一种猪戊型肝炎病毒抗原表位及其应用的制作方法

专利名称：一种猪戊型肝炎病毒抗原表位及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种肝炎病毒抗原表位，尤其涉及一种猪戊型肝炎病毒抗原表位及其在体外检测和疫苗中的应用。
背景技术：
戊型肝炎病毒Ofepatitis E virus, HEV)是一种经粪、口途径传播的非甲-非乙型肝炎病毒。该病毒会在人群引起暴发流行，主要侵害青壮年，对孕妇可造成20%的病死率。1986-1988年我国新疆南部地区因饮水污染导致戊型肝炎流行，共计发病119280例，死亡707例，是迄今世界上最大的一次戊型肝炎流行。近年来戊型肝炎发病率有逐年增加的趋势，据我国卫生部统计，戊肝发病率2003年比2002年上升40. 4%。因此，戊肝防控已列入各级公共卫生机构的工作日程。近年来研究发现，HEV可以感染猪、牛、羊、鼠和鸡等动物。其中，病毒在猪和鼠的抗体阳性率高于50%，由此推测动物是HEV传播的重要中间宿主。基因序列分析表明，从动物体内分离的戊型肝炎病毒与人的HEV有极高的基因同源性，并且已有人食用野猪肉和鹿肉而感染戊肝的报道，证明戊肝是一种可以通过食物传播的人畜共患疫病。葛胜祥等(中国人兽共患病杂志，2003，19 ), 108-109)对我国20个省、市和自治区的120个养猪场的 8626只成年猪进行了 HEV血清学调查，结果表明平均感染阳性率为83. 4%，其中最高省份为内蒙古(100%)，最低为湖北(68%)。鉴于我国HEV居高不下的感染率，对猪戊肝病毒的表位进行研究，建立特异、有效的猪戊肝检测方法，研制安全、有效的猪戊肝疫苗，了解的流行发病规律，阻断该病由猪向人的传播，对于保证人民的健康安全意义重大。国内第二军医大学的学者 Qi (Journal of Virological Methods 1995，5，55-66) 分析了人HEV假定的开放阅读框0RF1、0RF2、0RF3的蛋白顺序，合成了 7个肽，发现其中3 个肽具有免疫原性，可用作HEV的诊断。美国学者Meng(Virology 2001,288,203-211)从人HEV 0RF2中扩增出不同大小的交互重叠的重组肽段，发现其中的片段之一——pB166 为中和表位，可用作HEV的疫苗开发及诊断。日本学者Niikura(Virology 2002,293, 273-280)报道了人HEV-VLP的C末端11个氨基酸肽段具有免疫原性，能够诱导产生抗体。厦门大学的学者^iang(Vaccine 2005,23,2881-2892)发现人HEV外壳蛋白394-606 位肽段以二聚体的形式可与HEV人血清强烈反应，用作疫苗可抗猕猴的实验感染。印度学者 Deshmukh (Vaccine 2007，25，4350-4360)报道表达的完整人 HEV 0RF2 蛋白和 0RF2 内部 458-607位肽段具有免疫原性，起到中和作用。可用作疫苗的开发。但是，到目前为止，还没有猪HEV开放阅读框0RF1、0RF2和0RF3相关的蛋白表位的系统筛选报道。虽然猪戊肝研究越来越得到全世界的重视，但目前国内外对猪戊肝的研究多限于局部区域的流行病学调查和一些简单的动物感染试验。在猪戊肝防控研究方面尚有以下有待回答问题和技术瓶颈。目前还没有猪戊肝病毒的表位研究报道，市场上用于猪戊肝检测的试剂盒是用于人戊肝检测的试剂盒。虽然猪戊肝病毒与人戊肝病毒序列同源性很高，但是他们之间毕竟还是有些差别，用人的戊肝病毒表位来检测猪戊肝病毒导致检测的特异性 (Speciality)不强，不能特异反映出猪戊肝流行规律。

发明内容
