专利名称：microRNA-26在制备预防和治疗房颤药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种核酸类物质在制备治疗疾病药物中的应用，特别涉及 microRNA-沈在制备治疗房颤药物中的应用，本发明属于生物医药领域。
背景技术：
房颤(AF)是最常见的心律失常之一，其危害严重，可引起血管栓塞，增加患者的死亡率。房颤与心力衰竭密切相关，它可引起心衰，还可加重心衰患者的左室功能异常。心衰患者中房颤发病率高达10-50%。房颤发病率随着年龄增长明显上升，在55岁以下人群， AF发病率为0. 1 %，而80岁以上人群则高达9%。目前，房颤的防治效果并不理想，传统药物治疗常导致更严重的心律失常发生，射频消融术复发的几率较高。因此，急需研发新的房颤治疗药物，改善目前的治疗现状。microRNA(小RNA、miRNA)是一类对基因表达起调控作用的约22个核苷酸长的内源性非编码小核苷酸，成熟miRNAs通过与mRNA的3’非翻译区部分互补结合进而抑制其蛋白质翻译。miRNAs占人类基因组的3%，大约参与调控30%蛋白质编码基因的表达。研究表明，miRNAs广泛参与了不同生理以及病理过程的调节，如发育、凋亡、分化、增殖、代谢、应激等。近几年，miRNAs在心血管系统中的调控作用不断得到阐明，已成为心血管疾病的研究热点。miRNAs是调控心律失常、心力衰竭、心肌肥厚以及动脉粥样硬化等心血管疾病的关键调控分子。基于microRNA靶点的药物在心血管疾病中的应用不断获得实验成功，从而心血管疾病的防治带来新的希望，因此发现不同病理生理情况下起关键调节作用的microRNA亚型变化，并阐明其功能，将会对该疾病的治疗带来新的靶标和产生新的干预策略。尽管越来越多的microRNAs作为心血管疾病的决定因素和治疗靶点被发现，但在心房颤动中的关键microRNA亚型仍没有确定，其所发挥的功能仍是对该领域科研人员的挑战。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明采用多种技术手段证明了 micr0RNAj6(miRj6) 在心房颤动中的改变及其对房颤的治疗作用，最终确定microRNA-沈可以作为制备治疗心房颤动的防治药物。本发明的microRNA-沈在制备治疗房颤药物中的应用，所述的microRNA-沈序列如下所示miR-26a :5，-UUCAAGUAAUCCAGGAUAGGCU-3，；及 / 或miR-26b :5， -UUCAAGUAAUUCAGGAUAGGU-3，。本发明的microRNA-沈在制备预防房颤药物中的应用，所述的microRNA-沈序列如下所示miR-26a 5， -UUCAAGUAAUCCAGGAUAGGCU-3，；及 / 或miR-26b 5’ -UUCAAGUAAUUCAGGAUAGGU-3，。本发明的microRNA-沈在制备预防和治疗房颤药物中的应用，制备的药物可以只含microRNA-26，也可通过制成一种药物组合物的方式实现，其特征在于包含以上所述的有效剂量的microRNA-沈及药学上可接受的载体；其中，所述的载体为病毒、胆固醇，纳米颗粒，壳聚糖，脂质体等，合成miR-沈并与上述的适当载体连接形成药物，可制成注射制剂等，通过静脉或肌肉注射的方式，用于治疗
心房颤动。例如将microRNA-26与胆固醇连接制备相应的药物，其制备方法可采用首先化学合成microRNA-沈序列，在其尾端连接胆固醇的常规核酸制剂的方法；例如将microRNA-26与纳米颗粒连接制备相应的药物，其制备方法可采用化学合成microRNA-沈序列，将其与适宜的纳米颗粒混合，制成连有microRNA-沈纳米颗粒，用于房颤药物的制备中。为了增加核酸试剂的使用效果，还可辅以专用的稳定剂和特异性免疫增强剂精制而成。
