专利名称：一种骨靶向药物天冬氨酸六肽丹参素的合成方法及其医疗用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种骨靶向药物天冬氨酸六肽丹參素的合成方法及防治骨质疏松的应用，属于药物制造的技术领域。
背景技术：
骨质疏松症是老年人和绝经妇女的常见病、多发病。其主要的发病机制是机体的骨重建的失衡，骨重建是指去除骨骼局部旧骨代谢形成新骨的过程，是成熟骨组织的ー种重要替换机制，是破骨细胞与成骨细胞ー个成对的、相偶联的细胞活动过程。骨质疏松症是ー种以骨量低下、骨显微结构破坏为特征，导致骨脆性増加、易发生骨折的全身性骨病。骨量低下是指骨组织单位体积内骨质含量減少，骨微结构破坏指骨质中钙逐渐流失，骨小梁变薄、变细、断裂和骨组织内的孔隙增多，最终导致骨脆性増加，骨強度下降，容易发生骨折。骨质疏松症的临床表现主要有全身性的骨痛、驼背、身高缩短和骨折，最常见的骨折部位是胸、腰椎、股骨上端和桡骨远端骨折。骨质疏松性骨折在骨质疏松症患者中的发病 率为20%左右，且呈逐年上升的趋势，成为威胁老年人身心健康和影响生活质量的仅次于心血管疾病的严重疾病。特别是髋部骨折后，使患者失去生活自理能力，长期卧床易并发感染、心血管疾病。骨质疏松症国际骨质疏松基金会的统计数据显示，骨质疏松症目前危害着全球大约三分之一 50岁以上的女性和五分之一 50岁以上的男性。随着世界人ロ的増加和平均寿命的提高，这种疾病的威胁将越来越大。2008年10月20日在北京发布的《骨质疏松症防治中国白皮书》指出，我国至少有6944万人患有骨质疏松，有2. I亿人患低骨量存在骨质疏松症的风险。预计到2020年我国骨质疏松和低骨量患者将增加至2. 8亿。如果这么大的人群得不到早期干预治疗，其后果将是骨折发生率大大增加，不但给患者带来痛苦和经济负担，也会给医疗资源带来不小的压力。骨质疏松症已成为一个日益突出的社会公共健康问题。目前，治疗骨质疏松症主要有两大类ー类是抑制骨吸收的药物；ー类是促进骨形成的药物。前者有双膦酸盐(羟こ膦酸钠和阿仑膦酸钠等)、降钙素(鲑鱼降钙素和鲠鱼降钙素衍生物)、选择性雌激素受体调节剂、雌激素、活性维生素D和钙剂；后者有氟化物、甲状旁腺素、活性维生素D和合成类固醇等。然而骨组织是ー种特殊的组织，其血流量低、硬度大、滲透性差和生理生化过程特殊，按一般的给药途径很难使药物转运至有效部位，有些药物常需全身给药或者多次给药，才能在骨组织中达到有效的治疗浓度。这样不仅降低了药物的治疗指数，也会对病人的非骨组织或器官造成不必要的毒副作用。如长期应用雌激素治疗骨质疏松症易出现阴道出血、乳房肿痛、子宮内膜增生和静脉血栓等严重不良反应；活性维生素D治疗骨质疏松症呈剂量依赖性，然而增加VD用量时则可能引起高钙血症和高尿血症。为了解决骨质疏松的治疗难题，本课题组对中药进行了长期的研究，已发现丹參素在治疗骨质疏松方面具有较好的作用，丹參素是唇形科植物丹參的主要水溶性成分，化学名为D(+) β-(3，4-ニ羟基苯基)乳酸，其化学结构有许多文献报道，在预防骨质疏松方面已有文献证明丹參的粗提取物对成骨细胞株MC3T3-E1细胞碱性磷酸酶活性有明显的促进作用(丁寅相，华西口腔医学杂，1996)，对人成骨细胞缺血-再灌注损伤有保护作用(王福生，中华现代医学杂志，2000)，对骨折愈合有促进作用(符诗聪，中国中西医结合杂志，1999)。