专利名称：一种四价登革病毒亚单位疫苗及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种四价登革病毒亚单位疫苗及其制备方法和应用。
背景技术：
登革病毒(Dengue virus)是黄病毒科(Flaviviridae)黄病毒属的重要成员，其广泛分布于热带和亚热带地区，主要传播媒介为埃及伊蚊。该病毒感染引起的疾病是最重要的虫媒病毒病之一。据WHO统计，全球每年约有I亿人感染登革病毒，随着全球气候变暖和国际化交流的增多，该病的流行区域正在不断扩大，已成为严重的公共卫生问题。我国广东、福建、海南和台湾等东南沿海地区均为登革热的高发区。自1978年以来，该地区暴发登革热流行已达数十次，仅1980年和1985年海南2次流行患者就超过55万。近两年广东和 福建省频繁暴发登革热，导致上千人患病，严重影响了我国经济事业的正常发展。目前，对登革病毒感染只能进行对症治疗，仍无有效的疫苗用于临床。自然界存在的登革病毒有四种血清型(I 4)，即登革I型病毒(DENVl)、登革2型病毒(DENV2)、登革3型病毒(DENV3)、登革4型病毒(DENV4)。每种血清型均可引起患者产生多种症状，统称为登革病毒病，包括登革热(dengue fever, DF)的临床表现主要以高热、头痛、肌肉和关节痛为主，可伴有皮疫、淋巴结肿大和白血球减少。登革出血热(denguehemorrhagic fever,DHF)的临床特征为出血、血液浓缩、低血衆蛋白及凝血异常,有休克者为登革休克综合征(dengue shock syndrome, DSS)。人体被某一血清型的登革病毒感染后，会诱发针对该血清型的长效保护性免疫应答，但针对该型病毒的中和抗体对其它血清型却无保护作用。相反，抗体与其它血清型病毒形成的抗原-抗体复合物可与单核细胞表面的Fe受体结合，从而获得感染这些细胞的能力，这种抗体依赖的增强作用(ADE)可使患者产生更为严重的DHF/DSS。因此，安全有效的登革疫苗必须同时提供针对四个血清型的保护性免疫应答。泰国Mahidol大学和美国Walter Reed陆军研究所采用传统细胞传代的方法分别研制的减毒活疫苗虽已进行了多年的临床试验，但由于四价疫苗混合物中的一个或多个血清型会增强或抑制疫苗中其它血清型的复制和免疫原性，而且也无法避免ADE的发生。因此，研制同时针对四个血清型病毒的四价登革疫苗极为迫切和重要。登革病毒基因组为单股正链RNA，长约I lkb，共编码3种结构蛋白(C、PrM和E)和7种非结构蛋白(NSU NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5)。包膜蛋白E有三个结构域1区、II区和III区。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种预防和/或治疗登革病毒病的产品。本发明所提供的预防和/或治疗登革病毒病的产品，其活性成分为由登革病毒DENVl的包膜蛋白E的结构域III所示蛋白、登革病毒DENV2的包膜蛋白E的结构域III所示蛋白、登革病毒DENV3的包膜蛋白E的结构域III所示蛋白和登革病毒DENV4的包膜蛋白E的结构域III所示蛋白组成的组合物。上述产品中，所述登革病毒DENVl的包膜蛋白E的结构域III所示蛋白、登革病毒DENV2的包膜蛋白E的结构域III所示蛋白、登革病毒DENV3的包膜蛋白E的结构域III所示蛋白和登革病毒DENV4的包膜蛋白E的结构域III所示蛋白的质量比为I : I : (I 5) 1，具体为 I : I : I : I。上述任一所述产品中，所述登革病毒DENVl的包膜蛋白E的结构域III所示蛋白的氨基酸序列为如下1-1或1-2所示1-1 : SEQ ID NO : I 所示；1-2 ^fSEQ ID NO :I所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由1-1衍生的蛋白质；所述登革病毒DENV2的包膜蛋白E的结构域III所示蛋白的氨基酸序列为如下
