专利名称：Wnt/β-catenin信号通路抑制剂在制备促进细胞凋亡的药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于分子遗传生物学领域，涉及Wnt/ii-catenin信号通路抑制剂在制备促进细胞凋亡的药物中的应用。
背景技术：
β -连环蛋白(β -catenin)作为Wnt信号通路中的核心转录因子，在卵巢发育过程中发挥着重要作用，其表达缺失或者突变都会引起Wnt/β-catenin信号转导紊乱，从而对机体组织或细胞产生重要影响。敲除Wnt4可导致小鼠在出生前部分的性反转以及卵母细胞的衰竭，在敲除β-catenin的小鼠颗粒细胞中形成内含紊乱和多形性粒层细胞的卵泡样结构，可导致颗粒细胞癌的发生。以上这些发现说明Wnt/β -catenin对颗粒细胞的增殖、分化以及存活有深刻的影响，进而对卵巢正常功能的维持有着重要的作用。然而，这一结论还需要更多的实验支持。目前，本领域对于在体外实验中，β -catenin是促进细胞凋亡还是抗凋亡还存在着争议。但过表达β-catenin可以促进细胞的凋亡已有以下报道KW0nse0p Kim等发现过表达β-catenin将会诱导小鼠胚胎成纤维细胞的不同程度的凋亡，Marc S. Raab等发现过表达β -catenin将会诱导MM和HeLa细胞的凋亡。关于β -catenin是通过何种机制诱导细胞凋亡的争论比较大，一些研究认为 P53信号通路，pl4ARF，cyclinDl，而一些研究认为LEF-I和细胞周期蛋白Gl没有参与 β -catenin诱导的凋亡，最新的研究表明，β -catenin还了能通过C-Jun/p73调节一些肿瘤细胞的凋亡。而关于β-catenin是通过何种机制在卵巢颗粒细胞里诱导凋亡还不清楚。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供Wnt/ β -catenin信号通路抑制剂在制备促进细胞凋亡的药物中的应用。本发明的另一目的是提供一种促进颗粒细胞凋亡的方法。本本发明的目的可通过如下技术方案实现Wnt/β-catenin信号通路抑制剂在制备促进细胞凋亡的药物中的应用。优选所述的Wnt/ β -catenin信号通路抑制剂在制备促进颗粒细胞凋亡的药物中的应用。其中，所述的Wnt/β -catenin信号通路抑制剂优选β -catenin的siRNA。进一步优选正义链序列为SEQ ID No. 1，反义链序列为SEQ ID No. 2的β -catenin 的 siRNA，用 β-catenin-siRNA 表示。一种促进颗粒细胞凋亡的方法，是用正义链序列为SEQ ID No. 1，反义链序列为 SEQ ID No. 2的β -catenin的siRNA转染颗粒细胞。其中siRNA浓度优选75nM，转染时间优选36h。
有益效果本发明针对β -catenin基因设计化学合成β -catenin-siRNA，通过脂质体转染颗粒细胞以敲减猪卵巢颗粒细胞内的β-catenin基因。经过多次实验摸索，确定了最有效干扰链，以及干扰浓度为75nM，作用时间为36小时。利用Armexin-V/PI双染流式细胞仪测定75ηΜ β-catenin-siRNA转染颗粒细胞时，转染效率为64. 49%。并通过荧光定量 PCR 和 Westen blot 检测转染 β -catenin_siRNA36 小时后 β -catenin 基因 mRNA 和蛋白表达量，来进一步确认β-catenin-siRNA的干扰效率。结果显示，同空白对照组相比FAM-siRNA转染组β -catenin基因mRNA表达水平下调59. 93%，蛋白水平下调，差异显著(P <0.05)，而阴性对照组差异不显著。由此可以说明β-catenin-siRNA能够有效地抑制β -catenin基因的表达，从而抑制Wnt/ β -catenin信号通路。利用Annexin-V/PI双染流式细胞仪检测转染β -catenin-siRNA的颗粒细胞的凋亡情况，结果显示，当β -catenin 表达被抑制后，与空白组相比，实验组凋亡细胞数明显增加由8. 80%上升到15. 85%，差异显著(P < 0. 05)。说明β -catenin-siRNA作为Wnt/β -catenin信号通路抑制剂，能够促进颗粒细胞的凋亡。Bax和BCL-2分别属于BCL-2家族的原凋亡基因和抗凋亡基因，是线粒体凋亡通路中的主要调节者。本发明利用real time RT-PCR验检测两个跟凋亡相关的基因Bax和BCL-2在β -catenin诱导的颗粒细胞凋亡过程中的变化，结果显示，在敲减 β -catenin的猪卵巢颗粒细胞里，BCL_2mRNA的表达量下降了 44. 28%,Bax的mRNA表达量上调了 32. 76%。