本课题组证明丹參水提物能有效预防糖皮质激素导致的大鼠骨质疏松(崔燎，生物医学工程，2004)，还可阻止去卵巢大鼠牙槽骨的骨丢失(张晓燕，中成药，2007)，丹參水提物和丹參素促进成骨细胞活性和防治泼尼松所致大鼠骨质疏松(崔燎，中国药理学通报，2004)等。关于丹參素的药理学研究，已经证明丹參素能扩张心脑血管，抵抗血小板粘附聚集，清除氧自由基；能抑制细胞内源性胆固醇合成的作用，具有抗脂蛋白氧化的作用，防止 氧化蛋白对细胞的损伤；还能改善微循环，加速血液流速，抵抗血小板凝聚和血栓形成的作用，具有提高机体抗凝和纤溶活性的作用(杨春欣，中国药理学通报，1997)。而本课题组经体外细胞实验还发现丹參素对体外大鼠颅盖骨成骨细胞有直促进增殖、分化和矿化作用，上调成骨细胞骨保护素基因的表达；另外，还可诱导或促进体外培养的骨髄基质细胞成骨分化，抑制其成脂分化。因此我们认为丹參素可预防或治疗骨质疏松症，其可能机制通过直接促进成成骨细胞骨基质的形成及矿化从而对抗骨吸收，和间接通过改善微循环促进成骨源细胞-骨髄基质细胞成骨分化，从而提高骨形成。丹參素属于酚酸类化合物，经研究认为其活性基团是苯乳酸丹參素，其结构较为不稳定，尤其是在碱性环境中，其化学不稳定性可能与其结构中的α -羟基和酚羟基有夫，在水溶液中邻ニ酚羟基的电荷密度増大，易解离形成氧负离子，发生自动氧化生成有色醌类物质，而α-羟基由于羧基的存在变得更活泼，还原性强；丹參素其在人体内代谢较快被代谢，消除半衰期约O. 94h (约56min)(刘琦，药学学报，2003)，在代谢的方式可能是通过α -羟基的こ酰化使其失去活性(裴渭静，分析化学研究简报，2005)。丹參素的这些结构特点，影响了其在体内的应用。天冬氨酸寡肽作为骨靶向药物的载体已应用始于2000年，kasugai等发现几种能与HA结合的非胶原蛋白，在其与羟基磷灰石吸附实验(HA)的可能结合位点处有重复的氨基酸序列，因此合成了小肽(Asp)6，将其与荧光素异硫氰酸偶联，考察它在小鼠体内分布情况及其体外亲和力。实验结果表明在硬组织(牙、骨)中有明显的荧光标记，而在软组织中未发现(Kasugai S, J Bone Miner Res,2000)。以上结果表明，(Asp)6是一个有效的骨革巴向药物载体分子。进ー步研究表明其亲骨性只与其氨基酸数目有夫，与其旋光性无关。考虑到D型氨基酸在体内可能不易被水解，研究者建议使用L-型氨基酸。(L-Asp)6通过连接桥丁ニ酸与雌ニ醇连接得到了抗骨质疏松症化合物E2 ^D6(Sekidc) T, J Drug Target, 2001)和E2 · 17 β D6 (Yokogawa K, Endocrinology, 2001),对HA的亲和カ与原药都增加，体内也显示了较高的骨靶向性，药效显示可防止去卵巢大鼠的骨丢失，而不会引起子宮的不良反应。我们在研究中发现，以天冬六肽与丹參素结合，组成新型的骨靶向药物，可解决丹參素结构的不稳定性及较短半衰期短的问题，同时由于六肽为骨靶向载体，与丹參素结合后可作为丹參素骨靶向载体，増加其在骨组织的分布及沉积，使其更好地发挥抗骨质疏松的作用。
发明内容