2-1或2-2所示2-1 SEQ ID NO 2 所示；2-2 ^fSEQ ID NO :2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由2-1衍生的蛋白质；所述登革病毒DENV3的包膜蛋白E的结构域III所示蛋白的氨基酸序列为如下
3-1或3~2所不3-1 :SEQ ID NO :3 所示；3-2 ^fSEQ ID NO :3所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由3-1衍生的蛋白质；所述登革病毒DENV4的包膜蛋白E的结构域III所示蛋白的氨基酸序列为如下
4-1或4-2所示4-1 SEQ ID NO 4 所示；4-2 ^fSEQ ID NO :4所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由4-1衍生的蛋白质。 上述任一所述产品中，所述产品中包括药学上可接收的载体。上述任一所述产品中,所述产品为疫苗。上述任一所述产品中，所述登革病毒病是由如下四种血清型登革病毒中的至少一种引起的DENVI、DENV2、DENV3 和 DENV4。由登革病毒DENVl的包膜蛋白E的结构域III所示蛋白、登革病毒DENV2的包膜蛋白E的结构域III所示蛋白、登革病毒DENV3的包膜蛋白E的结构域III所示蛋白和登革病毒DENV4的包膜蛋白E的结构域III所示蛋白组成的组合物在制备预防和/或治疗登革病毒病的产品中的应用也属于本发明的保护范围。上述应用中，所述登革病毒DENVl的包膜蛋白E的结构域III所示蛋白、登革病毒DENV2的包膜蛋白E的结构域III所示蛋白、登革病毒DENV3的包膜蛋白E的结构域III所示蛋白和登革病毒DENV4的包膜蛋白E的结构域III所示蛋白的质量比为I : I : (I 5) 1，具体为 I : I : I : I。上述任一所述应用中，所述登革病毒DENVl的包膜蛋白E的结构域III所示蛋白氨基酸序列为如下1_1或1-2所示1-1 : SEQ ID NO : I 所示；1-2 ^fSEQ ID NO :I所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由1-1衍生的蛋白质；所述登革病毒DENV2的包膜蛋白E的结构域III所示蛋白的氨基酸序列为如下
2-1或2-2所示2-1 SEQ ID NO 2 所示；2-2 ^fSEQ ID NO :2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由2-1衍生的蛋白质；
所述登革病毒DENV3的包膜蛋白E的结构域III所示蛋白的氨基酸序列为如下
3-1或3~2所不3-1 SEQ ID NO 3 所示；3-2 ^fSEQ ID NO :3所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由3-1衍生的蛋白质；所述登革病毒DENV4的包膜蛋白E的结构域III所示蛋白的氨基酸序列为如下
4-1或4-2所示4-1 SEQ ID NO 4 所示；4-2 ^fSEQ ID NO :4所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由4-1衍生的蛋白质。上述任一所述应用中，所述登革病毒病是由如下四种血清型登革病毒中的至少一种引起的DENVI、DENV2、DENV3 和 DENV4。实验证明，用本发明疫苗免疫机体，可以激发机体的体液免疫应答，并对四个血清型登革病毒感染的乳鼠均具有保护效果，抵抗四个血清型登革病毒的感染。本发明对于预防人类登革病毒的感染具有重要的现实意义。
图I为SDS-PAGE检测E蛋白DIII区的表达。图2为Western blot检测E蛋白DIII区的表达。图3为SDS-PAGE检测纯化后的E蛋白DIII区。图4为ELISA检测E蛋白DIII区的抗原性。图5为间接免疫荧光检测免疫后小鼠血清中针对登革病毒的IgG抗体。图6为体外中和实验检测免疫小鼠血清对乳鼠的保护效果。
