一种生物纳米材料及其制备方法和核酸复合物的制作方法

专利名称：一种生物纳米材料及其制备方法和核酸复合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种生物纳米材料及其制备方法，以及一种核酸复合物。
背景技术：
纳米材料由于具有特殊的力、热、声、光、电磁等性质，有非常广阔的应用。与传统晶体材料相比，纳米材料具有高强度、高扩散性、高塑性、低密度、低弹性模量、高电阻、高比热、高热膨胀系数、低热导率等性能。这些特殊性能使纳米材料可广泛地用于高力学性能环境、光热吸收、非线性光学、磁记录、特殊导体、分子筛、超微复合材料、催化剂、热交换材料、敏感元件、烧结助剂、润滑剂等领域。近年来，各种纳米材料更是广泛的应用于生物医药领域，可以利用纳米材料进行细胞分离、细胞内部染色，甚至可以用于制备纳米抗菌药以及用于细胞移植和器官移植。
生物纳米材料作为纳米材料的重要分支，受到越来越多的关注。如用于基因药物领域，作为基因治疗中基因药物的载体。从基因角度，基因治疗是用正常有功能的基因置换或增补缺陷基因的方法，从治疗方面，是将新的遗传物质转移至某个体的细胞内使其获得治疗效果。基因治疗作为疾病治疗的一种新手段，愈来愈受到人们的重视和关注。自1989年Rosenberg首次将基因标记导入黑色素瘤病以后，基因治疗的发展日新月异。而作为基因药物载体的纳米材料主要有金属纳米颗粒、无机非金属纳米颗粒、生物降解性高分子纳米颗粒和生物活性纳米颗粒等。无论哪种应用，对于生物纳米材料来说，都面临一个共同的问题，即如何精确控制纳米材料的粒度，因为粒度对纳米颗粒的功能有较大的影响。而各种纳米材料的制备方法，无论是物理方法，如真空冷凝法、物理粉碎法、机械球磨法，或是化学方法，如气象沉积法、沉淀法、水热合成法、溶胶凝胶法、微乳液法，都很难获得粒度均一的纳米颗粒。因此，迫切需要开发一种能够精确控制生物纳米材料的粒度的方法。与此同时，核酸药物领域也存在如下问题所述核酸药物是指各种具有不同功能的寡聚核糖核苷酸RNA或寡聚脱氧核糖核苷酸DNA，主要作用于基因水平，在信息传递的上游阶段起作用，高效且通过结合或裂解作用特异地针对致病基因。在信息流的传递过程中，信号逐级放大，一个基因可转录出多个mRNA，一个mRNA又可翻译出多个蛋白质。所以与作用于信息流最终产物-蛋白质相比，核酸药物具有更广泛的应用前景。核酸药物作为抗病毒药物，以低毒性、不产生抗药性等特点，被广泛应用于临床。由于核酸分子尤其是RNA分子容易被细胞中的各种核酸酶降解，因此，细胞对核酸的摄取效率很低，核酸药物在使用上必须要解决体内传输问题，因而核酸药物的传输一直都是本领域的研究热点。目前，核酸药物的输送方式主要为以高分子聚合物为载体和以病毒为载体进行的输送，如各种阳离子聚合物、逆转录病毒、慢病毒等。但是它们仍存在转染效率低和安全性差的问题。

发明内容
本发明的目的在于提供一种能够精确控制粒度的生物纳米材料的制备方法，并且提供由该方法制得的含有核酸药物的生物纳米材料和核酸复合物，该生物纳米材料和核酸复合物具有极高的稳定性，从而同时解决了两个亟待解决的技术难题。本发明的发明人经过多年的科学研究，发现烟草花叶病毒的组装过程能够人工调控，并且，由于其病毒颗粒为棒状，长度为300nm，直径为18nm，是天然的生物纳米材料，因此，本发明的发明人另辟蹊径，以烟草花叶病毒为模型，进行了以精确控制生物纳米材料粒度为目的的研究，从而完成了本发明。根据本发明的第一方面，本发明提供一种生物纳米材料的制备方法，其特征在于，该方法包括选择所需长度的核酸并将该核酸与蛋白进行组装孵育，得到该生物纳米材料，所述核酸能够起始与所述蛋白之间的组装，所述组装孵育的条件使得所述核酸被所述蛋白包裹，从而核酸酶不能通过包裹核酸的蛋白与核酸接触；其中，所述核酸的长度与所述 生物纳米材料的粒度之间成线性关系，选择所需长度的核酸的方法包括，根据所需生物纳米材料的粒度确定所需核酸的长度。根据本发明的第二方面，本发明提供由上述的方法制得的生物纳米材料，其特征在于，该生物纳米材料中的所述核酸为核酸药物。