本发明的一个目的在于提供一种猪戊型肝炎病毒抗原表位。本发明的另一个目的在于提供一种用于猪戊型肝炎体外检测的多肽。本发明的又一个目的在于提供一种用于制备猪戊型肝疫苗的多肽。本发明利用计算机软件从猪戊型肝炎病毒全基因组开放阅读框0RF1、0RF2和 0RF3的对应蛋白中筛选识别表位。表位识别的主要依据是蛋白质或多肽氨基酸序列的亲水性、表面度、柔韧度、Chou-Fasman的螺旋、片状和转角、Robson-Garnier的二级结构及C-和 N-末端来预测抗原综合数据(Antigenic Index, Al) 0利用现有的软件，如GCG (Madison， Wisconsin, USA)及 DNAStar (Madison, Wisconsin, USA)从猪 HEV 的 0RF1、0RF2 和 0RF3 的蛋白中计算AI和辅助识别抗原区。根据猪HEV的0RF1、0RF2和0RF3的已知蛋白质取得的氨基酸序列，再用计算机程序来估计它们的抗原区(Al)( 一般10到15个氨基酸)。一种猪戊型肝炎病毒抗原表位，其氨基酸序列如下Val-Glu-His-Asn-Pro-Lys-Arg-Leu-Glu-Ala-Ala-Tyr-Arg-Glu-Thr-Cys-Ser-A rg-Arg-Gly-Thr-Ala-Ala-Tyr-Pro-Leu-Leu-Gly-Ala-Gly-IIe-Tyr-Lys-Val-Pro-Val-Gl y-Leu-Ser-Phe-Asp-Ala-Trp-Glu-Arg-Asn-His-Arg-Pro—Gly-Asp-GlUo另一种猪戊型肝炎病毒抗原表位，其氨基酸序列如下Ser-Asp-Ser-Val-Leu-Thr-Phe-Glu-Leu-Thr-Asp-Ile-Val-His-Cys-Arg-Met-A Ia-Ala-Pro-Ser-Gln-Arg-Lys-Ala-Val-Leu-Ser-Thr-Leu-Val-Gly-Arg-Tyr-Gly-Arg-Ar g-Thr-Lys-Leu-Tyr-Glu-Ala-Ala-His-Ala-Asp-Val-Arg-Gly-Ser。另一种猪戊型肝炎病毒抗原表位，其氨基酸序列如下Pro-Arg-Gln-Pro-Ala-Arg-Pro-Leu-Gly-Ser-Ala-Trp-Arg-Asp-Gln-Ser-Gln-A rg-Pro-Ala-Ala-Ser-Thr-Arg-Arg-Arg-Pro-Ala-Pro-Ala-Gly-Ala-Ser-Pro-Leu-Thr-Al a-Val-Ala-Pro-Ala-Pro-Asp-Thr-Ala-Pro-Val-Pro-Asp-Val-Asp-Ser-Arg-Gly-Ala-Ile -Leu-Arg-Arg-Gln-Tyr-Asn-Leu-Ser0另一种猪戊型肝炎病毒抗原表位，其氨基酸序列如下Pro-Val-Ser-Ile-Ser-Ala-Val-Gly-Val-Leu-Ala-Pro-His-Ser-Ala-Leu-Ala-I Ie-Leu-Glu-Asp-Thr-Ala-Asp-Tyr-Pro-Ala-Arg-Ala-His-Thr-Phe-Asp-Asp-Phe-Cys-Pr O-Glu-Cys-Arg-Ser-Leu-Gly-Leu-Gln-Gly-Cys ο通过分析，多月太 Leu-Gly-Ala-Thr-Ser-Pro-Ser-Ala-Pro-Pro-Leu-Pro-Pro-Val-Val-Asp-Leu、、多月太 Pro-Pro-Val-Val-Asp-Leu-Pro-Gln-Leu-Gly、多月太 Leu-Ala-Leu-Gly -Ser-Gln-Pro-Val-His-Ser-Ala-Pro-Leu-Gly-Ala-Thr-Ser-Pro-Ser-Ala-Pro-Pro-Leuλ 多肽 Pro-Gln-Leu-Gly-Leu-Arg-Arg 禾口多肽 Leu-Ala-Leu-Gly-Ser-Gln-Pro-Val-His-Se r-Ala-Pro-Leu-Gly-Ala-Thr-Ser-Pro-Ser-Ala-Pro-Pro-Leu-Pro-Pro-Val-Val-Asp-Leu 是猪戊型肝炎病毒抗原表位的重要组成部分，是抗体结合抗原识别表位不可或缺的重要组成部分，这些多肽可以单独、一种多肽的N端与另一种多肽C端的连接或连接于其它多肽的 N端或C端，所述的这些多肽单独或共同对猪戊型肝炎的体外检测及免疫抗体的制备起到