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例I、四种蛋白的制备一、登革病毒DENVl的E结构蛋白III区蛋白I、基因
以登革I型病毒GZ/80株毒株RNA (该病毒序列具有GENBANK号为AF350498的第
1-10735位核苷酸序列)为模板，或以人工合成的SEQ ID NO 5所示基因为模板，用表I中DII11-F/DIIII-R所示引物进行PCR扩增。PCR 循环条件为 94 °C 2min;94°C 30sec,55°C 30sec,72°C lmin，共 35 循环；72°C 延伸 7min。结果获得了长度约300bp的扩增片段，与E蛋白的DIII区基因长度大小一致。2、重组表达载体将步骤I得到的PCR扩增产物用EcoR V和Sal I于37°C酶切3小时，回收纯化片段，与用EcoR V和Sal I酶切的表达载体pET32a用T4 DNA连接酶于16°C连接过夜，连接产物通过热休克法转化化学感受态的E. coli Top 10，涂布Amp抗性LB平板，37°C培养16小 时，挑取数个单菌落接种Amp抗性LB培养液，37°C振荡培养12小时。碱裂解法抽提质粒，测序鉴定。结果表明，在质粒pET32a的EcoR V和Sal I间插入的基因序列如SEQ ID NO 5所示。将该重组质粒记作pET32a-DENVl-DIII。SEQ ID NO :5所示基因编码的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO 1所示。3、重组菌用步骤2中所述方法将pET32a-DENVl-DIII转化E. coli BL21 (DE3)，得到阳性重组菌，记作 BL21-pET32a-DENVl-DIII。4、表达蛋白挑取重组工程菌BL21-pET32a-DENVl-DIII单菌落接种到Amp抗性LB培养液中，37°C振荡培养过夜，次日按1%接种到新鲜Amp抗性LB培养液中，37°C振荡培养至0D600约为O. 6时，加入O. OlmM IPTG在37°C诱导表达4小时，诱导结束后离心(6，OOOg, 15min)，收集菌体，将菌体重悬于PBS缓冲液(体积为培养菌液的1/10)中，超声(脉冲5sec，间歇5sec，持续30min)破碎菌体，离心(6，OOOg, 30min)，分别取上清和沉淀进行SDS-PAGE，结果显示，重组菌的超声破碎上清中，增加了一条蛋白带，与目的蛋白预期大小(33KD)接近，说明DIII蛋白主要以可溶形式表达。同时采用Western blot对超声上清进行鉴定,主要方法重组菌的超声破碎上清经SDS-PAGE电泳分离，半干转移仪将胶上蛋白转移至PVDF膜上。使用含5%脱脂奶粉的TBST 4°C封闭过夜。以抗His标签的单抗(I 1000)作为一抗，碱性磷酸酶标记的马抗鼠IgG(l 1000)作为二抗进行孵育。最后用BCIP/NBT显色。结果显示，样品中可被His标签抗体识别的蛋白与目的蛋白的预期大小一致，进一步证明了 DIII蛋白已获得正确表达。5、纯化将步骤4得到的上清用Ni柱进行亲和层析纯化，使用结合缓冲液冲洗柱子，使用洗脱缓冲液洗脱目的蛋白。洗脱的蛋白经SDS-PAGE分析，显示纯化后的样品中蛋白条带单一，且与目的蛋白大小一致。结合缓冲液由pH值为7. 9、20mM的Tris-HCl缓冲液、咪唑和NaCl组成；咪唑在结合缓冲液中的浓度为10mM，NaCl在结合缓冲液中的浓度为O. 5M ;结合缓冲液的pH值为7. 9。洗脱缓冲液由pH值为7. 9、20mM的Tris-HCl缓冲液、咪唑和NaCl组成；咪唑在结合缓冲液中的浓度为500mM，NaCl在结合缓冲液中的浓度为O. 5M ;结合缓冲液的pH值为7. 9。