专利名称：一种生地黄水提物在制备雌激素药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及医药新用途，特别是一种生地黄水提物在制备雌激素药物中的应用， 可有效用于治疗由于体内雌性激素分泌不足而引起的相关疾病，如妇女更年期综合症等。
背景技术：
生地黄为玄参科植物地黄(Rehmannia glutinosa Libosch.)的新鲜或干燥块茎。 秋季采挖，除去芦头、须根及泥沙，将其缓缓烘焙至约八成干，即为生地黄。历代名家对其均有论述和研究，认为其性甘、寒，归心、肾、肝经，清热凉血、养阴生津。主治热病舌绛烦渴、阴虚内热、骨蒸劳热、内热消渴、吐血、衄血、血崩、月经不调、胎动不安、阴伤便秘等。现代药理及临床研究表明生地黄能促进凝血、升高外周白细胞；能强心、利尿、升高血压；能保护肝脏，降低血糖；有增强免疫功能、抗辐射损伤和肾上腺皮质激素样作用。但尚未有生地黄关于雌激素样活性方面的研究报道。
发明内容
针对上述情况，本发明的目的就是提供一种生地黄水提物在制备雌激素药物中的应用，有效解决由于体内雌性激素分泌不足而引起的疾病(如妇女更年期综合症等)的用药问题。本发明解决的技术方案是，将生地黄每次用其10倍重量的水煎煮2次，每次2h，合并2次水煎液，减压浓缩干燥得到生地黄浸膏状水提物，该生地黄水提物可有效用于制备治疗由于体内雌性激素分泌不足而引起的相关疾病的药物，实现生地黄水提物在制备治疗由于体内雌性激素分泌不足而引起的相关疾病(如妇女更年期综合症等)药物中的应用。本发明水提物制备方法简单，稳定可靠，并经多次试验，均取得了相同或相近似的结果，方便，成本低，其水提物有效用于制备雌性激素药物，开辟了生地黄药用新用途，临床意义巨大。
图1为本发明的生地黄水提物对ERE调控的报告基因载体ERa瞬时表达的诱导作用图。图2为本发明的生地黄水提物对ERE调控的报告基因载体ER3瞬时表达的诱导作用图。
具体实施例方式以下结合实施例和有关试验资料对本发明的具体实施方式
作详细说明。实施例1本发明在具体实施中，所述的生地黄水提物是，将生地黄(Rehmannia glutinosa Libosch.) IOOg用其10倍重量的水IOOOg (即1000ml)煎煮2次，每次2h，合并两次水煎液，减压浓缩干燥得到生地黄浸膏状水提物，连续反复三次，平均得率为71. 90%，该水提物可制备雌激素药物，用于治疗由于体内雌性激素分泌不足而引起的疾病，如妇女更年期综合症药。实施例2本发明在具体实施中，所述的生地黄水提物是，将生地黄(Rehmarmia glutinosa Libosch.) 200g用其10倍重量的水2000g(即2000ml)煎煮2次，每次2h，合并两次水煎液，减压浓缩干燥得到生地黄浸膏状水提物143. 90g，连续反复三次，平均得率为71. 95%, 该水提物可制备雌激素药物，用于治疗由于体内雌性激素分泌不足而引起的疾病，如妇女更年期综合症药。实施例3本发明在具体实施中，所述的生地黄水提物是，将生地黄(Rehmarmia glutinosa Libosch. )300g用其10倍重量的水3000g(即3000ml)煎煮2次，每次2h，合并两次水煎液，减压浓缩干燥得到生地黄浸膏状水提物215. 20g，连续反复三次，平均得率为71. 73%, 该水提物可制备雌激素药物，用于治疗由于体内雌性激素分泌不足而引起的疾病，如妇女更年期综合症药。根据上述方法按生地黄和水的比例可以通过工业化生产制得任意量的生地黄水提物，用于制备雌激素药物，有效解决由于体内雌性激素分泌不足而引起的疾病(如妇女更年期综合症等)的用药治疗问题，并经试验得到了充分证明，有关试验资料如下采用细胞增殖试验、动物试验及报告基因技术对其进行了充分证明，其有关试验资料如下首先通过MCF-7细胞增殖实验(E-SCREEN)，发现生地黄能够促进MCF-7细胞的增殖，说明其在体外具有雌激素样作用。其次通过小鼠子宫增重实验，证明生地黄能够显著增加性未成熟雌性小鼠的子宫系数，说明其在体内具有雌激素样作用。最后通过ERE调控的报告基因瞬时表达检测技术，进一步验证生地黄提取物是通过与雌激素受体ERi3的结合而发挥雌激素样作用。发明人已通过实验证明了本发明药物在制备雌激素类药物中的新用途。其主要实施方案如下一、实验材料与方法1.实验药物玄参科植物地黄(Rehmannia glutinosa Libosch.)