专利名称：肿瘤抗原Pokemon的HLA-A*0201限制性CTL表位及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物医药领域，涉及一种抗原细胞毒性T细胞(CTL)表位，特别涉及肿瘤抗原Pokemon的HLA_A*0201限制性CTL表位，还涉及该CTL表位的应用。
背景技术：
神经胶质瘤是中枢神经系统最常见的原发肿瘤，发生率约占颅内肿瘤的309Γ50%， 且绝大多数为恶性肿瘤，采用传统肿瘤治疗方案如手术、化疗、放疗等，患者的平均生存期往往不足1年。因此，寻求新的治疗方法迫在眉睫。肿瘤特异性免疫治疗由于不伤及无关正常组织，是近年来发展迅速的肿瘤治疗方法。其基本原理是肿瘤抗原多肽在抗原提呈细胞(APC)的作用下以MHC-I-肽复合物(与 MHC-I类分子结合的肽被定义为CTL表位)的形式被提呈于APC表面，CTL通过其T细胞受体特异识别APC表面的MHC-I-肽复合物而得以活化，最终特异识别存在于肿瘤细胞表面的抗原多肽而特异杀伤肿瘤细胞。因此，寻求特异肿瘤抗原及其相应的CTL表位是肿瘤特异性免疫治疗的关键。Pokemon是近年发现的转录抑制因子，由Zbtb7基因编码，是POK蛋白家族的成员之一，在细胞分化中发挥重要作用。研究发现，Pokemon是肿瘤发生的一个关键因素。缺失 Zbtb7基因的小鼠胚胎成纤维细胞对其它原癌基因如E1A、Ras, Myc和T2Ag等介导的细胞转化完全无反应。在转基因小鼠模型中，Pokemon的过表达导致了肿瘤的发生，其通过直接结合特异地抑制肿瘤抑制基因ARF的转录，BCL6基因的活性也有赖于Pokemon。在神经胶质瘤、乳腺癌、肺癌、结肠癌、前列腺癌和膀胱癌等人类肿瘤中，Pokemon异常高表达，也证明了人类许多肿瘤的发生是由于Pokemon表达异常升高所引起的。关于Pokemon的作用模式研究结果显示，Pokemon的作用位于许多肿瘤抑制基因和原癌基因的上游，因此，将其作为靶基因将有助于肿瘤的根治。由于HLA-A*0201是中国人群最为常见的HLA-I类分子的型别，阳性率高达50%， 同时也是北美高加索人种最常见的HLA-I类分子的型别，阳性率高达98%。因此，鉴定出肿瘤抗原Pokemon的HLA_A*0201限制性CTL表位，将会对中国人群和北美高加索人群中 Pokemon表达异常升高的恶性肿瘤提供免疫治疗的基础。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的之一在于提供肿瘤抗原Pokemon的HLA_A*0201限制性 CTL表位，该表位能够以高亲和力结合HLA-A*0201，所形成的复合物稳定，能够诱导肽特异性的CTL应答，刺激肽特异性CTL分泌高水平的IFN- γ并对肿瘤细胞产生特异性杀伤效应。为达到上述目的，本发明提供如下技术方案肿瘤抗原Pokemon的HLA_A*0201限制性 CTL 表位，其氨基酸序列如 SEQ ID No. 1、SEQ ID No. 2、SEQ ID No. 3 或 SEQ ID No. 4 所示。
本发明的目的之二在于提供所述肿瘤抗原Pokemon的HLA_A*0201限制性CTL表位在制药方面的应用。为达到此目的，本发明提供如下技术方案肿瘤抗原Pokemon的HLA_A*0201限制性CTL表位在制备肿瘤治疗性肽疫苗中的应用。进一步，所述肿瘤治疗性肽疫苗为神经胶质瘤治疗性肽疫苗。本发明的有益效果在于本发明提供了肿瘤抗原Pokemon的HLA_A*0201限制性 CTL表位，该CTL表位能够以高亲和力结合HLA-A*0201，所形成的复合物稳定，能够诱导肽特异性的CTL应答，刺激肽特异性CTL分泌高水平的IFN- γ并对肿瘤细胞产生特异性杀伤效应，可用于制备肿瘤治疗性肽疫苗例如神经胶质瘤治疗性肽疫苗，在肿瘤特异性免疫治疗领域有着潜在、良好的开发应用前景。
