专利名称：一种壳聚糖衍生物的制备方法及其在抗凝血药物上的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种壳聚糖衍生物的制备方法及其在抗凝血药物上的应用，尤其是一种磺酸基壳聚糖的制备方法及其在抗凝血药物上的应用。
背景技术：
随着现代医学的飞速发展，各种微创介入医疗装置如医用导管、手术导引线、金属支架等已广泛地应用到各种医疗技术中，极大地丰富了现代医学诊疗手段。然而在临床应用中，现有的装置依然不同程度地存在感染、凝血和术后组织增生等问题，设计生物相容性聚合物为解决这些问题提供了有效途径。现在抗凝血药物为肝素，但由于其制备困难，来源受限，且成本较高，容易失活，保存运输不方便，我们拟通过来源广泛的海洋药用资源-壳聚糖，进行改性，拟发现一种可以替代肝素的新型海洋药物。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种新的价廉、疗效好的具有抗凝血作用的壳聚糖衍生物的制备方法。本发明解决上述技术问题的技术方案如下一种壳聚糖衍生物的制备方法，其具体制备步骤如下将氯磺酸滴加到二甲基甲酰胺中，所述氯磺酸与二甲基甲酰胺的体积比为4 25，搅拌均匀，并将其升温至30 50°C，然后加入丁二酸单胆固醇酯壳聚糖，搅拌并反应12 18h后，再滴加质量分数为10 30%的氢氧化钠溶液，中和至pH值为6 8，过滤，取滤液待用；再将得到的滤液进行透析，透析结束后进行冷冻干燥，得到所述的壳聚糖衍生物。在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。进一步，所述丁二酸单胆固醇酯壳聚糖的制备方法为(I)将质量分数为I 5%的醋酸溶液加入到精制壳聚糖中，搅拌，溶解I 3h，得到壳聚糖的醋酸溶液，备用，所述醋酸溶液与精制壳聚糖的质量比为80 : I 40 : I;(2)将二氯甲烷加入到胆固醇、丁二酸酐和4-二甲氨基吡啶中使之溶解，所述胆固醇、丁二酸酐和4-二甲氨基吡啶的质量比为10 30 10 20 I 3，溶解，加热至40 60°C并反应24 48小时，反应结束后过滤，得到滤液，将所述滤液洗涤后，除去尽可能的杂质，再进行减压蒸除溶剂，再加入丙酮溶液，重结晶，得到丁二酸单胆固醇酯(琥珀酸单胆固醇酯)，所述丙酮溶液与所述二氯甲烷的体积比为I : I;(3)将步骤(2)中得到的丁二酸单胆固醇酯滴加到丙酮中，溶解，得到丁二酸单胆固醇酯的丙酮溶液；(4)将步骤(I)中制得的壳聚糖的醋酸溶液加热至30 50°C并不断搅拌，然后将步骤(3)中制得的丁二酸单胆固醇酯的丙酮溶液滴加到壳聚糖的醋酸溶液中，反应15 25小时，反应结束后，再加入丙酮，出现沉淀物，过滤后得到沉淀物；(5)将步骤(4)中得到的沉淀物，用丙酮洗涤，再过滤除去丙酮，得到洗涤后的沉淀物，最后将洗涤后的沉淀物进行干燥，得到所述的丁二酸单胆固醇酯壳聚糖。进一步，在步骤(2)中，所述滤液洗涤是用去离子水洗涤两次后再用质量分数为5% HCl溶液洗涤两次。进一步，在步骤⑷中所述再加入的丙酮与步骤(3)中丙酮的体积比为3 I。进一步，在步骤(5)中，所述用丙酮洗涤的次数为3 5次。