图 1 为 pcDNA6. 2-Gff/EmGFP-miR 载体图谱；图2为pD0NR221载体图谱；图 3 为 pAD/CMV/V5_DEST 载体图谱；图4为腺病毒载体构建的检测；图4A为穿梭质粒与骨架质粒共转染后GFP的表达；4B为病毒液接种HEK-293细胞后GFP的表达；图5为利用心电监测仪检测注射腺病毒miR-沈后小鼠房颤的发生率(A)与持续时间(B)；图6为利用realtime PCR检测在体注射腺病毒表达载体后小鼠心房肌miR-沈的表达水平。图7为AF模型的建立；图7A为犬心电图；图7B为AF发生率和持续时间；图8为miR-沈在A-TP犬㈧和房颤患者⑶中的表达变化；
具体实施例方式下面通过药理性及临床观察实验并结合实施例对本发明做进一步说明，应该理解的是，这些实施例仅用于例证的目的，决不限制本发明的保护范围。实施例lmiR-沈对房颤的治疗作用1、构建miR-沈的腺病毒表达载体将mmu-miRj6a-l 的成熟形式(mmu-mirj6a-lMI00005735，-AAGGCCGUGGCCUCGUU CMGUAAUCCAGGAUAGGCUGUGCAGGUCC CAAGGGGCCUAUUCUUG⑶UACUUGCACGGGGACGCGGGCCUG-3 ’) 转换成适于表达的前体序列miR46a :5，-UUCAAGUAAUCCAGGAUAGGCU-3，，设计合成0LIG0， 并退火连接到pcDNA6. 2-Gff/EmGFP-miR载体中。将构建好的mmu-miRj6a-l表达载体(载体图谱见图1所示)和PD0NR221载体(载体图谱见图2所示)进行BP重组反应，以获得穿梭载体。将穿梭载体和腺病毒表达的骨架载体pAD/CMV/V5-DEST(载体图谱见图3所示) 进行共转染，发生LR重组反应，穿梭质粒与骨架质粒共转染后GFP的表达如图4A所示，以获得对应的腺病毒表达载体。将病毒载体用限制性内切酶I^acI单酶切，用酚氯仿抽提及紫外分光光度计测定浓度。经病毒载体转染HEK-293细胞，GFP的表达如图4B所示，换液，继续培养48小时；扩大至2 X IOcm培养皿再培养10-13天，收集病毒原液，浓缩100倍。采用免疫法检测腺病毒滴度，通过抗腺病毒的多抗与感染了腺病毒的细胞结合，再用辣根过氧化酶标记的二抗，经显色液显色，计算被感染细胞，从而确定病毒滴度。2、腺病毒miR-沈对房颤的治疗作用选用体重20_25g成年健康C57/B6小鼠，分为3组(1)正常组；⑵空载体组(Adv-pDC316) ； (3)腺病毒注射组(Adv-pre-miR-26) 0经尾静脉将IO9pFU的腺病毒以及空载体分别注入两组小鼠体内。三天后，将小鼠麻醉，仰卧位固定，经颈外静脉将含4对电极(SCIsense)的小鼠电极导管逆行插至右心房和右心室内，电极尾端连电刺激仪，给予程序性电刺激，观察房颤的诱发率与诱发时间。实验结果显示如图5所示，注射 Adv-pre-miR-26后小鼠的房颤发生率和房颤持续时间均明显的受到抑制。空载体组房颤的诱发率为48%，miR-26组房颤的诱发率为12. 5% (*p < 0. 05vs Adv-pDC316)；空载体组房颤的持续时间为2. 3秒，而注射Adv-pre-miR-沈后AF的持续时间仅仅为1. 1秒(*p < 0. 05vs Adv-pre-miR-328)。利用realtime PCR检测注射Adv-pre-miR-沈后miR-沈的表达水平。实验结果显示如图6所示和Adv-pDC316相比，Adv-pre-miR-26组小鼠心房miR-沈的表达量升高 2. 5倍(*p < 0. 05vs Adv-pDC316)。可见，这种在体转导方法可用于后续蛋白表达及心电监测的实验中。通过实验证明了在实验性房颤中microRNA-沈表达异常下调。用腺病毒载体过表达microRNA-26能够抑制房颤的发生，说明microRNA-沈是一个新的可用于制备预防和治疗房颤疾病的药物。 