根据本发明的第三方面，本发明提供一种核酸复合物，该核酸复合物含有载体和负载在载体上的核酸药物，其特征在于，所述载体为蛋白，所述核酸药物被蛋白所包裹，且核酸酶不能通过包裹核酸药物的蛋白与核酸药物接触。本发明提供的方法通过精确控制核酸的长度实现了精确控制生物纳米材料的粒度。通过透射电镜的检测，证明通过本发明的方法制得的生物纳米材料，具有良好的均一性，而且80%以上的生物纳米材料的粒度与制得的所有生物纳米材料的平均粒度的差别都在平均粒度的10 %之内，这是通过常规的纳米材料的制备方法难以实现的。此外，根据本发明的方法所制备的生物纳米材料，可以通过极其方便的手段进行修饰，并且可修饰的物质范围广泛，只要在不破坏生物纳米材料完整性的条件下，能与蛋白表面的氨基酸残基发生反应的物质，都可以对该生物纳米材料进行修饰，通过修饰不同类型的物质，能够得到具有不同性能的功能生物纳米材料。本发明的生物纳米材料和核酸复合物对核酸酶的抗性极好，血清稳定性实验，即测试例I表明，其在血清中能够稳定至少30天而不被血清中的核酸酶降解，而单独的核酸只能在血清中稳定O. 5小时。这说明本发明的生物纳米材料和核酸复合物具有极大的稳定性，血清稳定性的提高将极大的改变核酸药物的转染效率，因此，作为小核酸药物进入细胞的媒介，本发明的生物纳米材料和核酸复合物能够降低小核酸药物被降解的比例，大大提高其转染效率。由于本发明的生物纳米材料和核酸复合物的转染效率得到提高，因此可以在较低的使用浓度下达到所需的药物效果，还有利于降低其毒性。


图I为本发明一种实施方式中得到的生物纳米材料进行核酸酶抗性实验后的聚丙烯酰胺凝胶电泳图；图2为本发明一种实施方式中得到的生物纳米材料的 Μ图3为本发明另一种实施方式中得到的生物纳米材料的 Μ图；图4为本发明再一种实施方式中得到的生物纳米材料的TEM图；图5为本发明一种实施方式中核酸药物的二级结构。
具体实施例方式本发明提供一种生物纳米材料的制备方法，其特征在于，该方法包括选择所需长度的核酸并将该核酸与蛋白进行组装孵育，得到该生物纳米材料，所述核酸能够起始与所述蛋白之间的组装，所述组装孵育的条件使得所述核酸被所述蛋白包裹，从而核酸酶不能通过包裹核酸的蛋白与核酸接触；其中，所述核酸的长度与所述生物纳米材料的粒度之间成线性关系，选择所需长度的核酸的方法包括，根据所需生物纳米材料的粒度确定所需核酸的长度。本发明的核心在于选择合适的体系，在该体系中，核酸和蛋白以及组装得到的生 物纳米材料具有上述的各项性能，其中，根据所需生物纳米材料的粒度确定所需核酸的长度方法有多种，例如，所述根据所需的生物纳米材料的粒度确定所需核酸的长度的方法可以包括以下步骤(I)确定生物纳米材料的长度与所述核酸的长度之间的比例关系；设所述核酸的长度与所述生物纳米材料的粒度符合线性方程Y = aX，其中，X为所述核酸的长度，单位为核酸中核苷酸的数目，Y为所述生物纳米材料的粒度，单位为纳米，a为比例系数；选取两种以上具有不同长度的所述核酸，长度分别记为XjIjXm，其中m表示选取的具有不同长度的核酸的数目，m为大于I的整数；将所述具有不同长度的核酸分别与蛋白进行组装孵育，得到相应的生物纳米材料，测定每个生物纳米材料的粒度，相应的记为Y1到Ym，以Y对X作图，通过线性拟合得到a值；(2)将所需的生物纳米材料的粒度Y’代入步骤⑴中得到的线性方程，计算所需核酸的长度V。而对于很多已知体系，比例系数a值均已为本领域技术人员所知。本发明对所述核酸和蛋白的序列和来源没有明确的要求，只要满足上述要求即可，在自然界中，很多棒状病毒结构或类棒状病毒结构具有能够满足上述要求的组装机制，因此，优选地，所述生物纳米材料具有与病毒相同或类似的结构，进一步优选地，具有与烟草花叶病毒相同或类似的结构，其中，所述蛋白相当于病毒的壳蛋白，所述核酸相当于病毒的核酸中的至少一部分，优选地，所述核酸相当于病毒的核酸中的一部分。本发明中，所述壳蛋白，也称衣壳蛋白，为本领域公知的概念，指组成病毒衣壳的蛋白质，在病毒颗粒中负责包被病毒核酸和核酸-蛋白质复合体。 