进一步，在步骤(5)中，所述将洗涤后的沉淀物进行干燥的温度为20 80°C。进一步，在步骤(I)中，所述精制壳聚糖的制备方法为I)将质量分数为I 5%的醋酸加入到壳聚糖中，搅拌，溶解，溶解后再过滤，得到滤液；2)向步骤I)得到的滤液中加入质量分数为2 8%的氢氧化钠溶液，调节pH值至7 8，出现沉淀物，过滤，洗涤，再过滤，得到沉淀物；3)将步骤2)中得到的沉淀物进行干燥，即得所述的精制壳聚糖。进一步，在步骤2)中，所述洗涤所述洗涤用的溶液为蒸馏水。进一步，在步骤3)中，所述干燥的时间为24 48小时。 本发明所要解决的另一技术问题是提供一种用上述制备方法制得的壳聚糖衍生物在抗凝血药物上的应用。血红细胞膜具有由磷脂分子及胆固醇分子自组装形成的双层膜.因此设计了含有胆固醇基的细胞膜仿生生物材料，有效地改善了材料的血液相容性。壳聚糖(Chitosan，CS)是甲壳素部分脱乙酰化的产物。这种天然的聚合物具有无毒性、生物降解性和生物相容性的特性，在医学领域具有广泛的应用价值。壳聚糖本身具有很强的凝血作用，其很多衍生物却有较好的抗凝血作用。本发明的有益效果为本发明的壳聚糖衍生物，即0-磺酸基-N-胆留醇-壳聚糖具有良好的抗凝血性，且价格低廉，极有希望作为肝素的替代物用于临床。为临床提供一种新的价廉、疗效好的抗凝血剂。而且合成过程易于操作，简便医德，易于工业化大生产，产业化程度高，投入及开发成本较小，为一种良好的具有潜在价值的海洋新药。
图I为本发明壳聚糖衍生物的制备方法中的壳聚糖与丁二酰化壳聚糖的红外光谱图；图2本发明壳聚糖衍生物的制备方法中的磺酸基壳聚糖的IH-NMR图。
具体实施例方式以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。实施例I一种壳聚糖衍生物的制备方法，其具体制备步骤如下I、壳聚糖的精制
配置质量分数为I %的醋酸溶液用移液管移取2. 5ml冰醋酸溶液于250ml容量瓶，用去离子水定容到刻线，摇匀即得。配置2%的氢氧化钠溶液称取氢氧化钠颗粒2g，用去离子水溶于小烧杯中，转移至IOOml量瓶，再用去离子水定容，摇匀即得。称取5. Og壳聚糖置于500ml小烧杯中，加入250ml的I %醋酸，置于恒温磁力搅拌器上搅拌溶解。溶解后，将壳聚糖溶液用布氏漏斗抽滤。滤液转移至500ml的烧杯，用2%的氢氧化钠溶液调节PH至7，此时出现大量白色沉淀。再次抽滤，并用蒸馏水洗至中性，抽滤脱水，滤饼至于表面皿中。将表面皿置于真空干燥箱干燥24小时，即得精制壳聚糖。2、丁二酸单胆固醇酯壳聚糖的合成
丁二酸单胆固醇酯的合成分别称取2. Og胆固醇(5mmol)、1.5g 丁二酸酐(15mmol)、0. Ig DMAP (0. 8mmol)，置于IOOml圆底烧瓶中，加入40ml 二氯甲烷溶解，将圆底烧瓶置于恒温水浴锅中，加热至回流，恒温反应40h。反应结束后，抽滤，滤液用去离子水，质量分数为5%HCl(2mol/L)溶液各洗涤两次(20ml)后，减压蒸除溶剂。并置于烧杯中，力口入丙酮溶液，重结晶，出现白色固体。配置2%的醋酸溶液用移液管移取Iml冰醋酸溶液于50ml容量瓶，用去离子水定容到刻线，摇匀即得。胆固醇壳聚糖的合成称取0. 