二、登革病毒DENV2的E结构蛋白III区蛋白登革病毒DENV2的E结构蛋白III区蛋白制备方法与实验一中所述基本相同；不同的是所用引物为表I中DIII2-F/DIII2-R所示引物，模板为登革2型病毒43株毒株RNA (该病毒序列具有GENBANK号为AF204178的第1-10723位核苷酸序列)或为人工合成的SEQ ID NO 6所示基因；登革病毒DENV2的E结构蛋白III区的氨基酸序列如SEQ IDNO :2所示，该蛋白的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID N0:6所示。三、登革病毒DENV3的E结构蛋白III区蛋白登革病毒DENV3的E结构蛋白III区蛋白制备方法与实验一中所述基本相同；不同的是所用引物为表I中DIII3-F/DIII3-R所示引物，模板为登革3型病毒80_2株毒株RNA (该病毒序列具有GENBANK号为AF317645的第1-10696位核苷酸序列)或为人工合成的SEQ ID NO :7所示基因；登革病毒DENV3的E结构蛋白III区的氨基酸序列如SEQ ID NO 3所示，该蛋白的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO 7所示。四、登革病毒DENV4的E结构蛋白III区蛋白登革病毒DENV4的E结构蛋白III区蛋白制备方法与实验一中所述基本相同；不同的是所用引物为表I中DIII4-F/DIII4-R所示引物，模板为登革4型病毒B5株毒株RNA (该病毒序列具有GENBANK号为AF289029的第1-10665位核苷酸序列)或为人工合成的SEQ ID NO 8所示基因；登革病毒DENV4的E结构蛋白III区的氨基酸序列如SEQ IDNO :4所不,该蛋白的编码基因的核昔酸序列如SEQ ID N0:8所不。表I
引物名称序列(5' -3')
DIIIl-F CCGGATATCTCATATGTGATGTGCACA DIIIl-R TGCAGTCGACTTTCCCTATGGTGCTTCC DIII2-F CCGGATATCTCATACTCTATGTGCACA DIII2-R TGCAGTCGACTTGGCCGATAGAACTTCC DIII3-F CCGGATATCAGCTATGCAATGTGCTTG DIII3-R TGCAGTCGACCTTCCCAATCGAGCTTCC DIII4-F CCGGATATCTCATACACGATGTGCTCA DIII4-R TGCAGTCGACCTTGCCAATGGAACTCCC四个E蛋白DIII区的表达如图I所示。M :蛋白Marker ;1，3，5和7 :四个重组载体转化菌诱导后的超声沉淀；2，4，6和8分别代表超声上清；箭头所指处为目的条带位置。Western blot检测E蛋白DIII区的表达的结果如图2所示。M :蛋白Marker ；1 DENVl-DI 11 ；2 DENV2-DIII ；3 DENV3-DIII ；4 DENV4-DIII ;箭头所指处为目的条带位置。用SDS-PAGE检测纯化后的E蛋白DIII区的结果如图3所示。M :蛋白Marker ；1 DENVl-DI 11 ；2 DENV2-DIII ；3 DENV3-DIII ；4 DENV4-DIII ;箭头所指处为目的条带位置。五、DIII蛋白的抗原性分析DENVl 的单克隆抗体购自 United States Biological，产品目录号为 D2800-05。DENV2 的单克隆抗体购自 United States Biological，产品目录号为 D2800-14。DENV3 的单克隆抗体购自 United States Biological，产品目录号为 D2800-15。DENV4 的单克隆抗体购自 United States Biological，产品目录号为 D2800-20。 采用分别针对4个血清型登革病毒的单克隆抗体对纯化的DIII蛋白的抗原性进行ELISA分析。在微量酶联板中加入100 μ I DIII蛋白抗原(碳酸盐缓冲液稀释，终浓度为lyg/ml)，4°C过夜，弃包被抗原。用洗涤液(PBST)重复洗板3次，30s/次，拍干。加入150 μ I封闭液(含5%脱脂奶粉的PBST)，37°C孵育lh，弃封闭液，洗涤同前。加入100 μ I相应的单克隆抗体，37°C孵育lh，弃抗体，洗涤同前。