合成一种以天冬六肽为骨靶向载体的天冬六肽丹參素，解决丹參素结构的不稳定性及在体内半衰期短，在骨组织中分布少，抗骨质疏松作用不强问题，为骨质疏松临床应用提供新的治疗药物。本发明的主要实施方案是骨靶向丹參素的设计及合成丹參素化合物的结构中含有羧基(见说明书附图
I)，可与氨基形成酰胺键，本设计參考布洛芬与六肽的连接方式(见说明书附图2)，设计将丹參素与天冬氨酸六肽(L-Asp) 6的N端以酰胺键结合得化合物天冬氨酸六肽-丹參素(简称DD6),结构见说明书附图3。我们采用固相合成法对天冬氨酸六肽-丹參素进行合成，方法如下天冬氨酸六肽-丹參素(DD6)的合成设计固相多肽合成采用固定羧基端，即由C向N端合成；先将所要合成肽链的C端氨基酸的羧基以共价键的形式同固相合成树脂相连，然后以结合在树脂上的氨基酸的氨基作为反应活性位点，与下一个氨基酸的羧基反应生成肽键，延长肽链。重复(缩合、洗涤、去保护、中和、洗涤和下ー轮缩合)操作，达到所要合成的肽链长度，最后将肽链从树脂上切割下来，经过纯化等处理，即得所要的多肽。
固相多肽合成包括固相合成树脂、氨基酸保护策略以及肽键缩合试剂三个关键部，目前较为常用的树脂是wang氏树脂，属于ー种酸敏感羟基树脂，其羟基位点可与氨基酸羧基端形成酯键。氨基酸所需保护基团是α-氨基及侧链基团，如今α-氨基的保护常用9-芴甲氧羰基(Fmoc)，其对酸稳定，其可用20%哌啶/DCM或哌啶/DMF轻易脱除，具有反应条件温和，副反应少，产率高等特点，采用Fmoc作为保护基的方法也称为Fmoc合成法。天冬氨酸侧链上存在活泼的羧基基团，目前常用的保护剂是叔丁氧基(OtBu)，对酸较敏感，可用TFA(三氟こ酸)去除，TFA还可用作树脂的切割剂，将肽从树脂上切割下来。本合成选用wang氏树脂作为固相载体将其与合成原料Fmoc-Asp (OtBu) -OH成酯结合之后,再以苯并三氮唑-N，N，N'，N'-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)/I-羟基-苯并-三氮唑(HOBT) /N，N-ニ异丙基こ胺(DIEA)为缩合剂合成连接剩余氨基酸得肽树脂，最后再用适合缩合剂将丹參素(DSU)与肽树脂结合，切割得粗产物。本研究采用多肽固相合成法先合成(L-Asp) 6载体，采用Fmoc保护α-氨基，用20%哌啶/DMF脱除，使用含有侧链保护的Fmoc-Asp (OtBu) -OH为合成原料。氨基酸羧基端先与Wang树脂的羟基位成酯连接后，肽链从C端向N端延伸，得到线型肽树脂后，再脱除氨基保护基，将丹參素的羧基端与肽链的N端缩合后，用含有95% TFA的切割剂割去树脂和侧链保护剂，经冰こ醚沉淀后即得到目标化合物粗品。其合成路线见说明书附图4。天冬氨酸六肽-丹參素(DD6)的合成步骤(一)Fmoc-Asp (OtBu)-O-Wang 树脂的合成(成酯反应)(I)树脂的溶胀称取Wang树脂于预先经DCM处理的反应器中，用DCM溶胀过夜，使树脂充分溶胀，便于反应能够较完全进行，分别用DCM及DMF洗涤树脂，真空泵抽干。(2)Fmoc保护基团的脱除配置20%哌啶/DMF脱除剂，为了能充分脱除Fmoc基团，采用两次脱除法。