25g精制壳聚糖于IOOml圆底烧瓶，加入15ml、I %的醋酸溶液，置于恒温磁力搅拌器上搅拌溶解lh。精密称取单胆固醇琥珀酸酯12. 6mg，于小烧杯中溶于5ml丙酮。将圆底烧瓶转移到恒温水浴锅中，升温到40°C。恒温搅拌下，将单胆固醇琥珀酸酯的丙酮溶液滴加到圆底烧瓶中，并反应20h。反应结束后，在其中加入3倍丙酮(约45ml丙酮)，出现大量白色沉淀。抽滤，滤饼用丙酮洗涤4次，抽滤除去丙酮。滤饼置于表面皿上，40°C下置于真空干燥箱干燥即得。3、磺酸基壳聚糖的制备量取25mlDMF置于IOOml圆底烧瓶，冰水浴搅拌下滴加约4ml氯磺酸，搅拌混匀。将圆底烧瓶转移至恒温水浴锅，升温至40°C，加入精密称取的丁二酸单胆固醇酯壳聚糖197. 9mg,恒温搅拌反应15h。20%氢氧化钠溶液的配置称取氢氧化钠颗粒20g，用去离子水溶于小烧杯中，转移至IOOml量瓶，再用去离子水定容，摇匀即得。反应结束后将圆底烧瓶置于冰水浴中，滴加20%氢氧化钠溶液中和至中性，出现白色沉淀。抽滤，取滤液储存于小烧杯待用。透析袋的处理选截留分子量为8000 12000的透析带，剪成长约5cm，宽约3cm的两段，并剪四段细线，一起放入IOOOml的大烧杯，在烧杯中加满去离子水，并于多功能万用电炉上加热煮沸30min。30min后，用镊子夹出透析带，用煮过的细线绑住一端，搓开带子呈袋状，待其中加入待透析液，封住另一端即得。透析将小烧杯中的滤液封入两个透析袋中，分别放入盛满去离子水的IOOOml大烧杯中，置于恒温磁力搅拌器上搅拌2d，且每隔6h换一次水。冷冻干燥透析结束后，取透析液装入IOml西林瓶，每瓶装入约五分之一的透析液。封口后置于冷冻干燥箱中冷冻干燥。为证实所得产物的确是所要物质，用氢谱对产物进行表征，可证实。
一种用实施例I的制备方法制得的壳聚糖衍生物在抗凝血药物上的应用。实施例2一种壳聚糖衍生物的制备方法，其具体制备步骤如下I、壳聚糖的精制I)将质量分数为1%的醋酸加入到壳聚糖中，搅拌，溶解，溶解后再过滤，得到滤液；2)向步骤I)得到的滤液中加入质量分数为2%的氢氧化钠溶液，调节pH值至7，出现沉淀物，过滤，再用蒸馏水洗涤，再过滤，得到沉淀物；3)将步骤2)中得到的沉淀物进行干燥，干燥时间为24小时，即得所述的精制壳聚 糖。2、丁二酸单胆固醇酯壳聚糖的合成(I)将质量分数为I %的醋酸溶液加入到精制壳聚糖中，搅拌，溶解lh，得到壳聚糖的醋酸溶液，备用，所述醋酸溶液与精制壳聚糖的质量比为40 I ；(2)将二氯甲烷加入到胆固醇、丁二酸酐和4-二甲氨基吡啶中使之溶解，所述胆固醇、丁二酸酐和4-二甲氨基吡啶的质量比为10 10 1，溶解，加热至40°C并反应24小时，反应结束后过滤，得到滤液，将所述滤液用去离子水洗涤两次后再用质量分数为5%HCl溶液洗涤两次后，除去尽可能的杂质，再进行减压蒸除溶剂，再加入丙酮溶液，重结晶，得到丁二酸单胆固醇酯(琥珀酸单胆固醇酯)，所述丙酮溶液与所述二氯甲烷的体积比为1:1;(3)将步骤(2)中得到的丁二酸单胆固醇酯滴加到丙酮中，溶解，得到丁二酸单胆固醇酯的丙酮溶液；(4)将步骤(I)中制得的壳聚糖的醋酸溶液加热至30°C并不断搅拌，然后将步骤(3)中制得的丁二酸单胆固醇酯的丙酮溶液滴加到壳聚糖的醋酸溶液中，反应15小时，反应结束后，再加入丙酮(再加入的丙酮与步骤(3)中丙酮的体积比为3 1)，出现沉淀物，过滤后得到沉淀物；(5)将步骤⑷中得到的沉淀物，用丙酮洗涤3次，再过滤除去丙酮，得到洗涤后的沉淀物，最后将洗涤后的沉淀物在20°C下进行干燥，得到所述的丁二酸单胆固醇酯壳聚糖。