在本发明的一种优选实施方式中，本发明的发明人选取烟草花叶病毒和与烟草花叶病毒结构类似的结构作为制备所述生物纳米材料的体系。烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus, TMV)颗粒全长300nm,它是2130个壳蛋白亚基围绕一条6395个核苷酸的RNA呈右手螺旋状堆积而成的棒状结构，其基因组序列为SEQ ID N0:3所示(Genbank号为V01408. I)，每一个壳蛋白亚基与3个核苷酸相互作用，因此可以得知，平均每21. 3个核苷酸对应着lnm，即a = O. 047。烟草花叶病毒的壳蛋白和RNA可以在体外进行组装，组装反应分为起始和延伸两个阶段，起始阶段是由烟草花叶病毒基因组RNA上的起始组装位点(SEQ ID NO 2,TMV oriRNA，其核酸序列为5’-GAG ACGGAG GGC CCA UGG MC UUA CAG MG MG UCG UUG AUG AGU UCA UGG AAG AUG UCC CUA UGUCGA-3’，位于烟草花叶病毒基因组中5447-5515位置)与壳蛋白(TMV CP,SEQ ID NO 4)相互识别实现的，起始组装步骤是病毒组装的关键，研究表明，烟草花叶病毒组装的延伸步骤对RNA的碱基序列和长度没有特别的要求，即是说，只要序列中存在起始组装位点，就可以引发组装的进行，直到所有的核酸都被包被为止。烟草花叶病毒的这个特性是控制其组装过程的基础。根据本发明，所述核酸优选为核糖核酸，本发明的发明人在研究中发现，所述能够起始与烟草花叶病毒蛋白的组装的核酸可以为含有SEQ ID NO: I所示序列的RNA，所述SEQID NO :1是相对于SEQ ID NO 2更核心的能够起始组装的RNA序列，其核酸序列为5’_UUACAG AAG AAG UCG UUG UGA-3，。
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本领域技术人员能够了解到，根据烟草花叶病毒的组装机制，只要RNA序列中含有SEQ ID NO :1，优选地，含有SEQ ID NO :2，就能够与烟草花叶病毒壳蛋白进行体外组装，并使得全部RNA序列被壳蛋白包裹，避免受到核酸酶的降解，这种性质与RNA中除SEQ IDNO 1或SEQ ID NO 2以外的序列的长度和碱基类型并没有关系，也就是说，可以在SEQ IDNO 1或SEQ ID NO 2的两段添加任意长度和任意序列的单链核糖核酸，均能够实现全部RNA序列被壳蛋白包裹。根据本发明，具有上述性质的核糖核酸可以通过各种常规的分子生物学手段获得，例如，首先得到编码该核糖核酸的DNA模板，然后通过体外转录得到该核糖核酸，所述体外转录的方法已为本领域技术人员公知。而得到所述DNA模板的方法例如可以为PCR的方法，对于目的为获得烟草花叶病毒基因组中的部分核糖核酸的方法来说，可以以烟草花叶病毒基因组cDNA为模板，设计相应的引物，通过PCR的方法获得。所述设计引物的方法为本领域技术人员公知，例如可以利用生物学软件Primer Premier、Oligo、DNAMAN等辅助进行设计。所述烟草花叶病毒基因组cDNA的获得方法也已为本领域技术人员所公知。例如，可以提取烟草花叶病毒基因组RNA，通过反转录获得。对于其他的含有SEQ ID NO :2的核糖核酸，也可以通过体外转录获得，其DNA模板可以为PCR产物，也可以为固相合成的DNA片段。对于本领域技术人员来说，获得一段已知序列的RNA的方法是公知的，在此不再赘述。虽然在本发明的实施例中，仅涉及烟草花叶病毒的RNA和壳蛋白。但是本发明并不是利用了烟草花叶病毒的某种或某些特殊性质，而是基于烟草花叶病毒的核酸与壳蛋白符合本发明所述的方法特征，因此，本领域技术人员可以毫无疑义的确定，只要具有这种特征的体系，都可以采用本发明的方法对生物纳米材料的粒度进行精确控制，并进一步进行各种修饰，因此，本发明并不局限于烟草花叶病毒体系以及野生型的烟草花叶病毒。