实验例IAF模型的建立本实验采用心房快速起搏法建立，将起搏电极缝植于27只犬的右心耳进行起搏 GOO次/分)，术后进行动态心电监测。27只犬完成整个实验。1只犬因起搏器故障而终止实验；2只犬因囊袋血肿于术后第2周死亡；2只犬术后感染死亡；1只犬于术后第5周突然死亡，尸检发现左、右心耳有较多新鲜血栓，考虑和血栓栓塞有关。起搏前所有犬经程序刺激均未诱发出AF。在犬心房植入起搏器，起搏前，所有犬期前程序刺激检查均未发生AF。将剩余的 21只犬分成两组，17只犬进行心房快速起搏，作为A-TP组；剩余4只不进行心房快速起搏， 作为control组。8周后，A-TP组17只犬中12只出现了自发性AF，Control组没有犬出现自发性AF，心电图检测结果如图7A所示。经电刺激诱导AF时，A-TP组AF的发生率为100% (*p < 0. 05vs. control，AF发生率和持续时间如图7B所示)，AF持续时间为3000士 180sec， 而control组AF的发生率只有40%，AF持续时间为3. 8士3.如ec。心电图显示，A-TP组P 波消失，RR间隔不等，心律100-190次/分。实验例aniR-沈在房颤(AF)中的表达变化提取犬心房以及临床上有房颤和无房颤患者心房的总RNA，利用紫外吸收测定法和变性琼脂糖凝胶电泳对RNA质量进行检测。28S和18S核糖体RNA的带非常亮而浓(其大小决定于用于抽提RNA的物种类型)，上面一条带的密度大约是下面一条带的2倍。还有可能观察到一个更小稍微扩散的带，它由低分子量的RNA(tRNA和5S核糖体RNA)组成。在18S和^S核糖体带之间一般可以看到一片弥散的EB染色物质，可能是由mRNA和其它异型RNA组成。利用real time PCR方法检测miR_26的表达，结果miR-沈在房颤犬和房颤患者心房中的表达明显下降，结果如图8所示。以上所述仅为本发明的优选实施例，对本发明而言仅是说明性的，而非限制性的； 本领域普通技术人员理解，在本发明权利要求所限定的精神和范围内可对其进行许多改变，修改，甚至等效变更，但都将落入本发明的保护范围内。
权利要求
1.microRNA-26在制备治疗房颤药物中的应用，所述的microRNA-沈序列如下所示 miR-26a 5’ -UUCAAGUAAUCCAGGAUAGGCU-3’ ；及 / 或miR-26b 5’ -UUCAAGUAAUUCAGGAUAGGU-3，。
2.microRNA-26在制备预防房颤药物中的应用，所述的microRNA-沈序列如下所示 miR-26a 5’ -UUCAAGUAAUCCAGGAUAGGCU-3’ ；及 / 或miR-26b 5’ -UUCAAGUAAUUCAGGAUAGGU-3，。
3.一种用于治疗房颤的药物组合物，其特征在于包含权利要求1或2所述的有效剂量的microRNA-沈及药学上接受的载体。
4.如权利要求3所述的药物组合物，其特征在于所述的载体为病毒、胆固醇、纳米颗粒、壳聚糖或脂质体。
5.如权利要求3或4所述的药物组合物，其特征在于药物组合物为注射制剂。
全文摘要
本发明公开了microRNA-26在制备药物中的应用，具体是用于制备预防和治疗房颤的药物。制备的药物可以只含microRNA-26，也可制成一种药物组合物，其特征在于包含有效剂量的microRNA-26及药学上可接受的载体；其中，所述的载体可为病毒、胆固醇，纳米颗粒，壳聚糖，脂质体等，合成miR-26并与上述的适当载体连接形成药物，可制成注射制剂，通过静脉或肌肉注射的方式，用于治疗心房颤动。
文档编号A61K47/48GK102228697SQ201110167840
公开日2011年11月2日 申请日期2011年6月21日 优先权日2011年6月21日
发明者吕延杰, 杨宝峰, 潘振伟, 王志国 申请人:哈尔滨医科大学