3、磺酸基壳聚糖的制备将氯磺酸滴加到二甲基甲酰胺中，所述氯磺酸与二甲基甲酰胺的体积比为
I 10，搅拌均匀，并将其升温至30°C，然后加入丁二酸单胆固醇酯壳聚糖，搅拌并反应12h后，再滴加质量分数为10%的氢氧化钠溶液，中和至pH值为6，过滤，取滤液待用；再将得到的滤液进行透析，透析结束后进行冷冻干燥，得到所述的壳聚糖衍生物。为证实所得产物的确是所要物质，用氢谱对产物进行表征，可证实。一种用实施例2的制备方法制得的壳聚糖衍生物在抗凝血药物上的应用。实施例3一种壳聚糖衍生物的制备方法，其具体制备步骤如下I、壳聚糖的精制I)将质量分数为3%的醋酸加入到壳聚糖中，搅拌，溶解，溶解后再过滤，得到滤液；
2)向步骤I)得到的滤液中加入质量分数为5%的氢氧化钠溶液，调节pH值至7. 5，出现沉淀物，过滤，再用蒸馏水洗涤，再过滤，得到沉淀物；3)将步骤2)中得到的 沉淀物进行干燥，干燥时间为36小时，即得所述的精制壳 聚糖。2、丁二酸单胆固醇酯壳聚糖的合成(I)将质量分数为3%的醋酸溶液加入到精制壳聚糖中，搅拌，溶解2h，得到壳聚糖的醋酸溶液，备用，所述醋酸溶液与精制壳聚糖的质量比为60 I ；(2)将二氯甲烷加入到胆固醇、丁二酸酐和4-二甲氨基吡啶中使之溶解，所述胆固醇、丁二酸酐和4-二甲氨基吡啶的质量比为20 15 2，溶解，加热至50°C并反应36小时，反应结束后过滤，得到滤液，将所述滤液用去离子水洗涤两次后再用质量分数为5%HCl溶液洗涤两次后，除去尽可能的杂质，再进行减压蒸除溶剂，再加入丙酮溶液，重结晶，得到丁二酸单胆固醇酯(琥珀酸单胆固醇酯)，所述丙酮溶液与所述二氯甲烷的体积比为1:1;(3)将步骤(2)中得到的丁二酸单胆固醇酯滴加到丙酮中，溶解，得到丁二酸单胆固醇酯的丙酮溶液；(4)将步骤(I)中制得的壳聚糖的醋酸溶液加热至40°C并不断搅拌，然后将步骤(3)中制得的丁二酸单胆固醇酯的丙酮溶液滴加到壳聚糖的醋酸溶液中，反应20小时，反应结束后，再加入丙酮(再加入的丙酮与步骤(3)中丙酮的体积比为3 1)，出现沉淀物，过滤后得到沉淀物；(5)将步骤⑷中得到的沉淀物，用丙酮洗涤4次，再过滤除去丙酮，得到洗涤后的沉淀物，最后将洗涤后的沉淀物在50°C下进行干燥，得到所述的丁二酸单胆固醇酯壳聚糖。3、磺酸基壳聚糖的制备将氯磺酸滴加到二甲基甲酰胺中，所述氯磺酸与二甲基甲酰胺的体积比为4 25，搅拌均匀，并将其升温至40°C，然后加入丁二酸单胆固醇酯壳聚糖，搅拌并反应15h后，再滴加质量分数为20%的氢氧化钠溶液，中和至pH值为7，过滤，取滤液待用；再将得到的滤液进行透析，透析结束后进行冷冻干燥，得到所述的壳聚糖衍生物。为证实所得产物的确是所要物质，用氢谱对产物进行表征，可证实。—种用实施例3的制备方法制得的壳聚糖衍生物在抗凝血药物上的应用。