重要作用。另一种猪戊型肝炎病毒抗原表位，其氨基酸序列如下Ser-Pro-Ser-Pro-Ser-Pro-IIe-Phe-IIe-Gln-Pro-Thr-Pro-Ser-His-Leu-Thr-P he-Gln-Pro-Gln-Pro-Gly-Leu-Glu-Leu-Ala-Leu-Gly-Ser-Gln-Pro-Val-His-Ser-Ala-Pr o-Leu-Gly-Ala-Thr-Ser-Pro-Ser-Ala-Pro-Pro-Leu-Pro-Pro-Val-Val-Asp-Leu-Pro-Gln -Leu-Gly0另一种猪戊型肝炎病毒抗原表位，其氨基酸序列如下Leu-Ala-Leu-Gly-Ser-Gln-Pro-Val-His-Ser-Ala-Pro-Leu-Gly-Ala-Thr-Ser-P ro_Ser_Ala_Pro_Pro_Leu_Pro_Pro_Val_Val_Asp_Leu_Pro_Gln_Leu_Gly_Leu_Arg_Arg0另一种猪戊型肝炎病毒抗原表位，其氨基酸序列如下Leu-Gly-Ala-Thr-Ser-Pro-Ser-Ala-Pro-Pro-Leu-Pro-Pro-Val-Val-Asp-Leu-P ro-Gln-Leu-Gly-Leu-Arg-Arg。另一种猪戊型肝炎病毒抗原表位，其氨基酸序列如下Leu-Ala-Leu-Gly-Ser-Gln-Pro-Val-His-Ser-Ala-Pro-Leu-Gly-Ala-Thr-Ser-P ro-Ser-Ala-Pro-Pro-LeUc上述多肽可以通过化学合成的方式完成。化学合成采用Fmoc方法，通过固相合成技术合成。该方法的具体步骤参见Eur. J. Immunol. 1994，24，3188-3193 J. Org. Chem. 1972，37，3404-3409 ；黄惟德，陈常庆多肽合成，北京科学出版社，1985。上述多肽还可以通过与其它多肽或蛋白形成融合蛋白抗原，融合蛋白抗原可以通过基因工程方式制得，即通过目标融合蛋白的DNA转导/转化至基因工程菌株，如大肠杆菌(E. coli)、酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)中表达并纯化，或在中国仓鼠卵巢 (CHO)细胞、COS细胞、小仓鼠肾(BHK)细胞、小鼠骨髓瘤SP2/0细胞、小鼠NSO胸腺瘤细胞等哺乳动物细胞中表达并纯化后，得到将其中一种抗原C末端，经由酰胺键(amide bond)和另一种抗原N末端首尾相连的融合蛋白产物(Protein Expr. Purif.，2008，59，189-196)。基因工程方法制备蛋白质抗原的克隆、表达以及纯化可通过多种方法进行。具体方法参见《分子克隆实验指南》(第三版)，科学出版社，2002，第1217-1270页。适宜的原核表达载体如PEGX系列原核表达载体(Amersham Pharmacia)、pET系列原核表达载体 (Novagen)等。特别优选pGEX_4T_2载体。对于不同肽段融合的抗原，本领域众所周知其构建原则和方法。具体而言，为了不影响待融合肽段的各自的功能需要在不同肽段之间添加一个接头。关于接头的选择具体可参见 Protein Eng.，2001，14，529-532。由上述多肽单独或组合或融合而形成的抗原用于检测应答猪戊型肝炎病毒而产生的抗体。具体而言，这些多肽在猪戊型肝炎体外检测中的应用。检测方法可以有多种，例如间接酶联免疫测定技术、双抗原夹心酶免疫测定技术、 金标快速检测技术、免疫渗滤检测技术和蛋白芯片检测技术等。间接酶联免疫测定，即间接 ELISA是最常用的检测方法。间接ELISA方法基本原理是多肽(抗原)包被在酶标板表面，将稀释后的待检血清/血浆和对照物加入反应板孔中，如果被检血清/血浆中存在抗体，经温育后，则血清 /血浆中特异性抗体与反应板孔中的抗原多肽结合，形成固相抗原-抗体复合物，洗去未结合的血清/血浆中其它成分，加入酶标记的抗人IgG抗体，温育，固相抗原(多肽)结合的抗体再与酶标记的抗人IgG抗体结合，洗去未结合的酶标记抗体成分，加入酶底物，并被催化成为有色产物，最后加入终止液终止反应。根据对照物，可对抗体进行定量或定性测定。上述多肽单独或组合或融合而形成的抗原用于制备抗猪戊型肝炎病毒抗体。本发明技术方案实现的有益效果本发明通过计算机软件筛选和实验验证得到了猪戊肝病毒的抗原表位。一方面可以将其单独或组合应用于快速特异猪戊肝诊断试剂盒，用于猪戊肝的快速诊断，特别是研制疫苗免疫抗体和自然隐性感染抗体的鉴别诊断技术用于猪戊肝流行的监控；另一方面也可以设计特异、安全和高效的猪戊肝疫苗用于猪戊肝的预防、控制猪戊肝的流行和阻断戊肝由猪向人传播。
