHI和EcoRI，具体序列如下(其中划线部分为酶切位
占)·
SEQ ID No :2MPT64A_F :5，-CGGGATCCGCCACCATGGCCCCCAAGACCTACT-3，SEQ ID No :3MPT64A_R :5，-CGGAATTCTTAGGCCAGCATGCTGTCGA-3‘以MPT64A-F和MPT64A-R分别为上下游引物，以合成的MPT64A基因为模板进行 PCR扩增，PCR反应条件为94°C预变性5分钟，94°C变性30秒，58°C退火15秒，72°C延伸45 秒，总共30个循环，最后再72°C延伸3分钟。PCR产物行1 %琼脂糖凝胶电泳，并切胶回收 MPT64A PCR 产物。2) pcDNA3. 1 (+) -MPT64A 的构建
用限制性内切酶BamHI和EcoRI (宝生物工程大连有限公司)于37°C分别双酶切 MPT64APCR产物和pcDNA3. 1 (+)载体(美国hvitrogen公司)12小时，酶切产物分别行1 % 琼脂糖凝胶电泳，并切胶回收MPT64A酶切产物和pcDNA3. 1 (+)载体。使用T4连接酶(宝生物工程大连有限公司)将回收MPT64A酶切产物和pcDNA3. 1⑴载体于4°C过夜连接后， 连接产物转化DH5 α感受态细胞(杭州贤至生物科技有限公司)，并涂布于含氨苄青霉素抗性(50 μ g/mL)的LB平板，于37°C过夜培养。第二日，挑取平板上单克隆菌株至含氨苄青霉素抗性(50 μ g/mL)的LB液体培养基，37°C恒温摇床培养12小时后，碱裂解法提取质粒，经 BamHI和EcoRI双酶切鉴定后得到阳性重组质粒，命名为pcDNA3. 1 (+)_MPT64A。pcDNA3. 1 (+)-MPT64(其中的MPT64基因为结核分枝杆菌天然序列)制备过程和 pcDNA3. 1 (+)-MPT64A类似，本领域的技术人员应该熟知，在此不再赘述。实施例3. pAd_MPT64A、pAd_MPT64重组腺病毒疫苗的构建1)重组穿梭质粒pMIDA-MPT64A的构建用限制性内切酶BamHI和EcoRI于37°C酶切pMIDA穿梭质粒(杭州贤至生物科技有限公司)12小时，酶切产物行琼脂糖凝胶电泳，并切胶回收。使用T4连接酶将回收的 pMIDA载体和实施例2中的MPT64A酶切产物于4°C过夜连接后，连接产物转化DH5 α感受态细胞，并涂布于含卡那青霉素抗性(50 μ g/mL)的LB平板，于37°C过夜培养。第二日，挑取平板上单克隆菌株至含卡那青霉素抗性(50 μ g/mL)的LB液体培养基，37°C恒温摇床培养12小时后，碱裂解法提取质粒，经BamHI和EcoRI双酶切鉴定后得到阳性重组质粒，命名为 pMIDA-MPT64A。2)重组腺病毒质粒pAd_MPT64A的构建根据hvitrogen公司腺病毒操作手册，将重组穿梭质粒pMIDA_MPT64A与腺病毒骨架质粒pAd/PL-DEST (美国 hvitrogen 公司)在重组酶LR Clonase II (美国 hvitrogen 公司)作用下，于25°C体外重组反应1小时之后，重组产物转化ToplO超级感受态细胞(美国hvitrogen公司)，涂布于含氨苄青霉素抗性(50 μ g/mL)的LB平板上，于37°C恒温培养12小时之后，于平板上挑取单克隆菌株至含氨苄青霉素抗性(50 μ g/mL)的LB液体培养基，37°C恒温摇床培养12小时后，采用质粒纯化试剂盒提取质粒，经酶切鉴定及PCR鉴定后得到正确的重组腺病毒质粒，命名为pAd-MPT64A。3)重组腺病毒疫苗pAd_MPT64A的构建在37°C条件下，用限制性内切酶I^cI (美国新英格兰生物实验公司)单酶切Iy g 重组腺病毒质粒pAd-MPT64A，5小时后纯化并回收。使用转染试剂Lipofectamine 2000(美国hvitrogen公司)将回收的酶切产物转染HEK 293A细胞(美国hvitrogen公司)，并于37°C，5% CO2条件下培养。