专利名称：乳糖化羧甲基壳聚糖磁性纳米粒基因载体的制备方法
技术领域：
本发明涉及乳糖化羧甲基壳聚糖磁性纳米粒基因载体的制备方法。
背景技术：
随着纳米技术的发展，以纳米颗粒为基因转移载体的研究引起了广泛关注。纳米颗粒是一种粒径在I-IOOnm之间的超微颗粒，具有表面效应及小尺寸效应。因此，以纳米颗粒作为基因转移载体，有其独特优势，如装载量大、靶向性、可控缓释及生物相容性等。将基因治疗分子包裹在纳米颗粒之中或吸附在其表面，通过细胞摄粒作用进入细胞内，释放基因治疗分子，发挥基因治疗效能。研究发现，直径在IOOnm以下的纳米微球，具有很好的细胞摄入效果无论体内还是体外，纳米运载体系均能有效的保护核苷酸，防止其降解，有助于核苷酸转染细胞，并可起到定位作用。因此，纳米颗粒作为基因运载体，不仅增加了核苷酸进入细胞内的量，提高了转染效率，而且也增强了核苷酸在细胞内的稳定性，保证了治疗效应的持久发挥。然而，要制备理想的纳米基因载体，材料的选择十分重要。作为基因载体的纳米材料，必须具备生物相容性强、可降解、易于从体内排泄、本身及其降解产物对人体无毒等特点。目前已有多种纳米颗粒用作基因转移载体。壳聚糖是近年来发现的一个多聚阳离子型DNA载体，并在体内外得到了越来越广泛的应用，已显示出其巨大的携基因能力。壳聚糖磁性纳米粒以及壳聚糖半乳糖纳米粒作为基因载体已有报道，分别利用了磁性及特异性配体加强其作为载体的靶向能力。我们之前已成功制备羧甲基壳聚糖(CMCS)及磁性!^e3O4 纳米粒子，基于上述原因，我们选用CMCS及磁性!^e3O4为材料，设计了 CMCS-Fe304磁性复合纳米粒，并借助CMCS分子上的游离氨基作为交联基团，通过还原氨化法偶联上半乳糖配体，制备成CMCS-半乳糖-Fii3O4磁性复合纳米粒(Gal-CMCS-Fi5304NP)。以期利用CMCS良好的生物相容性和生物可降解性以及半乳糖对肝细胞的特异靶向性和狗304的磁靶向能力， 制备出一种新型、高效、靶向性的基因载体。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种乳糖化羧甲基壳聚糖磁性纳米粒基因载体的制备方法，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是分三步完成，其特征是步骤一采用传统共沉淀法利用化学式 ^2++2 ^3++80Η- — Fe304+4H20制备狗304纳米粒子，传统共沉淀法是在生成磁性物质的同时产生磁性高分子微球的制备方法。先将高分子物质溶解，然后依次加入狗2+和H2A或狗2+和狗3+，搅拌的同时滴加碱性溶液，通过氧化沉淀或共沉淀反应，这样磁性物质一产生就被包裹形成核壳磁性高分子微球。①取1. 7ml 浓盐酸加二次蒸馏水定容到50ml，称取10. 8g FeCljP 4g FeCl2加入其中配成溶液，在配制过程中向溶液中不断通氮气去氧，以减少氧对溶液中离子成分的影响。应用0. 22 μ m滤菌器过滤除菌后取25ml备用。②称取15gNa0H，加二次蒸馏水配制成250ml溶液，倒入三口烧瓶中，三口烧瓶的三个口分别通氮气、接冷凝管、接温度计，再将上步所得25ml溶液快速加入，在通入氮气保护下，将烧瓶置于利用DF-101S型集热式恒温磁力搅拌器中，保持80°C反应lh，使所得!^e3O4微粒充分熟化。反应Ih结束后持续搅拌至冷却，集热式恒温磁力搅拌器是指被加热容器完全处于强烈的热辐射之中，加热速度是其它平面加热磁力搅拌器的三倍。温度均勻、效率高，更适应球型烧瓶进行加热反应。③上步所得黑色液体倒入IL烧杯， 底部放置永磁体，加入二次蒸馏水。待在磁场中黑色物质完全沉淀后弃上层较澄清液，反复用二次蒸馏水冲洗黑色沉淀物4次，已不易沉淀，且予测pH值约8时，考虑制得的!^e3O4中性，排除了所加酸碱的影响。④所得产物利用冷冻干燥机真空冷冻干燥保存备用(经试验论证，冻干较之于电热鼓风干燥更易制得颗粒状产物，烘干产物易结团成块)。步骤二 采用共混包埋法将具有良好水溶性和生物相容性的羧甲基壳聚糖包覆于磁性粒子表面，制备羧甲基壳聚糖磁性纳米复合物(CMCTS-Fe3O4NP)，共混包埋法是指将磁性超微颗粒均勻地分散在亲水性高分子水溶液中，主要是通过范德华力、氢键、配位键和共价键等作用将水溶性的高分子物质缠绕在无机磁性颗粒表面，形成聚合物包被的核-壳式磁性高分子微球。