第一次脱除时间15min，试剂用量15mL/g树脂；第二次，脱除时间15min,试剂用量15mL/g树脂。(3)洗涤依次用DMFX I，DCMX 5、DMFX I进行洗漆，每次氮气鼓吹搅拌约Imin左右。(4)缩合反应将准确称取的Fmoc-Asp (-OtBu) -OH (4倍树脂担载量当量)和HOBt (2倍树脂担载量当量)放入烧杯中，加入45% DMF/THF磁力搅拌，溶解后，置于冰浴中，缓慢加入DIC (2倍当量)，搅拌反应活化20min。然后将此活化酯溶液倒入盛有Wang树脂的反应器(加入树脂前用DCM处理反应器)中；再加DMAP (O. 3倍树脂担载量当量)，室温下通入氮气反应6h。反应结束后用DMF洗3次，加入ニ氯甲烷、こ酸酐和ニこ胺后，室温反应30min以封闭未被酯化的羟基。抽干，用DMF、DCM、MeOH分别洗涤三次，真空干燥树脂。备下步合成用。(ニ)Fmoc-Asp (OtBu) - [Asp (OtBu) ] 4_Asp (OtBu) -O-Wang 树脂的合成(I)反应前树脂的溶胀处理准确称取上所得氨基酸树脂加入反应器中，加入IOmLDCM浸泡，封闭过夜，使树脂充分溶胀。真空抽去溶剂，用DMFX2洗涤lmin，抽干。(2)脱除Fmoc氨基保护基:同2. I. I (2)。(3)洗涤同 2. I. 1(3)。(4)肽键的形成称取HBTU(3倍过量，以树脂上氨基酸物质的量为基准，下同)、HOBT (3倍过量)，磁力搅拌下加入DMF溶解，再加入Fmoc-Asp (-otBu) -OH (3倍过量)溶解，室温搅拌活化30min加入到脱除Fmoc氨基保护树脂中。量取DIEA (6倍过量)，通入氮气室温下反应直到茚三酮检测显示反应完全为止依次用DCM，DMF洗涤。重复步骤(2) (3)，直至六肽皆连接上。用DMF、DCM、MeOH分别洗涤三次，真空干燥树脂。备下步合成用。若缩合效率不高，有必要用50%醋酸酐/吡啶(V/V)在25°C下反应2h，以封闭未反应氨基。(三)天冬氨酸六肽丹參素的合成(I)反应前树脂的溶胀处理准确称取上所得肽树脂加入到烧瓶中，用IOmL DCM浸泡过夜，使树脂充分溶胀。真空抽去溶剂，用3mL DMFX2洗涤，抽干。(2)脱除Fmoc氨基保护基:同2. I. I (2)。(3)洗涤同 2. I. 1(3)。(4)肽键的形成准确称取DSU(等量，与树脂上肽的物质的量为基准，下同)用适当溶剂溶解，再称取HBTU (等量)和HOBT (等量)，经DMF溶解后，一起加入到脱除Fmoc肽保护树脂中，量取加入DIEA(2倍过量)，通入氮气室温下反应。用DMF、DCM、MeOH分别洗涤三次，除去溶剂后，树脂直接于反应器中放置真空干燥箱中干燥。(5)脱除侧链保护及树脂取出反应器，氮气鼓吹下，加入冰的切割剂TFA/TIS/H2O (95/2. 5/2. 5，V/V/V)室温下反应2h。反应结束后，抽滤，收集滤液，用少量TFA洗树脂三次，合并滤液，加入大量无水冰こ醚，离心、洗涤三次，收集沉淀。沉淀经真空干燥，即得合成的天冬氨酸六肽丹參素产品。( ニ)天冬氨酸六肽-丹參素(DD6)的质量控制对所合成的粗品进行高效液相色谱(RP-HPLC)分析，收集主峰，对其进行质谱鉴定。I)样品溶液制备称取所合成的天冬氨酸六肽-丹參素,用O. I % TFA-H2O溶解后用O. 22 μ m滤膜过滤，供RP-HPLC分析备用。2) RP-HPLC 分析条件色谱分析仪器及分析条件如下仪器AngilentHPLC 1200series色谱柱ODSC18 柱(250mmX 4. 6mm, 5 μ m, Hypersil)