图1为预测CTL表位Pl与HLA_A*0201的复合物模型。图2为预测CTL表位P2与HLA_A*0201的复合物模型。图3为预测CTL表位P3与HLA_A*0201的复合物模型。图4为预测CTL表位P4与HLA_A*0201的复合物模型。图5为预测CTL表位Pl的分子动力学模拟构象。图6为预测CTL表位P2的分子动力学模拟构象。图7为预测CTL表位P3的分子动力学模拟构象。图8为预测CTL表位P4的分子动力学模拟构象。图9为预测CTL表位肽PI、P2、P3、P4与HLA_A*0201的亲和力检测结果。图10为预测CTL表位肽P1、P2、P3、P4与HLA_A*0201的复合物稳定性检测结果。图11为预测CTL表位肽Pl、P2.P3.P4刺激肽特异性CTL杀伤靶细胞的能力检测结果。图12为预测CTL表位肽Pl、P2、P3、P4刺激肽特异性CTL分泌IFN- γ的能力检测结果。
具体实施例方式为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步的详细描述。一、Pokemon HLA_A*0201 限制性 CTL 表位预测
1、超基序方案预测CTL表位
超基序是指在同一 HLA家族，甚至是不同家族的HLA同种异型分子接纳的抗原肽具有相同和相似的锚着残基构成的肽基序。超基序主要的锚定残基是肽链第2位(P》和第9 位(P9)的氨基酸残基，当P2、P9位氨基酸残基为V、L、I、M或T时，肽与HLA_A*0201有高亲和力；当P2、P9位氨基酸残基为A、I、L、M、V或T时，肽与HLA-A*0201有较高亲和力。利用 SYFPEITHI 在线软件(http://www. syfpeithi. de/scripts/MHCServer. dll/home. htm), 以P2、P9位氨基酸残基为V、L、I、M或T为条件，对肿瘤抗原Pokemon (Genbank登录号为 ΝΜ_015898. 2)的HLA_A*0201限制性CTL表位进行预测。
结果获得分值大于M的预测CTL表位4个，分别是Pl :GLLCDVVIL(SEQ ID No. 1)， 得分四；P2 :LLCDVVILV (SEQ ID No. 2)，得分 27 ；P3 :AVAAAVAAV (SEQ ID No. 3)，得分 25 ； P4 KLFTSGAW (SEQ ID No. 4)，得分 24。2、预测CTL表位的分子动力学模拟
运用Silicon graphics工作站及hsight II软件包中的Discover 3模块(采用CVFF 力场)，对4个预测CTL表位与HLA-A2. 1的复合物进行分子动力学模拟。HLA_A*0201的初始坐标来自于蛋白质晶体结构数据库(Protein Data Bank)登录的流感病毒蛋白Μ158_66 (Τ 细胞表位)与HLA-A*0201的复合物模型(登录号为IHH I )，预测CTL表位是运用Bioploymer 模块对IHH I中的Ml58,进行氨基酸替换而得。分子动力学模拟过程如下第一步，将 HLA-A*0201与β an固定，运用最陡下降法对预测CTL表位进行2000步优化计算，再用共扼梯度法优化，直到能量均方根误差(RMS)小于1. 0187K/J. mol ；第二步，在预测CTL表位与HLA-A*0201复合物周围加一层7. 5A的水分子，再固定复合物对水分子进行2000步能量优化，以消除水分子之间以及水分子与蛋白质之间的不合理接触；第三步，对溶液状态下的预测CTL表位与HLA-A*0201复合物进行能量最小化计算，非键相互作用采用9. 5A的截断值，先后运用最陡下降法和共扼梯度法优化，直到能量RMS小于1. 0187K/J. mol ；第四步， 在^SK的恒定温度下进行20皮秒的分子动力学计算；第五步，对动力学优化得到的最后构象进行分子力学优化5000步，获得预测CTL表位与HLA-A*0201复合物的最终构象。借助 Homology模块，计算4个预测CTL表位的P2、P9锚定间距等结合参数。4个预测CTL表位与HLA_A*0201的复合物模型分别见图1_4，4个预测CTL表位的分子动力学模拟构象分别见图5-8。4个预测CTL表位的P2、P9锚定间距在17 2θΑ范围内，满足大部分HLA-A*0201限制性CTL表位的锚定间距在15 2θΑ范围的要求。4个预测 CTL表位与HLA-A*0201结合槽的氨基酸残基之间均形成5个以上的稳定氢键。二、预测Pokemon HLA_A*0201限制性CTL表位肽的合成