加入100 μ I工作浓度的HRP标记的羊抗鼠IgG，37°C孵育30min，弃抗体，洗涤同前。加入100 μ I TMB底物，37°C避光显色15min，加入100μ1 2Μ H2SOj*止显色，测定波长450nm的光吸收值。结果显示，四种DIII蛋白均不能与正常小鼠血清结合(Negative)，但可分别与相应血清型登革病毒的单克隆抗体特异性结合，表明纯化的四种DIII蛋白具有良好的抗原性。ELISA检测E蛋白DIII区的抗原性结果如图4所示。Negative :以正常小鼠血清作为一抗；DENV1 DENV4分别代表针对不同血清型登革病毒的单克隆抗体。实施例2、动物免疫及免疫效果评价选用4周龄Balb/C雌性小鼠进行免疫。小鼠分为2组(DIII混合组和Trx组)，6只/组。将纯化的4个血清型登革病毒的DIII蛋白按I : I : I : I的质量比混合(免疫剂量为4种蛋白分别使用25 μ g)或硫氧环蛋白(Trx) 25 μ g稀释于100 μ I PBS中，再与弗氏完全佐剂按I : I的体积比混合，充分乳化后采用皮下多点注射进行初次免疫，每只小鼠注射200 μ I。每2周加强免疫I次,共加强免疫3次。每次加强免疫剂量和免疫途径均与初次免疫相同，加强免疫时将蛋白与弗氏不完全佐剂以I : I的体积比混合。初次免疫前和第二、三次加强免疫后两周采小鼠尾静脉血，分离血清测定IgG抗体效价和中和抗体效价。病毒DENV1、病毒 DENV2、病毒 DENV3、病毒 DENV4 均在文献 “Chen S，Yu M, JiangTiDeng Y,Qin C，Qin E. Induction of tetravalent protective immunity against fourdengue serotypes by the tandem domain III of the envelope protein. DNA CellBiol. 2007 ；26(6) :361-367.) ”中公开过，在符合国家和军队有关规定且经相关部门审批后，公众可从中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所获得。BHK-21细胞购自ATCC，产品目录号为CCL-10 。血清抗体效价的检测方法为1.制备登革病毒感染细胞的抗原片，待BHK21细胞(25cm2培养瓶)长成单层后，移去培养基，加入2ml含2% FBS的DMEM，并分别加入0. 5ml的DENVU DENV2、DENV3和DENV4病毒悬液。于37°C,5% CO2条件下吸附Ih后，每瓶补加3ml含2% FBS的DMEM，同样条件下继续培养2天。经0. 25%胰酶消化后，将感染了病毒的BHK21细胞配制成5 X IO5个/ml浓度的细胞悬液，滴加至经过灭菌处理的多点镀膜载玻片的上样孔内，20 μ I/孔，载玻片置湿盒，于37°C，5% CO2条件下培养6h，使细胞贴壁。将载玻片于PBS中洗去未贴壁细胞，室温晾干，-20°C丙酮固定30min。晾干后保存于_20°C备用。2.将不同稀释度血清滴加至抗原片孔内，37°C孵育lh，PBS洗3次，5min/次。然后加用O. 02%伊文思蓝稀释的FITC-羊抗鼠IgG(l 200)，37°C孵育30min，PBS洗3次，5min/次。室温干燥后在荧光显微镜下观察。结果发现，经DIII混合物免疫的小鼠血清IgG抗体可与四个血清型的登革病毒抗原结合，产生特异荧光；而Trx免疫小鼠的血清则不能产生这种特异荧光。这表明，DIII混合物免疫小鼠后可产生针对登革病毒四个血清型的特异抗体。表2显示了最后一次加强免疫后两周的小鼠血清中IgG抗体的效价。本实验中抗体效价以可见荧光的最高血清稀释度表示。间接免疫荧光检测免疫后小鼠血清中针对登革病毒的IgG抗体的结果如图5所示。(A =Trx免疫小鼠血清；B E :代表DIII混合物免疫的小鼠血清分别与四个血清型的登革病毒抗原的反应。C6/36细胞购自ATCC，产品目录号为CRL-1660 。 