如所述核酸可以为烟草花叶病毒的起始组装位点的突变体，所述蛋白可以为与烟草花叶病毒壳蛋白的氨基酸序列具有90%以上同源性的突变体，所述具有90%以上同源性的突变体只要满足能够与SEQ ID No : I所示序列的核酸进行自组装即可，优选地，能够与SEQ ID No :2所示序列的核酸进行自组装即可，所述自组装能够使得到的生物纳米材料具有核酸酶抗性。在本发明的一种实施方式中，突变体为153位苏氨酸突变为半胱氨酸的突变体(T153C)，另一种实施方式中，突变体为141位精氨酸突变为半胱氨酸的突变体(R141C)。T153C和R141C均可与含有SEQ ID NO :2的RNA组装形成所述生物纳米颗粒，并且，由于半胱氨酸上的巯基基团是高活性反应基团，形成的生物纳米颗粒还可以在温和的条件下，与多种亲核或亲电试剂反应，如与金纳米颗粒反应，形成具有其他性质和功能的纳米颗粒。因此，本领域技术人员应该可以确定，本发明的方法并不限于烟草花叶病毒；其他具有类似特征的病毒，或能够满足本发明的核酸和蛋白也应在本发明的保护范围内。本发明对所述核酸的长度没有特别的限定，但是当所述核酸为单链RNA时，过长的单链RNA较难获得任意长度的纯品，因此，优选地，所述核酸的长度为20-20000个核苷酸，进一步优选为100-6400个核苷酸，对于与烟草花叶病毒类似的结构来说，得到的生物纳米颗粒的长度相应为5-300nm。根据本发明的方法，当所用体系为烟草花叶病毒体系时，所述组装孵育的条件优选为烟草花叶病毒的壳蛋白与烟草花叶病毒的核酸能够进行体外自组装的条件。具体优选地，所述组装孵育在缓冲溶液中进行，所述组装孵育的条件包括离子强度可以为O. 05-0. 2 摩尔，优选为O. 8-1. 2摩尔，最优选为O. 9-1. I摩尔；pH值可以为6. 5-7. 5，优选为6. 8-7. 2，最优选为6. 9-7. I ;温度可以为10-40°C，优选为20-25°C;时间可以根据所需生物纳米材料的粒度确定，一般地，时间为O. 1-12小时，优选为1-4小时。所述缓冲溶液优选为磷酸缓冲液和/或焦磷酸缓冲液。根据本发明，所述制备生物纳米材料的方法还包括在所述生物纳米材料的内外表面修饰功能层，所述修饰功能层的方法包括，在保持生物纳米材料完整性的条件下，将能够与所述蛋白表面的活性基团发生反应的物质与所述生物纳米材料混合。所述保持生物纳米材料完整性的条件是指不会使核酸暴露于溶液中从而被核酸酶降解的条件。根据本发明，所述蛋白表面的活性基团优选为处于蛋白表面，在溶液中能够发生反应的巯基、羟基、氨基、羧基等基团中的至少一种。根据本发明，所述修饰的功能层并不限于一层，可以在已经修饰了功能层的生物纳米材料继续修饰功能层，只要修饰的物质能够与已经修饰的功能层上的活性基团继续进行反应，且不破坏生物纳米材料的完整性即可。根据本发明，能够与所述蛋白表面的活性基团发生反应的物质优选为金纳米颗粒、反应性荧光基团和靶向性基团中的至少一种。所述金纳米颗粒可以通过Au-S键与所述生物纳米材料上连接。在烟草花叶病毒表面修饰金纳米颗粒的方法已为本领域技术人员公知，因此，在本发明的方法得到的生物纳米材料上修饰金纳米颗粒的方法也可为常规的修饰方法(如Dual-surface modification of the tobacco mosaic virus, J Am Chem Soc,2005，127，3718-23 中所描述的)。本发明中，所述靶向性基团即与靶向性物质连接的基团。所述靶向性物质为叶酸、甘露糖、半乳糖、具有导向作用的短肽和适配子中的一种或多种。对于特定的目标细胞，本领域技术人员能够选择合适的靶向性基团，达到特异性靶向目标细胞的目的。本发明中，所述粒度指生物纳米材料随核酸长度的变化而变化的方向上的长度。例如，对于棒状的烟草花叶病毒颗粒来说，粒度即本领域常规所指的病毒颗粒的长度，如，野生型烟草花叶病毒颗粒的粒度为300nm。本发明提供由上述的方法制得的生物纳米材料，其特征在于，该生物纳米材料中的所述核酸为核酸药物。