4个预测CTL表位肽的合成在ABI 431A型固相多肽合成仪上进行。采用标准芴甲氧羰基(Fmoc)方案，精氨酸采用两次偶联。起始选用0. 125mmol对羟甲基苯氧甲基聚苯乙烯树脂(HMP树脂)，按照多肽的氨基酸序列使肽链从羧基端逐个向氨基端延伸，每种氨基酸的用量为0.5mmol，与树脂的摩尔比为4:1。各种氨基酸的α -氨基为Fmoc保护，其余侧链保护基团分别为Lys(Boc)、Ser(tBu) ,Glu(OtBu) ,Arg(Pmc) ,His(Trt)、Thr(tBu)和 Tyr(tBu)。 第一个氨基酸连接到树脂上用4-二甲氨基吡啶(DMAP)，氨基酸的活化用1-羟基苯并三唑 (HOBt)和二环己基碳二亚胺(DCC)，偶联后用体积分数为20%的哌啶水溶液去除Fmoc保护基。多肽合成后，将树脂-粗肽产品在冰浴条件下混合于IOmL切割液A(由结晶苯酚0. 75g、 1，2-乙二硫醇即EDT 0. 25mL、苯甲硫醚0. 5mL、去离子水0. 25mL和三氟乙酸即TFA IOmL组成)中，待切割液温度上升至室温后，搅拌反应2小时，使肽链从树脂上裂解下来，同时去除多种保护基团。将反应混合液经G4玻砂漏斗过滤以去除树脂，先后用ImL TFA、5 10mL 二氯甲烷反复冲洗反应瓶、树脂和漏斗。将滤液在常温低压下蒸发至广2mL，加入50mL预冷乙醚沉淀多肽，4°C放置过夜，G6玻砂漏斗过滤，真空抽干，即得多肽粗品，-20°C保存备用。将多肽粗品用二甲基亚砜(DMSO)溶解制成浓度为20mg/mL的溶液，经孔径为 0. 45 μ m的微孔滤膜过滤后，在AKTA explorer 100型中压液相色谱仪(瑞典Amerssham Bioscienc公司)上用SOURCE凝胶柱进行纯化。流动相A由体积分数为10%的乙醇和体积分数为0. 1%的TFA组成，流动相B由体积分数为90%的乙醇和体积分数为0. 1%的TFA组成；洗脱梯度为先用流动相A洗脱1. 5个柱体积，再用流动相A和流动相B的混合液洗脱 8个柱体积(流动相B占混合液的体积分数在8个柱体积内由0%逐渐增加至80%)，再用流动相A和流动相B的混合液洗脱0. 5个柱体积(流动相B占混合液的体积分数在0. 5个柱体积内由80%逐渐增加至100%)，在主峰处收集多肽溶液，冷冻干燥，即得多肽纯品，用DMSO 溶解，-20°C保存备用。将多肽纯品用Delta 600型高压液相色谱仪鉴定纯度，采用Symmetry ShieldTM C18柱，流动相由体积分数为10%飞0%的乙腈和体积分数为0. 1%的TFA组成，流速为ImL/ min。结果显示，合成多肽的纯度均达到95%以上。同时，将多肽纯品用API 2000 LC/MS型电喷雾离子化质谱仪测定分子量。结果显示，合成多肽的分子量分别与4个预测CTL表位肽的理论分子量相符。三、预测Pokemon HLA_A*0201限制性CTL表位肽与HLA_A*0201的亲和力检测采用HLA-A*0201表达阳性但内源性抗原肽递呈途径必需的抗原加工相关转运体
(TAP)缺陷的T2细胞进行实验。T2细胞表面空载的HLA-A*0201表达极不稳定，呈递后很快降解，而结合了抗原肽的HLA-A*0201表达稳定，且抗原肽与HLA-A*0201的结合力越强， HLA-A*0201的表达量越高。因T2细胞的内源性抗原肽加工处理能力缺失，故T2细胞表面 HLA-A*0201的表达量增加直观地反应了外源性抗原肽与HLA-A*0201的结合力。实验分为5组P1组(预测CTL表位肽Pl)、P2组(预测CTL表位肽P2)、P3组(预测CTL表位肽P3)、P4组(预测CTL表位肽P4)和阴性对照组(无关表位肽AAVEEVRAL)。将 3 X IO5个T2细胞接种于Iml含有浓度为100M的肽(按实验分组加入相应肽)以及浓度为10% (w/w)的胎牛血清(FCS)的RPMI 1640培养基中，在温度为37°C、0)2气体体积分数为5%的条件下培养16小时，用PBS洗涤细胞2次，加入BB7. 