血清中和抗体的测定(固定病毒-稀释血清法)将56°C灭火30min的免疫小鼠血清稀释(I 4、1 8、1 16、1 32和I 64)后，分别与等体积的IOOTCID5q的DENVl、DENV2、DENV3和DENV4病毒在37°C孵育lh。然后加入96孔板中的单层C6/36细胞吸附lh，再向每孔加入100μ I含2% FBS的RPMI-1640。于37°C、5% CO2条件下培养，每天观察细胞病变。中和抗体效价以观察不到细胞病变的血清最高稀释度表示。结果显示，DIII混合物免疫小鼠的血清中可检测到针对四个血清型登革病毒的中和抗体，其中针对DENVI的中和抗体效价最高，可达I : 43，而针对DENV3的中和抗体效价仅为I : 9。同时，Trx组免疫后小鼠血清中和抗体效价均低于I : 8。这表明，DIII混合物免疫可诱导小鼠产生针对各血清型登革病毒的中和抗体。表3显示了最后一次加强免疫后两周的小鼠血清的中和抗体效价。乳鼠保护实验将56°C灭活30min的免疫小鼠血清分别与等体积的50个LD5tl的DENVl、DENV2、DENV3和DENV4病毒在37°C孵育Ih。然后进行Balb/C乳鼠(3日龄)脑内注射，20μ1/只。每日观察乳鼠死亡情况，并计算乳鼠的存活率。结果显示，DIII混合物免疫小鼠的血清可有效保护乳鼠免受DENVl，DENV2和DENV4病毒的致死性攻击，其生存率分别为90% (9/10),100% (10/10)和100% (8/8)，与Trx组相比具有显著性差异(p=O. 0026,0. 000023和O. 00016)。虽然DIII混合物免疫小鼠的血清对DENV3的保护率(33.3% (2/6))与Trx组相比无统计学差异，但该组血清可延缓病毒感染的乳鼠产生后肢麻痹等神经症状。以上结果表明，DIII混合物诱导小鼠产生的免疫应答可有效保护乳鼠免受不同血清型登革病毒的攻击。体外中和实验检测免疫小鼠血清对乳鼠的保护效果如图6所示。(A D :分别代表免疫小鼠血清对DENV1，DENV2, DENV3和DENV4感染乳鼠的保护作用；*代表DIII混合组的存活率与Trx组具有统计学差异)。表2免疫小鼠血清中针对不同血清型登革病毒的IgG抗体效价
权利要求
1.一种预防和/或治疗登革病毒病的产品，其活性成分为由登革病毒DENVl的包膜蛋白E的结构域III所示蛋白、登革病毒DENV2的包膜蛋白E的结构域III所示蛋白、登革病毒DENV3的包膜蛋白E的结构域III所示蛋白和登革病毒DENV4的包膜蛋白E的结构域III所示蛋白组成的组合物。
2.根据权利要求I所述的产品，其特征在于所述登革病毒DENVl的包膜蛋白E的结构域III所示蛋白、登革病毒DENV2的包膜蛋白E的结构域III所示蛋白、登革病毒DENV3的包膜蛋白E的结构域III所示蛋白和登革病毒DENV4的包膜蛋白E的结构域III所示蛋白的质量比为I : I : (I 5) : 1，具体为I : I : I : I。
3.根据权利要求I或2所述的产品，其特征在于 所述登革病毒DENVl的包膜蛋白E的结构域III所示蛋白的氨基酸序列为如下1-1或1-2所示1-1 SEQ ID NO 1 所示； 1-2^fSEQ ID NO :I所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由1-1衍生的蛋白质； 所述登革病毒DENV2的包膜蛋白E的结构域III所示蛋白的氨基酸序列为如下2_1或2-2所示2-1SEQ ID NO 2 所示； 2-2^fSEQ ID NO :2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由2-1衍生的蛋白质； 所述登革病毒DENV3的包膜蛋白E的结构域III所示蛋白的氨基酸序列为如下3_1或3-2所示3-1SEQ ID NO 3 所示； 3-2^fSEQ ID NO :3所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由3-1衍生的蛋白质； 所述登革病毒DENV4的包膜蛋白E的结构域III所示蛋白的氨基酸序列为如下4_1或4-2所示4-1SEQ ID NO 4 所示； 4-2 ^fSEQ ID NO :4所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由4-1衍生的蛋白质。