本发明中，所述核酸药物的长度包括用于起始组装的核酸的长度与起到药物作用的核酸的长度之和，优选地，所述核酸药物的长度为40-300个核苷酸，进一步优选为50-200个核苷酸。相应的，所述生物纳米材料的颗粒大小优选为1-50纳米，进一步优选为2-10纳米，细胞对具有这样尺寸的生物纳米材料的通透性没有任何障碍，当所述生物纳米材料具有与烟草花叶病毒相同或相似的结构时，所述核酸药物的长度就决定了生物纳米材料的颗粒大小。由于本发明中所述生物纳米材料可以不为球形，因此，所述生物纳米材料的颗粒大小指的是颗粒最长径的长度。根据本发明，优选地，所述核酸药物为茎环结构，所述茎环结构能够被核糖核酸酶降解成含有siRNA序列的片段，所述茎环结构中的环部分和部分茎部分形成含有SEQ IDNO 1所示序列的核酸片段(如图5所示)，只要核酸药物中含有SEQ ID NO 1所示的序列即可启动与烟草花叶病毒壳蛋白之间的组装，并引导下游序列的延伸，并且，较短的启动序列能够降低生物纳米材料的尺寸，便于其进入细胞；所述茎环结构中的环部分和部分茎部分进一步优选形成含有SEQ ID NO :2所示序列的核酸片段；所述核糖核酸酶优选为Dicer 核酸酶。本发明中，术语“核酸药物”为本领域公知的概念，是指各种具有不同功能的寡聚核糖核苷酸RNA或寡聚脱氧核糖核苷酸DNA。如siRNA，本发明中，所述核酸药物可以指siRNA，也可以指通过Dicer酶切割能够得到siRNA的核酸，如本发明中SEQ ID No :9所示的含有siRNA和能够起始组装的序列的核酸。术语茎环结构(Stem-loop，或译主干-循环)指一种分子内碱基配对方式，与因此形成的结构，可发生于单股DNA，但在RNA分子中更为常见。当形成的循环较小时，也称为发夹(hairpin)或发夹环，此种结构会在某些条件下产生，通常是因为同一分子内的两个区域的核苷酸排列具有回文现象，这会使两段序列因为碱基的配对而形成一个状似棒棒糖的双螺旋结构，使RNA产生二级结构。Dicer酶是RNase III家族中特异识别双链RNA的一员，它能以一种ATP依赖的方式逐步切割由外源导入或者由转基因，病毒感染等各种方式引入的双链RNA，切割将RNA降解为19-21bp的双链RNAs (siRNAs)，每个片段的3’端都有2个碱基突出。本发明还提供一种核酸复合物，该核酸复合物含有载体和负载在载体上的核酸药物，其特征在于，所述载体为蛋白，所述核酸药物被蛋白所包裹，且核酸酶不能通过包裹核酸药物的蛋白与核酸药物接触。根据本发明，优选地，该核酸复合物具有与病毒相同或类似的结构，作为所述载体的蛋白相当于病毒的壳蛋白，所述核酸药物相当于病毒的核酸中的至少一部分，优选地，该核酸复合物具有与烟草花叶病毒相同或类似的结构。所述核酸复合物的结构特征与上述生物纳米材料的结构相同，在此不再赘述。根据本发明，优选地，作为所述载体的蛋白为与烟草花叶病毒壳蛋白具有90%以上同源性的蛋白，且作为所述载体的蛋白能够起始与所述核酸药物的组装；所述核酸药物具有茎环结构，所述茎环结构能够被核酸酶降解成含有siRNA序列的片段，所述茎环结构中的环部分和部分茎部分形成含有SEQ ID NO :1所示序列的核酸片段，所述茎环结构中的环部分和部分茎部分优选形成含有SEQ ID NO :2所示序列的核酸片段；所述核酸酶优选为Dicer核酸酶。根据本发明，优选地，作为所述载体的蛋白为烟草花叶病毒的壳蛋白。根据本发明，优选地，所述核酸药物为RNA药物，且所述核酸药物的长度为40-300个核苷酸，进一步优选为50-200个核苷酸。此处对所述载体和核酸药物的描述与前述对生物纳米材料中的蛋白和核酸药物的描述一致，在此不再赘述。需要特别明确的是，本发明中要求保护的生物纳米材料(核酸复合物)仅是结构与病毒相同或类似，由于其序列与病毒的基因组完全不同，因此，并不具备侵染、自我复制等生物活性，即，本发明中的生物纳米材料(核酸复合物)并不会感染生物体。下面，通过实施例对本发明的方法进行更详细的说明。