具体实施例方式以下详细描述本发明的技术方案，本发明实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解， 可以对发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围， 其均应涵盖在本发明的权利要求范围中。本发明所用的试剂若未明确指明，则均购自西格玛-奥德里奇(Sigma-Aldrich)。实施例1猪戊肝病毒表面抗原利用计算机软件从猪戊型肝炎病毒全基因组开放阅读框0RF1、0RF2和0RF3的对应蛋白中筛选识别表位。表位识别的主要依据是蛋白质或多肽氨基酸序列的亲水性、 表面度、柔韧度、Chou-Fasman的螺旋、片状和转角、Robson-Garnier的二级结构及C-和 N-末端来预测抗原综合数据(Antigenic Index, Al) 0利用现有的软件，如GCG (Madison， Wisconsin, USA)及 DNAStar (Madison, Wisconsin, USA)从猪 HEV 的 ORFl、0RF2 和 0RF3 的蛋白中计算AI和辅助识别抗原区。根据猪HEV的0RF1、0RF2和0RF3的已知蛋白质取得的氨基酸序列，再用计算机程序来估计它们的抗原区(Al)( 一般10到15个氨基酸)。进过分析，分别从ORFl、0RF2和0RF3选定如下多肽ORFl swHEV-1:83-140Ala-Gly-Arg-Cys-Leu-Glu-Val-Gly-Ala-His-Pro-Arg-Ser-Ile-Asn-Asp-Asn-P ro-Asn-Val-Leu-His-Arg-Cys-Phe-Leu-Lys-Pro-Val-Gly-Arg-Asp-Val-Gln-Arg-Trp-Ty r-Thr-Ala-Pro-Thr-Arg-Gly-Pro-Ala-Ala-Asn-Cys-Arg-Arg-Ser-Ala-Leu-Arg-Gly-Leu -Pro-Pro,其相应的DNA序列为swHEVn-1 :281-454ccgggcgctg tcttgaggtg ggtgcccacc cacgttctat taatgacaac cctaacgtcctgcatcgctg ctttcttaaa cctgttggcc gcgacgttca gcggtggtat accgctccta cccgtggccctgcagcaaat tgccggcggt ccgctctccg cgggcttcca cctg。
swHEV-2 :874-925Val-Glu-His-Asn-Pro-Lys-Arg-Leu-Glu-Ala-Ala-Tyr-Arg-Glu-Thr-Cys-Ser-A rg-Arg-Gly-Thr-Ala-Ala-Tyr-Pro-Leu-Leu-Gly-Ala-Gly-IIe-Tyr-Lys-Val-Pro-Val-Gl y-Leu-Ser-Phe-Asp-Ala-Trp-Glu-Arg-Asn-His-Arg-Pro-Gly-Asp-Glu,其相应的DNA序列为swHEVn-2 :2654-2809t c g aa c a taaccccaaa cggctcgagg ccgcctatcg ggagacctgc tcccgacgggggacggctgc ttaccccctg ctcggtgccg gcatatataa ggtccctgtt gggttgagct ttgatgcctgggagcgtaac caccgacccg gggatgaat0swHEV-3 :1295-1346Ser-Asp-Ser-Val-Leu-Thr-Phe-Glu-Leu-Thr-Asp-Ile-Val-His-Cys-Arg-Met-A Ia-Ala-Pro-Ser-Gln-Arg-Lys-Ala-Val-Leu-Ser-Thr-Leu-Val-Gly-Arg-Tyr-Gly-Arg-Ar g-Thr-Lys-Leu-Tyr-Glu-Ala-Ala-His-Ala-Asp-Val-Arg-Gly-Ser,其相应的DNA序列为swhevn-3 