4.根据权利要求I或2或3所述的产品，其特征在于所述产品中包括药学上可接收的载体。
5.根据权利要求1-4中任一所述的产品，其特征在于所述产品为疫苗。
6.根据权利要求1-5中任一所述的产品，其特征在于所述登革病毒病是由如下四种血清型登革病毒中的至少一种引起的DENV1、DENV2、DENV3和DENV4。
7.由登革病毒DENVl的包膜蛋白E的结构域III所示蛋白、登革病毒DENV2的包膜蛋白E的结构域III所示蛋白、登革病毒DENV3的包膜蛋白E的结构域III所示蛋白和登革病毒DENV4的包膜蛋白E的结构域III所示蛋白组成的组合物在制备预防和/或治疗登革病毒病的产品中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于所述登革病毒DENVl的包膜蛋白E的结构域III所示蛋白、登革病毒DENV2的包膜蛋白E的结构域III所示蛋白、登革病毒DENV3的包膜蛋白E的结构域III所示蛋白和登革病毒DENV4的包膜蛋白E的结构域III所示蛋白的质量比为I : I : (I 5) 1，具体为I : I : I : I。
9.根据权利要求7或8所述的应用，其特征在于 所述登革病毒DENVl的包膜蛋白E的结构域III所示蛋白氨基酸序列为如下1-1或1-2所示1-1 SEQ ID NO 1 所示； 1-2^fSEQ ID NO :I所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由1-1衍生的蛋白质； 所述登革病毒DENV2的包膜蛋白E的结构域III所示蛋白的氨基酸序列为如下2_1或2-2所示2-1SEQ ID NO 2 所示； 2-2^fSEQ ID NO :2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由2-1衍生的蛋白质； 所述登革病毒DENV3的包膜蛋白E的结构域III所示蛋白的氨基酸序列为如下3_1或3-2所示3-1SEQ ID NO 3 所示； 3-2^fSEQ ID NO :3所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由3-1衍生的蛋白质； 所述登革病毒DENV4的包膜蛋白E的结构域III所示蛋白的氨基酸序列为如下4_1或4-2所示4-1SEQ ID NO 4 所示； 4-2 ^fSEQ ID NO :4所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由4-1衍生的蛋白质。
10.根据权利要求7-9中任一所述的应用，其特征在于所述登革病毒病是由如下四种血清型登革病毒中的至少一种引起的DENV1、DENV2、DENV3和DENV4。
全文摘要
本发明公开了一种四价登革病毒亚单位疫苗及其制备方法和应用。本发明的预防和/或治疗登革病毒病的产品，其活性成分为由登革病毒DENV1的包膜蛋白E的结构域III所示蛋白、登革病毒DENV2的包膜蛋白E的结构域III所示蛋白、登革病毒DENV3的包膜蛋白E的结构域III所示蛋白和登革病毒DENV4的包膜蛋白E的结构域III所示蛋白组成的组合物。实验证明，用本发明疫苗免疫机体，可以激发机体的体液免疫应答，并对四个血清型登革病毒感染的乳鼠均具有保护效果，抵抗四个血清型登革病毒的感染。本发明对于预防人类登革病毒的感染具有重要的现实意义。
文档编号A61K39/12GK102824633SQ20111016223
公开日2012年12月19日 申请日期2011年6月16日 优先权日2011年6月16日
发明者秦成峰, 赵慧, 邓永强, 姜涛, 秦鄂德 申请人:中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所