流动相A0. I % TFA/H20，B 0. 1% TFA/ こ腈流速lmL/min,检测波长280nm,进样量20 μ L洗脱程序如下
权利要求
1.一种六肽丹參素的合成方法及其医疗用途。
2.如权利要求I所述的ー种六肽丹參素的合成方法是指将丹參素结构中含有的羧基与天冬氨酸六肽的N端以酰胺键结合得化合物天冬氨酸六肽-丹參素，结构见说明书附图3。
3.如权利要求I所述的ー种六肽丹參素的合成方法是指以天冬氨酸六肽为载体的合成方法，其特征是采用多肽固相合成法先合成天冬氨酸六肽载体，采用9-芴甲氧羰基保护α -氨基，用20%哌啶/N，N- ニ甲基甲酰胺脱除，使用含有侧链保护的9-芴甲氧羰基-天冬氨酸(叔丁氧基)-OH为合成原料；氨基酸羧基端先与Wang树脂的羟基位成酯连接后，肽链从C端向N端延伸，得到线型肽树脂后，再脱除氨基保护基，将丹參素的羧基端与肽链的N端缩合后，用含有95%三氟こ酸的切割剂割去树脂和侧链保护剂，经冰こ醚沉淀后即得到目标化合物粗品，其合成路线包括下述步骤 (1)9-芴甲氧羰基-天冬氨酸(_叔丁氧基)-O-Wang树脂的合成(成酯反应) 1)树脂的溶胀称取Wang树脂于预先经ニ氯甲烷处理的反应器中，用ニ氯甲烷溶胀过夜，使树脂充分溶胀，便于反应能够较完全进行，分别用ニ氯甲烷及N，N-ニ甲基甲酰胺洗涤树脂，真空泵抽干； 2)9-芴甲氧羰基保护基团的脱除配置20%哌啶/N，N-ニ甲基甲酰胺脱除剂，为了能充分脱除9-芴甲氧羰基基团，采用两次脱除法。第一次脱除时间15min，试剂用量15mL/g树脂；第二次，脱除时间15min,试剂用量15mL/g树脂； 3)洗涤依次用N，N-ニ甲基甲酰胺XI，ニ氯甲烷X5、N，N-ニ甲基甲酰胺Xl进行洗漆，姆次氮气鼓吹搅拌约Imin左右； 4)缩合反应将准确称取的9-芴甲氧羰基-天冬氨酸(_叔丁氧基)-OH(4倍树脂担载量当量)和HOBt (2倍树脂担载量当量)放入烧杯中，加入45% N，N-ニ甲基甲酰胺/四氢呋喃磁力搅拌，溶解后，置于冰浴中，缓慢加入N，N' -ニ异丙基碳ニ亚胺(2倍当量)，搅拌反应活化20分钟。然后将此活化酯溶液倒入盛有Wang树脂的反应器(加入树脂前用ニ氯甲烷处理反应器)中；再加4-ニ甲氨基吡啶(O. 3倍树脂担载量当量)，室温下通入氮气反应6小吋。反应结束后用N，N-ニ甲基甲酰胺洗3次，加入ニ氯甲烷、こ酸酐和ニこ胺后，室温反应30分钟以封闭未被酯化的羟基。抽干，用N，N-ニ甲基甲酰胺、ニ氯甲烷、MeOH分别洗涤三次，真空干燥树脂； (2)9-芴甲氧羰基-天冬氨酸(叔丁氧基)-[天冬氨酸(叔丁氧基)]4-天冬氨酸(叔丁氧基)-O-Wang树脂的合成 1)反应前树脂的溶胀处理准确称取上所得氨基酸树脂加入反应器中，加入IOmLニ氯甲烷浸泡，封闭过夜，使树脂充分溶胀，真空抽去溶剂，用N，N-ニ甲基甲酰胺X2洗涤I分种，抽干； 2)脱除9-芴甲氧羰基氨基保护基方法同⑴步骤的2)； 