实施例4一种壳聚糖衍生物的制备方法，其具体制备步骤如下I、壳聚糖的精制I)将质量分数为5%的醋酸加入到壳聚糖中，搅拌，溶解，溶解后再过滤，得到滤液；2)向步骤I)得到的滤液中加入质量分数为8%的氢氧化钠溶液，调节pH值至8，出现沉淀物，过滤，再用蒸馏水洗涤，再过滤，得到沉淀物；3)将步骤2)中得到的沉淀物进行干燥，干燥时间为48小时，即得所述的精制壳聚糖。2、丁二酸单胆固醇酯壳聚糖的合成(I)将质量分数为5%的醋酸溶液加入到精制壳聚糖中，搅拌，溶解3h，得到壳聚糖的醋酸溶液，备用，所述醋酸溶液与精制壳聚糖的质量比为80 I ；(2)将二氯甲烷加入到胆固醇、丁二酸酐和4-二甲氨基吡啶中使之溶解，所述胆固醇、丁二酸酐和4-二甲氨基吡啶的质量比为30 20 3，溶解，加热至60°C并反应48小时，反应结束后过滤，得到滤液，将所述滤液用去离子水洗涤两次后再用质量分数为5%HC I溶液洗涤两次后，除去尽可能的杂质，再进行减压蒸除溶剂，再加入丙酮溶液，重结晶，得到丁二酸单胆固醇酯(琥珀酸单胆固醇酯)，所述丙酮溶液与所述二氯甲烷的体积比为1:1;(3)将步骤(2)中得到的丁二酸单胆固醇酯滴加到丙酮中，溶解，得到丁二酸单胆固醇酯的丙酮溶液；(4)将步骤(I)中制得的壳聚糖的醋酸溶液加热至50°C并不断搅拌，然后将步骤
(3)中制得的丁二酸单胆固醇酯的丙酮溶液滴加到壳聚糖的醋酸溶液中，反应25小时，反 应结束后，再加入丙酮(再加入的丙酮与步骤(3)中丙酮的体积比为3 1)，出现沉淀物，过滤后得到沉淀物；(5)将步骤⑷中得到的沉淀物，用丙酮洗涤5次，再过滤除去丙酮，得到洗涤后的沉淀物，最后将洗涤后的沉淀物在80°C下进行干燥，得到所述的丁二酸单胆固醇酯壳聚糖。3、磺酸基壳聚糖的制备将氯磺酸滴加到二甲基甲酰胺中，所述氯磺酸与二甲基甲酰胺的体积比为6 40，搅拌均匀，并将其升温至50°C，然后加入丁二酸单胆固醇酯壳聚糖，搅拌并反应18h后，再滴加质量分数为30%的氢氧化钠溶液，中和至pH值为8，过滤，取滤液待用；再将得到的滤液进行透析，透析结束后进行冷冻干燥，得到所述的壳聚糖衍生物。为证实所得产物的确是所要物质，用氢谱对产物进行表征，可证实。对比实施例5丁二酰化壳聚糖衍生物的制备配置2%的盐酸溶液精密移取2. 7ml的38%盐酸溶液，置于50ml小烧杯中，用去离子水稀释，后转移至50ml量瓶中，去离子水定容，摇匀即得。丁二酸酐丙酮溶液的配置精密称取丁二酸酐23mg于IOml小量瓶，加入丙酮溶液溶解并定容，摇匀即得。精密称取精制壳聚糖0. 51g于IOOml烧杯中，加入2%盐酸溶液50ml，置于恒温磁力搅拌器上搅拌溶解，储存过夜。将烧杯中壳聚糖盐酸溶液转移至IOOml圆底烧瓶，并将圆底烧瓶置于恒温水浴锅中，调节温度至40°C，同时搅拌。移取Iml 丁二酸酐丙酮溶液，搅拌下，缓慢滴加到壳聚糖溶液中，恒温反应4小时。反应结束后，用3倍丙酮溶液(约150ml左右)沉淀。然后用布氏漏斗抽滤，沉淀物再用丙酮溶液洗涤5次，抽滤脱去丙酮。将白色滤饼置于表面皿中，并于40°C真空干燥箱干燥至恒重。具体实验验证试验实施例I壳聚糖衍生物体外抗凝血的验证磺酸基壳聚糖的体外抗凝血实验取两只直径1cm，长IOcm的玻璃试管，编号为I和2。I号加入0. 2ml磺酸基壳聚糖透析液，2号不加。然后分别加入新鲜小鼠血液0. 3ml,立刻混匀，并于37°C水浴，每隔30s倾斜玻璃管，记录血液凝固时间。每组测量三个样本。