2杂交瘤细胞分泌的鼠抗人HLA_A*0201 单克隆抗体100 μ 1，4°C培养30分钟，再用PBS洗涤细胞2次，加入按体积比为1 50稀释的 FITC标记的羊抗鼠IgG抗体100 μ 1，4°C培养30分钟，用PBS洗涤并重悬细胞后，用流式细胞仪于波长488nm处测定荧光强度，计算荧光系数(FI )。结果如图9所示，可见Pl组、P2组、P3组和P4组的FI值均明显高于阴性对照组， 说明4个预测CTL表位肽PI、P2、P3和P4均能以高亲和力结合HLA_A*0201。四、预测Pokemon HLA_A*0201限制性CTL表位肽与HLA_A*0201的复合物稳定性检测
实验分为5组P1组(预测CTL表位肽Pl )、P2组(预测CTL表位肽P2)、P3组(预测CTL 表位肽P3)、P4组(预测CTL表位肽P4)和阴性对照组(无关表位肽AAVEEVRAL)。将1 X IO6 个T2细胞接种于Iml含有浓度为100M的肽(按实验分组加入相应肽)以及浓度为10% (w/ w)的FCS的RPMI 1640培养基中，在温度为37°C、0)2气体体积分数为5%的条件下培养16 小时，用PBS洗涤细胞2次，再加入无血清RPMI 1640培养基，在温度为37°C、0)2气体体积分数为5%的条件下继续培养，分别于0、2、4、6、8小时取出细胞，加入BB7. 2杂交瘤细胞分泌的鼠抗人HLA-A*0201单克隆抗体100 μ 1，4°C培养30分钟，用PBS洗涤细胞2次，再加入按体积比为1 50稀释的FITC标记的羊抗鼠IgG抗体100 μ 1，4°C培养30分钟，用PBS洗涤并重悬细胞后，用流式细胞仪于波长488nm处测定荧光强度，计算肽与HLA_A*0201分子复合物的半数解离时间(DC50)。
结果如图10所示，可见Pl组、P2组、P3组和P4组的DC50值均明显高于阴性对照组，说明4个预测CTL表位肽P1、P2、P3、P4与HLA_A*0201的复合物均具有较高的稳定性。五、预测Pokemon HLA_A*0201限制性CTL表位肽促进特异性的CTL应答检测
实验分为5组P1组(预测CTL表位肽Pl )、P2组(预测CTL表位肽P2)、P3组(预测CTL 表位肽P3)、P4组(预测CTL表位肽P4)和阴性对照组(无关表位肽AAVEEVRAL)。1、预测CTL表位肽体外诱导特异性的CTL
采用聚蔗糖-泛影葡氨分层液密度梯度离心法从HLA-A*0201阳性健康者的外周血浓缩白细胞中分离出外周血单个核细胞(PBMC)。将PBMC用RPMI 1640培养基在温度37°C、CO2 气体体积分数为5%的条件下孵育2小时，分离非贴壁细胞[主要为淋巴细胞(PBL)]和贴壁细胞[树突状细胞(DC)]。将DC按细胞密度为2X106/3ml加入含有浓度为800IU/ml的集落刺激因子(GM-CSF)、浓度为1000 IU/ml的白介素4 (IL-4)以及浓度为10% (w/w)的FCS 的RPMI 1640培养基，在温度为37°C、0)2气体体积分数为5%的条件下培养，每2天半量换液并补充GM-CSF和IL-4，第5天加入终浓度为lOng/ml的肿瘤坏死因子(TNF- α )，第7天获得成熟DC。向成熟DC中加入终浓度为IOM的肽(按实验分组加入相应肽)，在温度37°C、 CO2气体体积分数为5%的条件下孵育2小时，30Gy放射性处理，获得负载肽的DC。按PBL 与DC的数量比为3 1 6 1向PBL中加入负载肽的DC,再按PBL细胞密度为1. 5 X 106/2ml加入含有浓度为10ng/ml的白介素7 (IL-7)以及浓度为10% (w/w)的FCS的RPMI 1640培养基，在温度为37°C、0)2气体体积分数为5%的条件下培养，第11天加入负载肽的DC再次刺激培养的PBLJ4 48小时后向细胞培养液中加入浓度为10IU/ml的白介素2 (IL-2)并补充IL-7至终浓度为lOng/ml，之后每隔7天按照上述相同方法再次刺激培养的PBL，连续刺激4次，获得肽特异性CTL，用含有浓度为10% (w/w)的FCS的RPMI1640培养基调整至适当浓度，作为效应细胞。2、肽特异性CTL对靶细胞的体外杀伤能力检测