当细胞出现明显病变，并且大于70%的HEK 细胞脱壁时，即可收集细胞，经裂解后提取并纯化重组腺病毒疫苗pAd-MPT64A。pAd-MPT64(其中的 MPT64基因为结核分枝杆菌天然序列)制备过程和pAd-MPT64A类似，本领域的技术人员应该熟知，在此不再赘述。实施例4. pcDNA3. 1 (+) -MPT64A、pcDNA3. 1 (+) -MPT64 重组质粒免疫 BALB/c 小鼠分别将5 6周龄左右的雌性BALB/c小鼠随机分成pcDNA3. 1⑴-MPT64A、 pcDNA3. l(+)-MPT64、pcDNA3. 1(+)三个免疫组及一个空白对照组，每组10只。免疫组以每次每只ΙΟΟμ g(100y L体积质粒的量经后腿肌肉注射免疫小鼠，空白对照组改为ΙΟΟμ L生理盐水经后腿肌肉注射小鼠，在第O周和第4周免疫2次，并于第5周尾静脉负压采血后分离血清。实施例5. pAd-MPT64A、pAd_MPT64重组腺病毒疫苗免疫BALB/c小鼠分别将5 6周龄左右的雌性BALB/c小鼠随机分成pAd-MPT64A、pAd_MPT64、pAd 三个免疫组及一个空白对照组，每组10只。免疫组以每只IO7TCID5tl/次的量经单侧胫前肌内注射免疫小鼠，空白对照组改为100 μ L生理盐水，在第0周和第4周免疫2次，并于第5 周尾静脉负压采血后分离血清。实施例6.体液免疫水平的检测用ELISA方法检测免疫小鼠血清中ΜΡΤ64蛋白特异性抗体。将原核表达并纯化的结核分枝杆菌ΜΡΤ64抗原(杭州贤至生物科技有限公司)以一定比例用包被液稀释， 100 μ L/孔加入酶标板(深圳金灿华实业有限公司)，4°C包被12小时后用洗涤液洗涤三次并拍干，150 μ L/孔加入封闭液，37°C封闭2小时，弃孔内液体，拍干。100 μ L/孔加待检血清及对照血清，37°C孵育1小时后，洗涤液洗涤五次并拍干。再100 μ L/孔加HRP (辣根过氧化物酶)标记的羊抗鼠IgG，37°C孵育30分钟后，洗涤液洗涤五次并拍干，每孔加显色液A 和显色液B各50 μ L，37°C避光显色10分钟，再50 μ L/孔加终止液终止反应，酶标仪450nm 波长空白孔校零后读取OD值。以MPT64抗原免疫的小鼠血清作为阳性对照，先用棋盘滴定法确定最佳的抗原包被浓度(1 μ g/mL)和血清稀释倍数(1 100稀释)。然后用建立的标准ELISA方法检测免疫组小鼠的ELISA抗体。相关溶液配方如下包被液=Na2CO31. 5g，NaHCO3 2. 9g，加双蒸水定容至 IOOOmL (ρΗ9· 6)。封闭液=Na2HPO4· 12Η20 2. 68g, NaH2PO4 · 2H20 0. 39g, NaCl 8. 5g, 20g 牛血清白蛋白，加双蒸水定容至IOOOmL (pH7. 4)。洗涤液=Na2HPO4· 12H20 2. 68g, NaH2PO4 · 2H20 0. 39g, NaCl 8. 5g, Tween-20 0. 5mL，加双蒸水定容至IOOOmL (pH7. 4)。显色液A :200mg TMB溶于IOOmL无水乙醇，加双蒸水定容至1000mL。显色液B 柠檬酸2. lg, Na2HPO4 · 12H20 71g，加双蒸水定容至1000mL。使用时ImL显色液 A+lmL 显色液 B+0. 4 μ L 30% H2O2终止液2M H2SO4, 21. 7mL浓H2SO4加双蒸水定容至1000mL。两实验组间采用非配对t检验方法分别进行分析，P值均设为0. 05。检测结果显示(见图1)，与pcDNA3. 1 (+)_MPT64相比较，利用人偏爱密码子优化后的结核分枝杆菌MPT64基因所构建的pcDNA3. 1 (+)_MPT64A DNA疫苗能更有效的刺激BALB/ c小鼠体液免疫反应，产生更高滴度的MPT64蛋白抗体，两者差异显著(P < 0. 05)。