①称取制备冻干的140mg Fe3O4纳米粒子溶于40ml 二次蒸馏水后，通氮气去氧，利用超声波清洗机的超声在65°C将磁性粒子分散均勻，以构建下步和羧甲基壳聚糖的反应环境。②称取^Omg羧甲基壳聚糖(CMCTS)于20ml 二次蒸馏水溶勻，快速倒入上步液体中， 继续通氮气去氧，超声下65°C反应lh。③将最后得到的黑色液体利用外加磁场沉淀，弃除上层清液以除外未包覆的杂质后，再加入二次蒸馏水定容至60ml，溶勻即成CMCTS-Fi53O4NP 胶体液，密封4°C保存备。步骤三以乳糖为乳糖化试剂，借助CMCTS分子上的游离氨基作交联基团，通过还原氨化法偶联上乳糖中的去唾液酸半乳糖配体，制备同时具有磁靶向和肝靶向性的乳糖修饰的羧甲基壳聚糖磁性纳米复合物(GaI-CMCTS-Fe3O4NP)①将制备的60ml CMCTS-Fe3O4NP 胶体液利用超声37°C分散均勻。②称取336mg乳糖和168mg氰基硼氢化钠慢慢加入上步液体中，利用超声在37°C搅拌反应lh。③将最后得到的黑色液体利用凝胶的分子筛特性，经葡聚糖凝胶kphedaxG-25柱层析分离，选择0. lmol/L碳酸氢铵溶液洗脱，收集洗脱部分即为较纯化的(Gal-CMCTS-Fi53O4NP)胶体液，真空冰冻干燥保存备用。本发明的有益效果是，本发明所制备的羧甲基壳聚糖磁性纳米复合物 (Gal-CMCTS-Fe3O4NP)具有很好的生物相容性和DNA保护能力，对细胞毒性小，具有长循环性能，不失为一种较为理想的基因载体。
图1 本发明实施例分子式结构示意图；图2 本发明实施例转染肝癌细胞株效果具体实施例方式①称取10. 8g FeCl3和48 FeCl2加入50ml盐酸(1. 7ml浓盐酸加二次蒸馏水定容至50ml)中，配制过程中不断通氮气去溶液中氧。制得橙色溶液用0.22 μ m滤菌器过滤除菌，取25ml备用。
②称取15g NaOH，加二次蒸馏水配制成250ml溶液，倒入三口烧瓶，再将之前制得的25ml橙色溶液快速加入。将烧瓶置于DF-101S型集热式恒温磁力搅拌器中，溶液通氮气保护，烧瓶接冷凝管，接温度计，保持80°C反应Ih，溶液逐渐由橙变黑，充分熟化!^e3O4微粒。 反应Ih结束后持续搅拌至冷却。③将制得黑色液体倒入IL烧杯，底部外置磁场，加入二次蒸馏水适量重悬微粒。 待在磁场中黑色物质完全沉淀后弃上层清液。反复二次蒸馏水冲洗黑色沉淀约4次，待不易沉淀，测PH值约8，考虑制得!^e3O4微粒中性，无酸碱影响。所得胶体液约900ml，取少量予透射电镜检测，证实为纳米级微粒，粒径约30nm。近900ml胶体液冷冻干燥机冻干，经称量制得!^e3O4微粒约3. 15g，保存备用。④称取冻干的140mg Fe3O4纳米微粒重悬于40ml 二次蒸馏水，利用超声波清洗机的超声将磁性粒子分散均勻。⑤称取^Omg羧甲基壳聚糖(CMCTS)于20ml 二次蒸馏水中，适当加热溶勻，快速倒入40ml磁性粒子胶体液(含Fii3O4纳米微粒140mg)中，通氮气去氧，超声下65°C反应Ih。⑥所得黑色液体利用外加磁场沉淀，弃除上层清液，加二次蒸馏水定容至60ml，超声分散均勻即成CMCTS-Fe3O4NP胶体液。⑦称取336mg乳糖和168mg氰基硼氢化钠慢慢加入制得的60mlCMCTS-I^3O4NP胶体液中，利用超声在37°C搅拌反应lh。⑧将所得产物利用凝胶的分子筛特性，经葡聚糖凝胶kphedaxG-25柱层析分离， 选择0. lmol/L碳酸氢铵溶液洗脱，收集洗脱部分即认为为较纯化的(^l-CMCTS-Fe3O4NP胶体液，取少量予透射电镜检测，证实为纳米级，形态规则的圆形颗粒，粒径约50nm。将终产物冻干后称量，所得feil-CMCTS-Fe304NP约160mg，保存备用。本发明所制得的纳米粒经电镜检测大小为50nm左右，符合基因载体的要求，而且也具有很好的磁响应性。为了进一步论证其能够有效的将药物或基因送达体内的靶细胞、 组织，通过体外一系列模拟实验对其性能进行了研究。结果表明制得的纳米粒对DNA的结合，无论在酸性环境还是碱性环境内都表现出较强的结合能力，且接近体内环境的PH值时结合力最强。