3917-4072atag tgtgctcact tttgagetea cggacatagt gcactgccgt atggcagcgc ccagccagcgcaaggcggtc ctgtcaactc ttgtcggcag gtacggccga cgtactaaat tgtacgaggc cgcacacgcagatgtccgcg gatctctgaa tc0swHEV-4 :1521-1582Glu-Ser-Leu-Arg-Gly-Phe-Trp-Lys-Lys-His-Ser-Gly-Glu-Pro-Gly-Thr-Leu-L eu-Trp-Asn-Thr-Val-Trp-Asn-Met-Ala-Val-IIe-Ala-His-Cys-Tyr-Glu-Phe-Arg-Asp-Le u-Lys-Val-Ala-Ala-Phe-Lys-Gly-Asp-Asp-Ser-Val-Val-Leu-Cys-Ser-Asp-Tyr-Arg-Gln -Ser-Arg-Asp-Ala-Ala-Ala,其相应的DNA序列为swhevn-4 :4561-4746gttcgctctg cttgggttct acaggcaccg aaggagt c tc t gcgaggc tt ctggaagaaacactctggtg agcctggcac cctattatgg aataccgttt ggaacatggc tgtcatagca cactgttatgaattccgcga ccttaaggtt gcagcattca agggggacga ttctgttgtg etttge。0rf2 swHEV-5 :90-153Pro-Arg-Gln-Pro-Ala-Arg-Pro-Leu-Gly-Ser-Ala-Trp-Arg-Asp-Gln-Ser-Gln-A rg-Pro-Ala-Ala-Ser-Thr-Arg-Arg-Arg-Pro-Ala-Pro-Ala-Gly-Ala-Ser-Pro-Leu-Thr-Al a-Val-Ala-Pro-Ala-Pro-Asp-Thr-Ala-Pro-Val-Pro-Asp-Val-Asp-Ser-Arg-Gly-Ala-IIe -Leu—Arg-Arg-Gln-Tyr-Asn-Leu—Ser，其相应的DNA序列为swhevn-5 :5422-5607ctcggcagc cagcccgt cc act cggctcc gctt ggcgcg accagtccca gcgccccgccgcttccaccc gtcgtcgacc tgccccagct ggggcttcgc cgttgacggc tgtggctccg gctcctgacactgcacccgt ccctgatgtt gattcccgtg gcgctatctt gcgccgccag tataatt
swHEV-6 :433-476Ala-Gln-Gln-Asp-Lys-Gly-Ile-Ala-Ile-Pro-His-Asp-Ile-Asp-Leu-Gly-Glu-Ser-Arg-Val-Val-Ile-Gln-Asp-Tyr-Asp-Asn-Gln-His-Glu-Gln-Asp-Arg-Pro-Thr-Pro-Ser-Pro-Ala-Pro-Ser-Arg-Pro-Phe,其相应的DNA序列为swhevn-6 :6451-6582ct cagcagga caagggt ata gctatt ccac atgatat t ga t ct cggt gag tcccgtgtggtcattcagga ttatgataat caacatgagc aagaccgccc caccccctct cctgctccct ctcgcccttt ttοswHEV-7 :606-653Pro-Val-Ser-Ile-Ser-Ala-Val-Gly-Val-Leu-Ala-Pro-His-Ser-Ala-Leu-Ala-I Ie-Leu-Glu-Asp-Thr-Ala-Asp-Tyr-Pro-Ala-Arg-Ala-His-Thr-Phe-Asp-Asp-Phe-Cys-Pr