检测结果同时显示(见图2)，与pAd_MPT64相比较，利用人偏爱密码子优化后的结核分枝杆菌MPT64基因所构建的pAd-MPT64A重组腺病毒疫苗能更有效的刺激BALB/c小鼠体液免疫反应，产生更高滴度的MPT64蛋白抗体，两者差异显著(P < 0. 05)。实施例7.细胞免疫水平的检测颈椎脱位法处死小鼠，无菌取脾，按照常规方法分离淋巴细胞，用完全RMPI-1640 培养液(含10%胎牛血清、终浓度为100U/mL的青、链霉素)制备淋巴细胞悬液，并调整细胞浓度为lX106f/mL。96孔细胞培养板每孔加以上淋巴细胞悬液100 μ L后，实验孔加100 μ L浓度为100ug/mL的结核分枝杆菌MPT64抗原，对照孔不加MPT64抗原，只加100 μ L完全培养液，空白孔只加完全培养液200 μ L，各设4个复孔。将细胞培养板转移至培养箱中，37°C、5% CO2 及饱和湿度条件下培养68h，取出细胞培养板，每孔加5mg/mL MTT (噻唑兰)溶液20 μ L， 微型震荡器上震荡混勻后继续培养4h。培养结束，取出细胞培养板，弃上清培养液，每孔加 DMSO ( 二甲基亚砜)100 μ L，微型震荡器上震荡混勻5min，待沉淀完全溶解，选择490nm波长，于自动酶标仪上测OD49tlnm值。以刺激指数(StimyLation Index, Si)判断淋巴细胞的增值效价，SI =实验组OD49tlnm均值/对照组OD49tlnm均值。两实验组间采用非配对t检验方法分别进行分析，P值均设为0. 05。检测结果显示(见图3)，与pcDNA3. 1 (+)_MPT64相比较，利用人偏爱密码子优化后的结核分枝杆菌MPT64基因所构建的pcDNA3. 1 (+)_MPT64A DNA疫苗能更有效的刺激BALB/ c小鼠MPT64抗原特异性淋巴细胞增殖，两者差异显著(P < 0. 05)。检测结果同时显示(见图4)，与pAd_MPT64相比较，利用人偏爱密码子优化后的结核分枝杆菌MPT64基因所构建的pAd-MPT64A重组腺病毒疫苗能更有效的刺激BALB/c小鼠 MPT64抗原特异性淋巴细胞增殖，两者差异显著(P < 0. 05)。尽管本发明的内容是结合本实施例进行说明，但不能认为是对本发明范围的限制，本发明的范围由所附权利要求书限定。
权利要求
1.一种用于结核分枝杆菌疫苗制备的核苷酸序列，其特征在于，序列如SEQ ID No=I 或者是SEQ ID No 1经过1个或多个核苷酸的取代、缺失或添加而不改变其编码蛋白的核苷酸序列。
2.权利要求1所述的核苷酸序列的应用方法，其特征在于，所述的核苷酸序列应用于结核分枝杆菌疫苗的制备。
3.根据权利要求2所述的应用方法，其特征在于，包括以下步骤将所述的核苷酸序列克隆到真核表达载体pcDNA3. 1(+)中，构建pcDNA3. 1(+)-ΜΡΤ64Α DNA疫苗，或者克隆到腺病毒载体中，构建pAd-MPT64A重组腺病毒疫苗。
全文摘要
本发明公开了一种用于结核分枝杆菌疫苗制备的核苷酸序列及其应用。将天然结核分枝杆菌MPT64基因采用人偏爱密码子将其核苷酸序列优化并采用基因合成仪合成优化后的序列(MPT64A)。将优化后的MPT64A基因克隆到真核表达载体pcDNA3.1(+)，或者克隆到腺病毒载体pAd。用构建的pcDNA3.1(+)-MPT64A DNA疫苗或者pAd-MPT64A重组腺病毒疫苗免疫BALB/c小鼠。通过间接ELISA实验及淋巴细胞增殖实验检测其免疫效果，证实在BALB/c小鼠体内其具有优良的免疫原性。本发明采用简单、快捷的方法将结核分枝杆菌MPT64基因改造为在人体内具有更强免疫效果的优化基因，从而为研制结核分枝杆菌疫苗提供了更好的抗原基因。
文档编号A61K48/00GK102199612SQ201110142008
公开日2011年9月28日 申请日期2011年5月30日 优先权日2011年5月30日
发明者余铭恩, 冯俊涛, 吴琼杉, 李晓照, 胡成平 申请人:中南大学