将IX IO6个神经胶质瘤细胞U251转移至离心管中，用含有浓度为10% (w/w)的FCS的 RPMI1640培养基洗涤1次，吸除大部分上清液，剩余约0. Iml培养基于管底，重悬细胞，加入相应量的51Cr溶液，在温度为37°C、0)2气体体积分数为5%的条件下培养2小时，获得51Cr 标记的靶细胞。在96孔板中，每孔分别按效靶比(E/T)为100 1,50 1和25 1加入效应细胞与上述51Cr标记的靶细胞，每种效靶比设3个复孔，同时设最大释放孔(用浓度为 2mol/L的盐酸替代效应细胞)和最小释放孔[用含有浓度为10% (w/w)的FCS的RPMI1640 培养基替代效应细胞]。将96孔板1200r/min离心30秒，温度37°C孵育4小时，向最大释放孔中加入终浓度为21 (w/w)的Triton X-100并吹打混勻，孵育10分钟，再将96孔板 1200r/min离心5分钟，分别吸取各孔上清液至SiCr计数管，用计数仪计数，计算不同效靶比时的杀伤率。结果如图11所示，可见Pl组、P2组、P3组和P4组在各效靶比对U251细胞均有特异性杀伤作用，且随着效靶比增大，特异性杀伤作用逐渐增强，说明4个预测CTL表位肽 PI、P2、P3、P4均能有效激发CTL的细胞毒活性，从而特异性杀伤靶细胞。 3、肽特异性CTL分泌IFN- γ的能力检测
采用ELISP0T检测试剂盒进行检测，具体操作参照试剂盒说明书调整效应细胞密度至IXio6Ail，取100 μ 1铺板，加入终浓度为IOM的肽(按实验分组加入相应肽)，刺激48小时后去除细胞，按试剂盒说明书依次加入一抗、二抗和显色剂进行反应，显色晾干后读数。结果如图12所示，可见Pl组、P2组、P3组和P4组的斑点数均明显高于阴性对照组，说明4个预测CTL表位肽PI、P2、P3、P4均具有良好的免疫原性，能够有效激发CTL分泌 IFN- γ。综合上述实验结果4个预测CTL表位肽PI、P2、P3、P4均能以高亲和力结合 HLA-A*0201，所形成的复合物稳定，能够诱导肽特异性的CTL应答，刺激肽特异性CTL分泌高水平的IFN-Y并对肿瘤细胞产生特异性杀伤效应，可得出以下结论4个预测CTL表位 Pl、P2、P3和P4均为肿瘤抗原Pokemon的HLA_A*0201限制性CTL表位，其对应的表位肽 P1、P2、P3和P4可用于制备肿瘤治疗性肽疫苗，例如神经胶质瘤治疗性肽疫苗。最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过参照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。
权利要求
1.肿瘤抗原Pokemon的HLA_A*0201限制性CTL表位，其特征在于氨基酸序列如SEQ ID No. 1、SEQ ID No. 2、SEQ ID No. 3 或 SEQ ID No. 4 所示。
2.权利要求1所述的肿瘤抗原Pokemon的HLA_A*0201限制性CTL表位在制备肿瘤治疗性肽疫苗中的应用。
3.根据权利要求2所述的肿瘤抗原Pokemon的HLA_A*0201限制性CTL表位的应用，其特征在于所述肿瘤治疗性肽疫苗为神经胶质瘤治疗性肽疫苗。
全文摘要
本发明属于生物医药领域，特别涉及肿瘤抗原Pokemon的HLA-A*0201限制性CTL表位及其应用，该CTL表位的氨基酸序列如SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3或SEQ ID No.4所示，能够以高亲和力结合HLA-A*0201，形成的复合物稳定，能够诱导肽特异性的CTL应答，刺激肽特异性CTL分泌高水平的IFN-γ并对肿瘤细胞产生特异性杀伤效应，可用于制备肿瘤治疗性肽疫苗例如神经胶质瘤治疗性疫苗，在肿瘤特异性免疫治疗领域有着潜在、良好的开发应用前景。
文档编号A61P35/00GK102229648SQ201110171178
公开日2011年11月2日 申请日期2011年6月23日 优先权日2011年6月23日
发明者吴玉章, 杨曌 申请人:中国人民解放军第三军医大学