0. Olmol/L PBS溶液的配置称取十二水合磷酸氢二钠2. 9g，二水合磷酸二氢钠0. 3g于IOOml容量瓶中，加去离子水溶解并定容到刻线，摇匀即得0. Imo 1/LpH为7. 4的PBS溶液。移取该溶液Iml于IOml容量瓶，加去离子水定容到刻线，摇匀即得。丁二酰化壳聚糖溶液的配置精密称取10. 2mg 丁二酰化壳聚糖于小烧杯，加入0. 01mol/L PBS溶液搅拌溶解，即得。丁二酰化壳聚糖的体外抗凝血实验取两只直径1cm，长IOcm的玻璃试管，编号为3和4。3号加入0. 2ml 丁二酰化壳聚糖溶液，4号不加。然后分别加入新鲜小鼠血液0. 3ml,立刻混匀，并于37°C水浴，每隔30s倾斜玻璃管，记录血液凝固时间。每组测量三个样本。试验实施例2壳聚糖衍生物的抗凝血指数和溶血度小鼠眼睑取血先取EP管，滴入肝素钠注射液I滴，旋转使整个EP管均匀铺满肝素钠注射液。取玻璃吸管插入小鼠眼角部位，旋转取血，用肝素钠注射液的EP管接血，轻轻混匀。生理盐水的配置称取0. 9g氯化钠于IOOml容量瓶，加去离子水使其溶解，并定容的刻线，即得。0. 5mol/L醋酸溶液的配置查资料可知冰醋酸浓度为17. 485mol/L。用移液管移取0. 29ml冰醋酸溶液于IOml小量瓶，加去离子水定容到刻度线，摇匀即得。1%壳聚糖和1%丁二酰化壳聚糖溶液的配制分别精密称取壳聚糖和丁二酰化壳聚糖各50mg于小烧杯，加入0. 5mol/L醋酸溶液溶解，待完全溶解后转移至5ml小量瓶，并定容至刻度线，摇匀即得。抗凝血实验取三只IOOml小烧杯,编号分别为I, 2, 3号。I号加入0. Iml磺酸基壳聚糖透析液，2号加入Iml 1%丁二酰化壳聚糖溶液，3号什么都不加。再分别加入0. 2ml新鲜抗凝小鼠血，轻轻混匀并使之平铺于烧杯底部。5分钟后，将50ml生理盐水缓慢流注于血液表面，轻轻摇匀后用紫外-可见分光光度计在540nm处测吸光度值。按照相同方法每个样品平行测定5次，其平均吸光度值记为As，材料的抗凝血指数(BCI)定义为BCI = As/Aw X 100%(I)Aw为0. 2mL新鲜抗凝小鼠血与50ml生理盐水混合后的吸光度。溶血实验取新鲜抗凝小鼠血0. 4ml加生理盐水0. 5ml得稀释血。取5只离心试管并编号为A，B，C，D，E号。A加入4. 5ml生理盐水和0. 5ml I %的壳聚糖醋酸溶液，B加入4. 5ml生理盐水和0. 5ml 1%的丁二酰化壳聚糖醋酸溶液，C加入4. 5ml生理盐水和0. Iml磺酸基壳聚糖透析液。37°C恒温30min后加入稀释血0. 2mL,继续恒温60min,再以900r/min离心8min，取上清液用紫外-可见分光光度计在540nm处测吸光度值，5次平行测定吸光度平均值记为AS。按同样方法，D为阳性对照，用5mL蒸馏水加稀释血0. 2mL ;E为阴性对照，用5mL生理盐水加稀释血0. 2mL，分别测定吸光度值。