3)洗涤方法同(I)步骤的3)； 4)肽键的形成称取苯并三氮唑-N，N，N'，N'-四甲基脲六氟磷酸酯(3倍过量，以树脂上氨基酸物质的量为基准，下同)、1_羟基-苯并-三氮唑(3倍过量)，磁力搅拌下加入N, N- ニ甲基甲酰胺溶解，再加入9-芴甲氧羰基-天冬氨酸(叔丁氧基)-OH (3倍过量)溶解，室温搅拌活化30分钟，加入到脱除Fmoc氨基保护树脂中；量取N，N- ニ异丙基こ胺(6倍过量)，通入氮气室温下反应，直到茚三酮检测显示反应完全为止，依次用ニ氯甲烷，N, N- ニ甲基甲酰胺洗涤。重复步骤2)和3)，直至六肽皆连接上；用N，N- ニ甲基甲酰胺、ニ氯甲烷、MeOH分别洗涤三次，真空干燥六肽树脂； (3)天冬氨酸六肽丹參素的合成 1)反应前树脂的溶胀处理准确称取上所得六肽树脂加入到烧瓶中，用IOmLニ氯甲烷浸泡过夜，使树脂充分溶胀，真空抽去溶剂，用3mLN，N- ニ甲基甲酰胺X2洗涤，抽干； 2)脱除9-芴甲氧羰基氨基保护基方法同⑴步骤的2)； 3)洗涤方法同(I)步骤的3)； 4)肽键的形成准确称取丹參素(等量，与树脂上肽的物质的量为基准，下同)，再称取苯并三氮唑-N，N，N'，N'-四甲基脲六氟磷酸酯(等量)和I-羟基-苯井-三氮唑(等量)，经N，N-ニ甲基甲酰胺溶解后，一起加入到脱除9-芴甲氧羰基肽保护树脂中，量取加入N, N-ニ异丙基こ胺(2倍过量)，通入氮气室温下反应，用N，N-ニ甲基甲酰胺、ニ氯甲烷、MeOH分别洗涤三次，除去溶剂后，树脂直接于反应器中放置真空干燥箱中干燥； 5)脱除侧链保护及树脂取出反应器，氮气鼓吹下，加入冰的切割剂三氟こ酸/三异丙基硅烷/水(95/2. 5/2.5，V/V/V)室温下反应2小时，反应结束后，抽滤，收集滤液，用少量三氟こ酸洗树脂三次，合并滤液，加入大量无水冰こ醚，离心、洗涤三次，收集沉淀；沉淀经真空干燥，即得合成的天冬氨酸六肽丹參素产品。
4.如权利要求I所述的ー种六肽丹參素的医疗用途是指该产品可作为骨靶向药物用于预防和治疗骨质疏松症。
5.如权利要求I所述的ー种六肽丹參素的医疗用途是指该产品可用于预防和治疗心肌梗死，冠心病，动脉粥样硬化，高血脂，肝损伤，抗脑缺血损伤和抗肿瘤。
全文摘要
本发明公开了一种骨靶向药物天冬氨酸六肽丹参素的合成方法，以及其医疗用途，特别是在防治骨质疏松的应用，属于药物制造的技术领域，六肽丹参素的合成方法是将丹参素结构中含有的羧基与天冬氨酸六肽的N端以酰胺键结合得化合物天冬氨酸六肽-丹参素；本发明制备的天冬氨酸六肽-丹参素可靶向作用于骨组织，使骨组织微血管扩张，促进骨的微循环，同时，可以使骨髓基质干细胞向成骨分化，促进成骨细胞形成，增加骨的合成，明显地预防骨质疏松，是临床预防和治疗骨质疏松的良药。进一步的研究发现，这种六肽丹参素由于其在体内不易被氧化，在血液中维持时间较久，还有许多医疗用途，这些医疗用途包括预防和治疗心肌梗死，冠心病，动脉粥样硬化，高血脂，肝损伤，抗脑缺血损伤和抗肿瘤。
文档编号A61K47/48GK102643330SQ20111020236
公开日2012年8月22日 申请日期2011年7月9日 优先权日2011年7月9日
发明者仲利萍, 吕应年, 吴怡, 吴铁, 崔燎 申请人:广东医学院, 湛江广医医药科技开发有限公司