的新鲜或干燥块茎。秋季采挖，除去芦头、须根及泥沙，将其缓缓烘焙至约八成干，即为生地黄。生地黄IOOg以10倍量的水煎煮2次，每次2h，水煎液减压干燥浓缩干燥得到生地黄水提物71.90g(浸膏状)。2.实验动物与细胞株及质粒昆明种小鼠，雌性，出生21天(刚断乳)，体重9 12g，购于河南省实验动物中心。人乳腺癌细胞(MCF-7)由中国军事医学科学院生物工程研究所提供。HEK293细胞株购于中国典型培养物保藏中心。β-半乳糖苷酶(β-galactosidase，β-gal)对照质粒P β gal-Contro 1、重组报告基因pERE_TAL_luc由军事医学科学院生物工程研究所叶棋浓博士惠赠。重组人ER α (humanER α，hER α )表达载体pCXN2_hER α和重组人 ERβ (humanERβ，hERβ )表达载体pCXN2-hERβ由东京大学医学系Satoshi Inoue博士惠赠。3.主要试剂RPMI1640 培养基、小牛血清(Newborn Calf Serum, NCS)和脂质体 Lipofectamine 2000Reagent 购自 Gibco Invitrogen 公司；胎牛血清、无酚红 RPMI1640 培养基、17 β-雌二醇(17 β-estrogen，Ε2)、氨苄青霉素(Amp)、Tris 碱和活性炭(Charcoal) 均购自Sigma公司；葡聚糖T-70(Dextran-70)购自上海化学试剂公司；己烯雌酚片(合肥久联制药)；邻-硝基苯-β -D-半乳吡喃糖苷(O-Nitrophenyl- β -D-galactopy ranoside, 0NPG)、EDTA, MTT 及 DMSO 为 Amresco 公司产品；17-β 雌二醇(E2)为 Sigma 公司产品；Steady-GloR稳定荧光素酶检测系统试剂盒(Steady-Glo^ Luciferase Assay Systerm)、闪亮裂解缓冲液(Glo lysis Buffer)购自Promega公司；胰蛋白胨、酵母粉购自 OXOID公司；感受态大肠杆菌DH5 α (Ε. coli Competent Cells DH5 α )购自 Solarbio 公司； 西班牙琼脂糖为Biowest生产；质粒提取试剂盒(Plasmid Mini Kit I)购自OMEGA公司； 其余试剂均为国产分析纯。4.所用主要仪器普通手术器械；二氧化碳培养箱(REVCO)；倒置显微镜(NIKON ECLIPSE TS100)； KDC-160HR高速低温冷冻离心机(科大创新股份有限公司)；酶标仪(BI0-RAD 680)；纯水仪(Sartorius 611VF) ；90_3磁力搅拌器(上海振捷实验设备有限公司)；ZRD-7080全自动新型鼓风干燥箱(上海智城分析仪器制造有限公司)；微量加样器(Nichipet EX PLUS)； AB204-N电子读数分析天平(梅特勒_托利多仪器(上海)有限公司产品)；IOcm培养皿、 96孔培养板、冻存管均为Corning公司生产；超净工作台(江苏苏净集团)；UV-7504PC型紫外-可见分光光度计(福州健洋科技仪器有限公司)；Veritas 微板光度计(Turner BioSystems公司)；SK6200H型超声波清洗器(上海科导超声仪器有限公司)；电泳仪，电泳槽(北京市六一仪器厂)；HZS-H型水浴振荡器(哈尔滨市东联电子技术开发有限公司)； SHP-150型生化培养箱(上海精宏实验设备有限公司)。5.实验方法5. 1MCF-7细胞增殖实验MCF-7细胞经无酚红含10%去激素血清的RPMI1640培养基培养2周后，选取对数生长期细胞，PBS洗两次，用0. 25 %胰蛋白酶消化后，加入无酚红含2 %去激素血清的 RPMI1640培养基吹打均勻，以2X IO3个/孔的浓度接种于96孔板内，每孔培养总体积为 200 μ L·培养24h待细胞贴壁后，换为含药培养液继续培养。37°C、5%C02培养72h后，每孔加入MTT溶液(5mg/ml) 20 μ 1，37°C继续培养4h，小心吸净培养液，每孔加入150 μ 1DMS0， 震荡5 lOmin，使结晶物完全溶解。以DMSO调零，用酶标仪在490nm下测定各孔吸光度值 (A)，计算平均A值和增殖率(Proliferation Rate，RP)。