按下式计算材料的溶血度HR = (AS-AN)/(AP-AN) X 100% (2)式中AP阳性对照吸光度，AN为阴性对照吸光度。试验实施例3磺酸基壳聚糖的表征制备的磺酸基壳聚糖透析液澄清透明，冻干后呈白色絮状。冻干的磺酸基壳聚糖溶解于D20中，记录磺酸基壳聚糖的IH-NMR如图2所示。如图2所示，壳聚糖已经成功接枝了磺酸基和丁二酸酐胆固醇(4 5部位为壳聚糖本体，2 3为磺酸基部位，8 9为胆固醇部位)，说明磺酸基壳聚糖合成。试验实施例4 壳聚糖衍生物抗凝血作用的验证
磺酸基壳聚糖体外抗凝血实验加入磺酸基壳聚糖与未加的小鼠血液凝血时间如表I所示。表I磺酸基壳聚糖体外抗凝血时间
编号凝血时间平均
1>10min >1Omin>10min >10min
240s42s43s43.5s从上表可以看出，相同条件下，加入磺酸基壳聚糖的小鼠血液凝固时间要远远长于未加该壳聚糖的血液，说明磺酸基壳聚糖具有很好的抗凝血作用。空白血液完全凝固，而磺酸基壳聚糖后的血液一直未凝固。取加入磺酸基壳聚糖的小鼠血液，做成血涂片，并置于显微镜下观察，可观察到有完整的红细胞。说明加入磺酸基壳聚糖溶液的小鼠血液并没有全部溶血，磺酸基壳聚糖的确具有很好的抗凝血效果。丁二酰化壳聚糖的体外抗凝血实验加入丁二酰化壳聚糖与未加的小鼠血液凝血时间如表2所示。表2 丁二酰化壳聚糖体外抗凝血时间
编号凝血时间
飞98s IOOs105sIOls442s 44s45s43.5s从上表可以看出，相同条件下，加入丁二酰化壳聚糖的小鼠血液凝固时间长于未加该壳聚糖的血液，说明丁二酰化壳聚糖也有抗凝血作用。空白血液完全凝固，而加入丁二酰化壳聚糖后的血液后来也凝固了，由于丁二酰化壳聚糖溶于PBS中，故出现了一定的溶血血现象。说明丁二酰化壳聚糖虽然也具有抗凝血作用，但抗凝血效果不理想。试验实施例5壳聚糖衍生物的抗凝血指数和溶血度壳聚糖衍生物的抗凝血指数加入壳聚糖衍生物和空白血液经处理后吸光度值如下表所示。表3抗凝血试验
表3抗凝血试验
权利要求
1.种壳聚糖衍生物的制备方法，其特征在于，其具体制备步骤如下 将氯磺酸滴加到二甲基甲酰胺中，所述氯磺酸与二甲基甲酰胺的体积比为I 6 10 40，搅拌均匀，并将其升温至30 50°C，然后加入丁二酸单胆固醇酯壳聚糖，搅拌并反应12 18h后,再滴加质量分数为10 30%的氢氧化钠溶液，中和至pH值为6 8,过滤，取滤液待用；再将得到的滤液进行透析，透析结束后进行冷冻干燥，得到所述的壳聚糖衍生物。
2.根据权利要求I所述的制备方法，其特征在于，所述丁二酸单胆固醇酯壳聚糖的制备方法为 (1)将质量分数为I 5%的醋酸溶液加入到精制壳聚糖中，搅拌，溶解I 3h，得到壳聚糖的醋酸溶液，备用，所述醋酸溶液与精制壳聚糖的质量比为80 : I 40 : I; (2)将二氯甲烷加入到胆固醇、丁二酸酐和4-二甲氨基吡啶中使之溶解，所述胆固醇、丁二酸酐和4-二甲氨基吡啶的质量比为10 30 10 20 I 3，溶解，加热至40 60°C并反应24 48小时，反应结束后过滤，得到滤液，将所述滤液洗涤后，进行减压蒸除溶齐U，再加入丙酮溶液，重结晶，得到丁二酸单胆固醇酯，所述丙酮溶液与所述二氯甲烷的体积比为1:1; (3)将步骤(2)中得到的丁二酸单胆固醇酯滴加到丙酮中，溶解，得到丁二酸单胆固醇酯的丙酮溶液； (4)将步骤(I)中制得的壳聚糖的醋酸溶液加热至30 