其中，烟草花叶病毒按照Leberman的聚乙二醇沉淀法(Leberman. R. Isolation ofplant viruses by means of simple coacervates. Virology, 1966,30 :341-347.)提纯TMV植物病毒(普通株)的方法提取；烟草花叶病毒壳蛋白采用Fraenkel-Conrat的冰醋酸法制备得到；烟草花叶病毒RNA的提取采取酚/氯仿/异戊醇抽提法；烟草花叶病毒cDNA用TMV RNA作为模板通过反转录获得；所有引物委托上海博尚生物技术有限公司合成；Fastpfu DNA聚合酶和4 XdNTPs购自北京全式金生物技术有限公司，微球菌核酸酶购自宝生物工程有限公司；Gold核酸染料购自Invitrogen公司；T7RNA聚合反应使用RiboMAX Large Scale RNA Production Systems_T7试剂盒完成；其他分子生物学操作步骤参考《分子克隆》(冷泉港实验室出版社，第三版)进行，其他常规试剂均购自上海生工生物工程有限公司。DNA 合成仪EXPEDI TE Nucleic Acid System 8909 (Applied Biosystems)；紫外可见分光光度计Cary IOOBio(Varian);荧光可见分光光度计VARIANCARYEclipse (Varian);突光仪恒温系统CARYPCB 100 water peltier system (Varian)；台式高速冷冻离心机HERMLE Z 323K (HERMLE LABOR TECHNIK) ;DNA测序电泳槽EC160 (Thermo Electron) ；pH计pH S-25型(雷磁)；超级微量恒温器HW_8B型(上海浦江分析仪器厂)。透射电镜EM400ST(Philips)；凝胶成像系统=Universal HoodII(BIORAd)。本发明实施例中，通过核酸酶抗性实验测定所述核酸和所述蛋白是否能够组装成能够抵抗核酸酶降解的生物纳米材料(核酸复合物)。烟草花叶病毒核酸酶抗性实验的方法和基本原理已为本领域技术人员公知，即，在烟草花叶病毒体外组装条件下，将核酸和蛋白进行组装一段时间，然后加入核糖核酸酶(本发明实施例中所用为微球菌核酸酶)消化，如果蛋白不能将核酸组装，那么核酸会被核糖核酸酶消化，相反地，核糖核酸酶对组装后的核酸不起作用。因此，核糖核酸酶消化后，对反应体系进行变性，使蛋白和核酸分离，将核酸沉淀下来，并通过PAGE进行检测，即可通过观察从反应体系中抽提出的核酸是否保持原有的长度和量来判断蛋白和核酸是否进行了组装，或者说，判断核酸和蛋白组装成的生物纳米材料(核酸复合物)是否具有核酸酶抗性。一般地，电泳中，以与进行组装反应相同量的该核酸作为阳性对照；以不加入蛋白，直接对与上述组装反应相同量的该核酸进行核糖核酸酶消化的体系作为阴性对照(其中的核酸完全被消化)，以检验结果的可靠性。制备例I
本制备例用于制备烟草花叶病毒壳蛋白采用Fraenkel-Conrat的冰醋酸法制备TMV壳蛋白。在4 V储存的TMV病毒液(病毒含量l_5mg/mL)中加入2倍体积的冰醋酸，在4°C振荡1-2小时，IOOOOXg离心30min除去RNA沉淀,取上清液加入等体积蒸懼水,4°C冰箱中用双蒸水透析2_3天，每天换水3-4次，当TMV-CP接近等电点(pH4左右)时开始凝聚，加入数滴3mol/L的NaAcO缓冲液(ρΗ4· 7)使其沉淀完全。12000rpm离心30min,用4°C、离子强度O. 1M、ρΗ7· O的磷酸缓冲液溶解沉淀，4000rpm离心lOmin，上清液即为TMV-CP。根据文献报道，利用A282吸收计算TMV-CP的浓度C(mg/mL) = A282/1. 27，计算为20mg/mLo制备例2通过megaprimer定点突变方法进行突变，得到突变体T153C的DNA序列；将该DNA序列与载体pET21b构建为重组质粒，并在大肠杆菌BL21中表达，通过6 XHis标签进行亲 和纯化(Ni-NTA柱，购自Qiagen公司)，用蛋白浓缩管(Amicon)浓缩后得到突变体T153C蛋白，浓度为I. 2μ g/uL。