O-Glu-Cys-Arg-Ser-Leu-Gly-Leu-Gln-Gly-Cys,其相应的DNA序列为swHEVn-7 :6970-7113c cgtgt ctatt tctgctgttg gtgtccttgc ccctcattct gcgct ggcta ttctggaggacaccgctgat taccctgctc gcgcccatac ttttgatgat ttctgccctg agtgccgttc actcggccttcagggttgtg ctt00RF3 swHEV-8 :22-58Cys-Pro-Arg-His-Arg-Pro-Val-Ser-Pro-Leu-Ala-Val-Ala-Ala-Gly-Gly-Ala-Ala-Ala-Val-Pro-Ala-Val-Val-Ser-Gly-Val-Thr-Gly-Leu-IIe-Leu-Ser-Pro-Ser-Pro-Ser，其相应的DNA序列为swHEVn-8 :5246-5356gcccg cgccaccggc cggtcagccc tctggccgtc gccgcgggcg gcgcagcggcggtgccggca gtggtttctg gggtgaccgg gttgattctc agcccttcgc cctccc。swHEV-9 :55-112Ser-Pro-Ser-Pro-Ser-Pro-Ile-Phe-Ile-Gln-Pro-Thr-Pro-Ser-His-Leu-Thr-P he-Gln-Pro-Gln-Pro-Gly-Leu-Glu-Leu-Ala-Leu-Gly-Ser-Gln-Pro-Val-His-Ser-Ala-Pr o-Leu-Gly-Ala-Thr-Ser-Pro-Ser-Ala-Pro-Pro-Leu-Pro-Pro-Val-Val-Asp-Leu-Pro-Gln -Leu-Gly，其相应的DNA序列为swHEVn-9 :5345-5518cttcgc cctcccctat attcatccaa ccaacccctt cgcatctgac attccagccg cagccggggctggagctcgc cctcggcagc cagcccgtcc actcggctcc gcttggcgcg accagtcccagcgccccgcc gcttccaccc gtcgtcgacc tgccccagct ggggcttc。swHEV-10 :79-114Leu-Ala-Leu-Gly-Ser-Gln-Pro-Val-His-Ser-Ala-Pro-Leu-Gly-Ala-Thr-Ser-Pro-Ser-Ala-Pro-Pro-Leu-Pro-Pro-Val-Val-Asp-Leu-Pro-Gln-Leu-Gly-Leu-Arg-Arg,其相应的DNA序列为SwHEVn-IO :5417-5524tcgc cctcggcagc cagcccgtcc actcggctcc gcttggcgcg accagtccca gcgccccgccgcttccaccc gtcgtcgacc tgccccagct ggggcttcgc cgtt。swHEV-11 :91-114Leu-Gly-Ala-Thr-Ser-Pro-Ser-Ala-Pro-Pro-Leu-Pro-Pro-Val-Val-Asp-Leu-P ro-Gln-Leu-Gly-Leu-Arg-Arg,其相应的DNA序列为Swhevn-ii :5453-5524ttggcgcg accagtccca gcgccccgcc gcttccaccc gtcgtcgacc tgccccagctggggcttcgc cgtt。SwHEV-I2 :79-101Leu-Ala-Leu-Gly-Ser-Gln-Pro-Val-His-Ser-Ala-Pro-Leu-Gly-Ala-Thr-Ser-P ro-Ser-Ala-Pro-Pro-Leu,其相应的DNA序列为Swhevn-12 :5417-5485tcgc cctcggcagc cagcccgtcc actcggctcc gcttggcgcg accagtccca gcgccccgccgcttc。上述序列由GL-Biochem (shanghai) Ltd通过多肽合成仪合成后，再由HPLC纯化得到纯度大于95%的多肽。