实验平行重复三次。Rp =(实验组A值/空白组A值F1XlOO^5. 2小鼠子宫增重实验将小鼠按体重均衡和随机的原则分组。给药持续7天。空白对照组每日蒸馏水 0. 2ml · log—1灌胃；阳性对照组每日己烯雌酚悬浊液(0. 35mg · kg—1 · cf1)灌胃；生地黄按临床用药的20倍量X提取率计算，配成相应浓度的混悬液，每日按0. 2ml/10g灌胃灌胃。 最后一次给药24h后，脱颈处死小鼠，立即摘取子宫称重，计算子宫系数(子宫湿重X (体重F1XlOO^ )。实验平行重复三次。结果与空白组相比，计算P值考察有无统计学意义。5. 3ERE调控的报告基因瞬时表达检测5. 3. 1质粒DNA的制备5. 3. 1. 1 质粒 DNA 的转化(1)把感受态细胞置于冰水中融化；(2)取4个无菌1.5mlEP管，各加入50μ 1感受态大肠杆菌DH5a ；(3)分别力卩入 pCXN2_hERa、pCXN2-hERβ、ρ β gal-Control、pERE-TAL-luc 各 3μ ldOng/μ 1)，轻弹混勻；(4)冰浴 30min ；(5)42°〇放置608;(6)冰浴 3min ；(7)加入37°C预温好的LB液体培养基950 μ 1，使其终体积为Iml ；(8) 37°C水浴振荡培养 Ih (150 170 次 /min)；(9)分别取适量涂布于含Amp LB固体培养基平皿中；(10) 37°C生化培养箱培养过夜。(培养时间为10_14h，不可超过14h)5. 3. 1. 2转化质粒DNA的扩增(1)取5ml无Amp的LB液体培养基，加入无菌试管中；(2)加入5 μ IAmp储存液(50mg/ml)使之终浓度为50 μ g/ml ；(3)挑取3-5个转化的单菌落，加入试管中；(4) 370C，150r/min 振摇过夜(10_12h)。5. 3. 1. 3 质粒 DNA 的提取(1)平衡柱子取一只新的制备柱装在收集管中，吸取200 μ 1的Buffer GPS至柱子中。室温放置5min后，12000g/min离心2min，弃去收集管中滤液，将制备柱重新装在收集管中待用。(平衡过的柱子需在当天使用)(2)按照试剂盒要求提前配好solution I/Rnase A的混合液，4°C保存；加规定体积的无水乙醇到DNA wash Buffer中，室温保存。(3)将上述菌液室温下8000转/分，离心5min，弃上清，收集菌体；(2)每只EP管加入250 μ 1 solution I/Rnase Α,涡旋混勻至菌体完全悬浮；(3)加入250 μ 1 solution II，轻轻颠倒旋转混勻4-6次，不要剧烈混勻，将溶菌液置于室温下孵育2-3min ；(4)加入350 μ 1 solutionlll，轻摇混勻数次，直到絮状白色沉淀产生；(5)室温 14000g/min 离心 lOmin，得上清液；(6)小心吸取上清至2ml平衡好的制备柱中，12000g/min离心2min ；(7)弃滤液，加入 500 μ 1 Buffer HB, 12000g/min 离心 2min ；(8)弃滤液，加入 750 μ 1 DNAwash Buffer, 12000g/min 离心 2min ；(9)重复(8)的操作；(10)制备柱16000g/min离心3min，除去乙醇，空气中晾干。
(11)分别加入 50 μ IElution Buffer 洗脱制备柱，室温放置 2min，16000g/min 离心3min，滤液-20°C存放。5.3.1.4提取质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳检测(1)0. 5XTBE加入0. 5%的琼脂糖，微波加热使琼脂糖完全溶解；(2)溶液冷却至约60°C时，将液体倒入膜具，插入梳子；(3)室温放置30min后，等完全凝固，小心取出梳子，将凝胶置于电泳槽中，加入 0. 5 X TBE倒入电泳槽，液面高出胶面2mm ；(4)上样缓冲液1 μ 1与1 μ 1质粒DNA混合后上样，进行电泳。5. 3. 2细胞接种于转染前48h将处于对数生长期的ΗΕΚ293细胞接种于24孔板，密度为16. OX IO4 个/0. 5ml/孔，且培养液为无抗生素、含10%⑶T-FBS的无酚红1640培养液，分别设置空白对照孔、雌二醇孔及待测药物孔。5. 3. 