制备例3通过megaprimer定点突变方法进行突变，得到突变体R141C的DNA序列；将该DNA序列与载体pET21b构建为重组质粒，并在大肠杆菌BL21中表达，通过6 XHis标签进行亲和纯化(Ni-NTA柱，购自Qiagen公司)，用蛋白浓缩管(Amicon)浓缩后得到突变体R141C蛋白，浓度为1.4yg/uL0实施例I该实施例用于说明本发明提供的制备生物纳米材料的方法。制备粒度精确控制在50nm的生物纳米材料。(I)选择烟草花叶病毒的体系，烟草花叶病毒颗粒的长度与RNA长度的关系符合Y=aX的方程，其中Y为颗粒的粒度，单位为nm，X为RNA的长度，单位为核苷酸的数目，计算得知a等于O. 047，目标生物纳米材料的粒度为50nm，选择所需核糖核酸，为烟草花叶病毒基因组第4467-5523位之间的RNA片段(其序列中包含SEQ ID No 2)；(2)以烟草花叶病毒的cDNA为模板，以上游引物Pl和下游引物P2为引物进行PCR,获得所需核糖核酸的模板DNA，各组分用量见表I。其中，Pl序列为 5’ -TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGT AAC AAT AGG CCA GCT CGCA-3’ (SEQ ID NO :5)，其中划线部分为T7RNA聚合酶的识别位点(以下类同)，为了增强转录效率，识别位点末端增加了两个G碱基。P2 序列为 5，-AAG CCT GAT CGA CAT AGG GAC A-3’ (SEQ ID NO 6)。PCR 扩增程序为，94°C，5min ；94°C, I. 5min ；53°C, Imin ；72°C, Imin ；25 个循环；72°C，5min ;4°C保持。通过I %的琼脂糖凝胶电泳进行纯化，得到模板DNA片段Dl。表I
权利要求
1.一种生物纳米材料的制备方法，其特征在于，该方法包括，选择所需长度的核酸并将该核酸与蛋白进行组装孵育，得到该生物纳米材料，所述核酸能够起始与所述蛋白之间的组装，所述组装孵育的条件使得所述核酸被所述蛋白包裹，从而核酸酶不能通过包裹核酸的蛋白与核酸接触；其中，所述核酸的长度与所述生物纳米材料的粒度之间成线性关系，选择所需长度的核酸的方法包括，根据所需的生物纳米材料的粒度确定所需核酸的长度。
2.根据权利要求I所述的方法，其中，所述根据所需的生物纳米材料的粒度确定所需核酸的长度的方法包括以下步骤 (1)设所述核酸的长度与所述生物纳米材料的粒度符合线性方程Y= aX，其中，X为所述核酸的长度，单位为核酸中核苷酸的数目，Y为所述生物纳米材料的粒度，单位为纳米，a为比例系数；选取两种以上具有不同长度的所述核酸，长度分别记为X1到Xm，其中m表示选取的具有不同长度的核酸的数目，m为大于I的整数；将所述具有不同长度的核酸分别与蛋白进行组装孵育，得到相应的生物纳米材料，测定每个生物纳米材料的粒度，相应的记为Y1到Ym，以Y对X作图，通过线性拟合得到a值； (2)将所需的生物纳米材料的粒度Y’代入步骤(I)中得到的线性方程，计算所需核酸的长度V。
3.根据权利要求I或2所述的方法，其中，所述生物纳米材料具有与病毒相同或类似的结构，所述蛋白相当于病毒的壳蛋白，所述核酸相当于病毒的核酸中的至少一部分，优选地，该生物纳米材料具有与烟草花叶病毒相同或类似的结构。
4.根据权利要求3所述的方法，其中，所述核酸为核糖核酸，且所述核酸含有SEQIDNO :1所示的序列，优选地，所述核酸含有SEQ ID NO :2所示的序列。
5.根据权利要求3所述的方法，其中，所述核酸的长度为20-20000个核苷酸。
6.根据权利要求3所述的方法，其中，所述蛋白为与烟草花叶病毒壳蛋白的氨基酸序列具有90%以上同源性的突变体，且该蛋白能够与含有SEQ ID ΝΟ:1所示序列的核酸进行自组装。
7.根据权利要求6所述的方法，其中，所述蛋白为烟草花叶病毒的壳蛋白。