实施例2猪戊型肝炎病毒表位的筛选先用北京万泰实业生物医药有限公司生产的猪HEV总抗体ELISA试剂盒对采集到的猪血清进行进行鉴定，筛选出猪HEV阳性血清和阴性血清。再用猪HEV阳性血清和阴性血清对实施例1得到的猪HEV多肽进行ELISA鉴定， 筛选出猪HEV表位抗原。其具体步骤如下1.抗原稀释取10 μ 1浓度为10mg/ml的多肽(将5mg合成的多肽溶解在0. 5ml 二甲基亚砜 (DMSO)而得)与90ul PBS液混勻，得到的抗原稀释液溶度为1 μ g/ μ 1。再取15 μ 1抗原稀释液与5ml包被液混勻，得到的抗原稀释溶度为3 μ g/ml。在酶标板上加入抗原稀释溶度 100 μ 1/孔，4°C包被 12h。2.封闭吸去包被夜，每孔加入200μ 1封闭液于37°C封闭2h。封闭液是3%牛血清白蛋白 (BSA) /TBS 液。3.加一抗用PBST液洗板3次，每孔加100 μ 1 1% BSA/TBST液和10 μ 1血清，震荡混勻，置 37°C温育 Ih。4.加二抗用PBST液洗板5次，每孔加100 μ 1辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗猪IgG或IgM(均购自于 Immunology Consultants Laboratory, Inc. ,USA)稀释液，置 37°C温育 lh。 二抗用BSA/TBST液稀释。5.显色用PBST液洗板5次，每孔加底物液100ul，37度显色lOmin。底物液是由IOml柠檬酸缓冲液，0. 4mlTMB和33 μ 1 3% H2O2配置而成的。6.终止每孔加50 μ 1 lmol/1 HCl的终止液来终止反应，用酶标仪测OD值。当(样品OD 值/阴性对照OD值)> 2. 1为阳性，当(样品OD值/阴性对照OD值)< 2. 1为阴性。实验结果见表一、表二和表三。所述试剂如下PBS 液(500ml, ρΗ7· 4) :0. 575g Na2HPO4 和 0. 114g NaH2PO4 加蒸馏水溶解，定容至 Λ 500ml ο包被液(1000ml,ρΗ9· 6) () :1. 59g Na2CO3 和 2. 93g NaHCO3 加蒸馏水溶解，定容至 Λ 1000ml。TBS 液(2000ml, ρΗ8· 6) :16g NaCl、0· 4g KCl 和 2. 42g Trizma-Base 加蒸溜水溶解，定容至入2000ml。TBST 液(1000ml，Tween-20 的浓度为 0· 1 % ) :1000ml TBS 液力Π 入 1. Oml Tween_20o柠檬酸缓冲液(100ml，pH3. 5-4. 0) :0. 84g柠檬酸和0. 294g柠檬酸钠加蒸馏水溶解，定容至入100ml。
终止液(500ml, IM HCl) :40. 88ml浓盐酸溶解于459. 12ml蒸馏水。 表一合成猪HEV多肽与猪HEV阳性血清盘的免疫反应(对于IgG)
阳性参照数量
权利要求
1.一种猪戊型肝炎病毒抗原表位，其序列如SEQ ID No 5所示。
2.权利要求1所述的猪戊型肝炎病毒抗原表位在猪戊型肝炎体外诊断中的应用。
3.权利要求1所述的猪戊型肝炎病毒抗原表位在猪戊型肝炎疫苗制备中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种猪戊型肝炎病毒抗原表位及其应用，所述猪戊型肝炎病毒抗原表位序列如SEQ ID No5所示。通过计算机软件筛选和实验验证得到的猪戊肝病毒的抗原表位，一方面可以将其应用于快速特异猪戊肝诊断试剂盒，用于猪戊肝的快速诊断，特别是研制疫苗免疫抗体和自然隐性感染抗体的鉴别诊断技术用于猪戊肝流行的监控；另一方面也可以设计特异、安全和高效的猪戊肝疫苗用于猪戊肝的预防、控制猪戊肝的流行和阻断戊肝由猪向人传播。
文档编号A61P1/16GK102268078SQ20111020837
公开日2011年12月7日 申请日期2009年4月1日 优先权日2009年4月1日
发明者于瑞嵩, 刘启文, 吴萧, 唐雪明, 朱宏, 李震, 王金斌, 谭芙蓉, 赵凯 申请人:上海市农业科学院