50°C并不断搅拌，然后将步骤(3)中制得的丁二酸单胆固醇酯的丙酮溶液滴加到壳聚糖的醋酸溶液中，反应15 25小时，反应结束后，再加入丙酮，出现沉淀物，过滤后得到沉淀物； (5)将步骤(4)中得到的沉淀物，用丙酮洗涤，再过滤除去丙酮，得到洗涤后的沉淀物，最后将洗涤后的沉淀物进行干燥，得到所述的丁二酸单胆固醇酯壳聚糖。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，在步骤(2)中，所述滤液洗涤是用去离子水洗涤两次后再用质量分数为5%HC1溶液洗涤两次。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，在步骤(4)中所述再加入的丙酮与步骤(3)中丙酮的体积比为3 I。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，在步骤(5)中，所述用丙酮洗涤的次数为3 5次。
6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，在步骤(5)中，所述将洗涤后的沉淀物进行干燥的温度为20 80°C。
7.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，在步骤(I)中，所述精制壳聚糖的制备方法为 1)将质量分数为I 5%的醋酸加入到壳聚糖中，搅拌，溶解，溶解后再过滤，得到滤液； 2)向步骤I)得到的滤液中加入质量分数为2 8%的氢氧化钠溶液，调节pH值至7 8，出现沉淀物，过滤，洗涤，再过滤，得到沉淀物； 3)将步骤2)中得到的沉淀物进行干燥，即得所述的精制壳聚糖。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，在步骤2)中，所述洗涤用的溶液为蒸馏水。
9.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，在步骤3)中，所述干燥的时间为24 48小时。
10.一种根据权利要求I 9任一项制备方法所得的壳聚糖衍生物在抗凝血药物上的应用。
全文摘要
本发明涉及一种壳聚糖衍生物的制备方法，其具体制备步骤如下将氯磺酸滴加到二甲基甲酰胺中，所述氯磺酸与二甲基甲酰胺的体积比为1～610～40，搅拌均匀，并将其升温至30～50℃，然后加入丁二酸单胆固醇酯壳聚糖，搅拌并反应12～18h后，再滴加质量分数为10～30%的氢氧化钠溶液，中和至pH值为6～8，过滤，取滤液待用；再将得到的滤液进行透析，透析结束后进行冷冻干燥，得到所述的壳聚糖衍生物。本发明还涉及一种壳聚糖衍生物在抗凝血药物上的应用。本发明合成过程易于操作，简便医德，易于工业化大生产，产业化程度高，投入及开发成本较小，为一种良好的具有潜在价值的海洋新药。
文档编号A61P7/02GK102702382SQ201110235390
公开日2012年10月3日 申请日期2012年1月17日 优先权日2012年1月17日
发明者陈大全 申请人:烟台大学