图IFAM-SiRNA转染颗粒细胞48h荧光显微镜㈧和光镜⑶观察结果Q00X)。图2流式细胞术分析FAM-siRNA转染效率；A 空白对照组；B =FAM转染组。图3real time RT-PCR检测转染siRNA后β-catenin mRNA的表达变化，数据用 means士S. D表示，每次实验设3个重复，并至少独立实验3次。与空白对照组相比，统计学意义上的显著差异用*(P < 0. 05)表示。图 Western Blotting 检测 β-catenin 蛋白的表达变化。图5细胞凋亡散点分布图，A 空白对照组B =NCsiRNA阴性对照组C β -catenin-siRNA 实验组。图6沉默β -catenin对细胞凋亡相关基因的表达的影响，差异显著用*表示P < 0. 05。
具体实施例方式实施例11. 1猪卵巢的采集与卵泡的选择采集新鲜猪卵巢，置于含有庆大霉素的生理盐水，在37°C的环境下运送到实验室， 选择健康的卵巢为实验材料。1. 2颗粒细胞分离及培养实验之前，将细胞培养基和PBS置于无菌细胞室中的水浴锅中37°C预热，并将实验所需器材放入细胞间灭菌，培养瓶和高压灭菌过的离心管以及ImL枪头放入超净工作台；将卵巢用含双抗生理盐水冲洗2次，用PBS清洗3-4次，用酒精棉擦洗两次，选择直径为2-5mm的卵泡进行颗粒细胞采集；使用带有20g针头的注射器抽取2_8mm直径卵泡的卵泡液及卵泡壁上的颗粒细胞，并用无菌的钢制滤网(孔径100 μ m)滤掉其中的卵母细胞，800g 离心;3min ；弃上清，将余下的颗粒细胞用DMEM/F12培养基清洗一次，再离心(SOOgdmin)； 用DMEM/F12培养基重悬细胞，0. 2%台盼兰染色测定细胞活力。用DMEM/F12培养基(含10%胎牛血清、青霉素和链霉素)稀释细胞，并以血细胞计数板计数；将细胞以IO6个/mL密度接种于培养瓶中，轻轻晃动培养瓶，使细胞分散均勻， 置于37°C、5% CO2的培养箱内培养；细胞每天换一次培养基。1. 3细胞传代(1)当细胞汇合达75% -95%时，即可对细胞进行传代。(2)轻轻晃动培养瓶，使瓶内未贴壁的细胞脱落，倒掉培养基。加入aiiLPBS缓冲液，轻轻晃动培养瓶，充分洗去残留的培养基。重复一次。(3)缓缓向细胞培养瓶内加入ImLO. 25%胰蛋白酶(不含0. 02% EDTA)消化液，并轻轻晃动，使胰蛋白酶溶液均勻地覆盖瓶底。(4)快速将培养瓶放入培养箱Ι-aiiin后取出，显微镜下观察，待大多数细胞游离后，立即用2-3ml含10%胎牛血清的培养基终止消化。(5)分瓶扩大培养原代细胞按1 2-3传代。1. 4siRNA的设计合成根据GenBank提供的猪β -catenin基因序列(序列号NM_214367. 1)，分别针对 964、854、365 位点设计 β -catenin 的 siRNA(命名为 β -catenin-siRNA)，不带有荧光标 i己，分另U称为 β -catenin-siRNA-964> β _catenin_siRNA_854、β _catenin_siRNA_365,由上海吉玛公司化学合成。荧光标记的无义序列为FAM-NC-siRNA。表1 siRNA 序列
权利要求
1.ffnt/^-catenin信号通路抑制剂在制备促进细胞凋亡的药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述的Wnt/β -catenin信号通路抑制剂在制备促进颗粒细胞凋亡的药物中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于所述的Wnt/β-catenin信号通路抑制剂为 β -catenin 的 siRNA。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于所述的β-catenin的siRNA正义链序列为 SEQ ID No. 1，反义链序列为 SEQ IDNo. 2。
5.一种促进颗粒细胞凋亡的方法，其特征在于用正义链序列为SEQ ID No. 1，反义链序列为SEQ ID No. 2的β -catenin的siRNA转染颗粒细胞。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于所述的β-catenin的siRNA浓度为75nM， 转染时间为36h。
全文摘要
本发明属于分子遗传生物学领域，公开了Wnt/β-catenin信号通路抑制剂在制备促进细胞凋亡的药物中的应用。其中，所述的Wnt/β-catenin信号通路抑制剂优选β-catenin的siRNA。本发明针对β-catenin基因设计化学合成β-catenin-siRNA，通过脂质体转染颗粒细胞以敲减猪卵巢颗粒细胞内的β-catenin基因。结果显示，当β-catenin表达被抑制后，与空白组相比，实验组凋亡细胞数明显增加由8.80％上升到15.85％，差异显著，说明β-catenin-siRNA能够促进颗粒细胞的凋亡。
文档编号A61K48/00GK102266561SQ201110197240
公开日2011年12月7日 申请日期2011年7月14日 优先权日2011年7月14日
发明者侯艳君, 张宝乐, 徐银学, 王莉 申请人:南京农业大学