8.根据权利要求3-7中任意一项所述的方法，其中，所述组装孵育的条件为烟草花叶病毒的壳蛋白与烟草花叶病毒的核酸能够进行体外自组装的条件。
9.根据权利要求8所述的方法，其中，所述组装孵育在缓冲溶液中进行，所述组装孵育的条件包括，缓冲溶液的离子强度为O. 05-0. 2摩尔，pH值为6. 8-7. 2，温度为10_40°C，时间为O. 1-12小时。
10.根据权利要求1-9中任意一项所述的方法，其中，该方法还包括在所述生物纳米材料的内外表面修饰功能层，所述修饰功能层的方法包括，在保持生物纳米材料完整性的条件下，将能够与所述蛋白表面的活性基团发生反应的物质与所述生物纳米材料混合。
11.根据权利要求10所述的方法，其中，能够与所述蛋白表面的活性基团发生反应的物质为金纳米颗粒、反应性荧光基团和靶向性基团中的至少一种。
12.权利要求1-11中任意一项所述的方法制得的生物纳米材料，其特征在于，该生物纳米材料中的所述核酸为核酸药物。
13.根据权利要求12所述的生物纳米材料，其中，所述核酸药物为RNA药物，所述核酸药物的长度为40-300个核苷酸。
14.根据权利要求13所述的生物纳米材料，其中，所述核酸药物为茎环结构，所述茎环结构能够被核糖核酸酶降解成含有siRNA序列的片段，所述茎环结构中的环部分和部分茎部分形成含有SEQ ID NO :1所示序列的核酸片段，所述茎环结构中的环部分和部分茎部分优选形成含有SEQ ID NO 2所示序列的核酸片段；所述核糖核酸酶优选为Dicer核酸酶。
15.一种核酸复合物，该核酸复合物含有载体和负载在载体上的核酸药物，其特征在于，所述载体为蛋白，所述核酸药物被蛋白所包裹，且核酸酶不能通过包裹核酸药物的蛋白与核酸药物接触。
16.根据权利要求15所述的核酸复合物，其中，该核酸复合物具有与病毒相同或类似的结构，作为所述载体的蛋白相当于病毒的壳蛋白，所述核酸药物相当于病毒的核酸中的至少一部分，优选地，该核酸复合物具有与烟草花叶病毒相同或类似的结构。
17.根据权利要求16所述的核酸复合物，其中，作为所述载体的蛋白为与烟草花叶病毒壳蛋白具有90%以上同源性的蛋白，且作为所述载体的蛋白能够起始与所述核酸药物的组装；所述核酸药物具有茎环结构，所述茎环结构能够被核酸酶降解成含有siRNA序列的片段，所述茎环结构中的环部分和部分茎部分形成含有SEQ ID NO :1所示序列的核酸片段，所述茎环结构中的环部分和部分茎部分优选形成含有SEQ ID NO :2所示序列的核酸片段；所述核酸酶优选为Dicer核酸酶。
18.根据权利要求17所述的核酸复合物，其中，作为所述载体的蛋白为烟草花叶病毒的壳蛋白。
19.根据权利要求15所述的核酸复合物，其中，所述核酸药物为RNA药物，且所述核酸药物的长度为40-300个核苷酸。
20.根据权利要求15-19中任意一项所述的核酸复合物，其中，所述核酸复合物通过将所述载体和所述核酸药物进行组装获得，优选地，所述组装的条件为烟草花叶病毒的壳蛋白与烟草花叶病毒的核酸能够进行体外组装的条件。
全文摘要
本发明提供一种生物纳米材料的制备方法，其特征在于，该方法包括选择所需长度的核酸并将该核酸与蛋白进行组装孵育，得到该生物纳米材料，所述核酸能够起始与所述蛋白之间的组装，所述组装孵育的条件使得所述核酸被所述蛋白包裹，从而核酸酶不能通过包裹核酸的蛋白与核酸接触；其中，所述核酸的长度与所述生物纳米材料的粒度之间成线性关系，选择所需长度的核酸的方法包括，根据所需生物纳米材料的粒度确定所需核酸的长度。本发明还提供了根据上述方法制得的生物纳米材料以及一种核酸复合物。本发明提供的方法通过精确控制核酸的长度实现了精确控制生物纳米材料的粒度。本发明的生物纳米材料和核酸复合物对核酸酶的抗性极好。
文档编号A61K48/00GK102886049SQ20111020207
公开日2013年1月23日 申请日期2011年7月19日 优先权日2011年7月19日
发明者席真, 高爽, 吕琳, 张偌瑜 申请人:南开大学