3转染质粒的稀释ρ β gal-Control 质粒用 TE 稀释为 0. 1 μ g/ μ 1 ；pCXN2-hER α 或 pCXN2_hER β 质粒用 TE 稀释为 40ng/ μ 1 ；pERE-TAL-luc 质粒用 TE 稀释为 0· 2 μ g/ μ 1.5· 3.4质粒的转染(1)转染前24h，将ΗΕΚ293细胞用含10 %无E2的FBS、无庆大霉素和酚红的 RPMI1640培养基于接种于24孔板，细胞密度16 X IO4个/0. 5ml/孔。(2)36_48h后开始转染，小心吸出原培养基，加入400μ 1含10%去雌激素血清、无庆大霉素和酚红的新鲜RPMI1640培养基。(3)取 3 只 EP 管，ER α 管中加 500 μ 1 无酚红 RPMI1640 培养基、8 μ lpCXN2_hERa 质粒、8 μ IpERE-TAL-luc 质粒、8 μ Ip β gal-Control 质粒；ER β 管中加 500 μ 1 无酚红 RPMI1640 培养基、8 μ lpCXN2-hER β 质粒、8 μ lpERE-TAL-Iuc 质粒、8 μ 1 β gal-Control 质粒；脂质体管中加入1000 μ 1无酚红RPMI1640培养基和24 μ 1脂质体。(4)倒转混勻脂质体管，室温放置5min，取500 μ 1分别加入ER α和ER β管，室温放置20min ；(5)倒转混勻ER α和ER β管，取80 μ IER α管中脂质体/DNA复合物分别加入24 孔板ER α实验孔，取80 μ IER β管中脂质体/DNA复合物分别加入24孔板ER β实验孔。前后摇勻，放入培养箱。(6) 6h后加入对照药物和检测药物。5. 3. 5ERE调控的报告基因瞬时表达检测加药后24h的细胞，吸去培养液，用ImlPBS洗一次，并移去PBS。按照Steady-GloR 稳定荧光素酶检测系统试剂盒(Steady-GloR Luciferase Assay Systerm)及闪亮裂解缓冲液(Glo lysis Buffer)改良操作步骤操作，收集细胞裂解上清液，加入荧光素酶反应底物(荧光素)，置于暗处，用VeritasTM微板光度计检测荧光强度。5. 3. 6 β -gal 活性检测为了考察转染效率，对内参照β -gal活性进行了检测。(1)54μ 1β-巯基乙醇加入40ml Z-buffer中，混勻，取EP管，每管加1800 μ 1 ；
(2)每管加20 μ 1裂解上清液；(3)每管加400 μ 1 0NPG，倒转混勻；(4)放置37°C温箱，至显黄色；(5) Na2CO3ImL 终止反应；(6)测 0D420 值；(7)计算标准化荧光素酶活性。二、统计处理实验数据以表示，SPSS13. 0进行单因素方差分析(One-Way AN0VA)统计处理。三、实验结果1.生地黄水提物对MCF-7细胞的增殖的影响实验结果结果显示，生地黄水提物在0. 001 0. Img -πιΓ1时对MCF-7细胞与空白组比均有极显著的促增殖作用(P<0.01)，且呈剂量依赖性。见表1。说明在体外实验中，生地黄水提物在低浓度时即有促MCF-7细胞的增殖作用。表1生地黄对MCF-7细胞增殖的影响(η = 9)
权利要求
1. 一种生地黄水提物在制备雌激素药物中的应用，所述的生地黄水提物是，将生地黄每次用其10倍重量的水煎煮2次，每次2h，合并2次水煎液，减压浓缩干燥得到生地黄浸膏状水提物。
全文摘要
本发明涉及生地黄水提物在制备雌激素药物中的应用，有效解决由于体内雌性激素分泌不足而引起的疾病的用药问题，其解决的技术方案是，将生地黄每次用其10倍重量的水煎煮2次，每次2h，合并2次水煎液，减压浓缩干燥得到生地黄浸膏状水提物，该生地黄水提物可有效用于制备治疗由于体内雌性激素分泌不足而引起的相关疾病的药物，实现生地黄水提物在制备治疗由于体内雌性激素分泌不足而引起的相关疾病药物中的应用，本发明水提物制备方法简单，稳定可靠，并经多次试验，均取得了相同或相近似的结果，方便，成本低，其水提物有效用于制备雌性激素药物，开辟了生地黄药用新用途，临床意义巨大。
文档编号A61P5/30GK102247471SQ20111021118
公开日2011年11月23日 申请日期2011年7月26日 优先权日2010年10月8日
发明者冯卫生, 刘朝妍, 李冬梅, 蒋赟, 郑晓珂 申请人:河南中医学院