不同质量比情况下的凝胶电泳和DNA沉淀实验表明，纳米粒与DNA的最佳结合比为3 1，此时DNA的结合率可达95%左右。通过体外DnaseI酶的消化检测，证明了纳米粒对DNA具有很好的保护作用。毒性实验显示，相同条件下对比，制得的纳米粒对细胞的毒性作用明显小于脂质体。在300 μ g/ml浓度范围内，纳米粒对红细胞是安全的，未显示溶血现象。将所制得纳米材料与绿色荧光基团PEGFP形成复合物，转染肝癌细胞株BEL-7402， 转染效率较高，可达50%左右(如图2)。按照所设计实验步骤，取原料10. 8g FeCl3、4g FeCl2、1. 7ml浓盐酸、15g NaOH、 6. 3g羧甲基壳聚糖、7. 56g乳糖和3. 78g氰基硼氢化钠，可制得含杂质的fetl-CMCTS-Fe304NP 胶体液1. 35L，经葡聚糖凝胶kphedaxG-25柱层析分离，选择0. lmol/L碳酸氢铵溶液洗脱后，经冻干，可得较纯化的fetl-CMCTS-Fe304NP3. 6g。而作为高效双靶向的基因载体用于动物实验，抑或是远期临床试验，按照目的基因质粒DNA与载体质量比1 3，质粒DNA个体所需量20 μ g，则推算出作为载体(^l-CMCTS-Fi53O4NP的个体所需量为60 μ g。按照初始设定原料量制得的feil-CMCTS-Fe304NP，可用于60000例个体进行目的基因的药物靶向治疗。上面所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的构思和范围进行限定，在不脱离本发明设计构思的前提下，本领域中 普通工程技术人员对本发明的技术方案作出的各种变型和改进，均应落入本发明的保护范围，本发明请求保护的技术内容，已经全部记载在权利要求书中。
权利要求
1.乳糖化羧甲基壳聚糖狗304纳米粒基因载体的制备方法，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是分三步完成，其特征是步骤一采用传统共沉淀法利用化学式 ^2++2 ^3++80Η_ — Fe304+4H20制备狗304纳米粒子，传统共沉淀法是在生成磁性物质的同时产生磁性高分子微球的制备方法，先将高分子物质溶解，然后依次加入狗2+和H2A或狗2+和狗3+，搅拌的同时滴加碱性溶液，通过氧化沉淀或共沉淀反应，这样磁性物质一产生就被包裹形成核壳磁性高分子微球①取1. 7ml 浓盐酸加二次蒸馏水定容到50ml，称取10. 8g FeCl3和4g FeCl2加入其中配成溶液，在配制过程中向溶液中不断通氮气去氧，以减少氧对溶液中离子成分的影响，应用0. 22 μ m滤菌器过滤除菌后取25ml备用，②称取15gNa0H，加二次蒸馏水配制成250ml溶液，倒入三口烧瓶中，三口烧瓶的三个口分别通氮气、接冷凝管、接温度计，再将上步所得25ml溶液快速加入，在通入氮气保护下，将烧瓶置于利用DF-101S型集热式恒温磁力搅拌器中，保持80°C 反应lh，使所得!^e3O4微粒充分熟化，反应Ih结束后持续搅拌至冷却，集热式恒温磁力搅拌器是指被加热容器完全处于强烈的热辐射之中，加热速度是其它平面加热磁力搅拌器的三倍，温度均勻、效率高，更适应球型烧瓶进行加热反应，③上步所得黑色液体倒入IL烧杯， 底部放置永磁体，加入二次蒸馏水，待在磁场中黑色物质完全沉淀后弃上层较澄清液，反复用二次蒸馏水冲洗黑色沉淀物4次，已不易沉淀，且予测pH值约8时，考虑制得的!^e3O4中性，排除了所加酸碱的影响，④所得产物利用冷冻干燥机真空冷冻干燥保存备用；步骤二 采用共混包埋法将具有良好水溶性和生物相容性的羧甲基壳聚糖包覆于磁性粒子表面，制备羧甲基壳聚糖磁性纳米复合物(CMCTS-Fe3O4NP)，共混包埋法是指将磁性超微颗粒均勻地分散在亲水性高分子水溶液中，主要是通过范德华力、氢键、配位键和共价键等作用将水溶性的高分子物质缠绕在无机磁性颗粒表面，形成聚合物包被的核-壳式磁性高分子微球①称取制备冻干的140mg Fe3O4纳米粒子溶于40ml 二次蒸馏水后，通氮气去氧，利用超声波清洗机的超声在65°C将磁性粒子分散均勻，以构建下步和羧甲基壳聚糖的反应环境，②称取^Omg羧甲基壳聚糖(CMCTS)于20ml 二次蒸馏水溶勻，快速倒入上步液体中，继续通氮气去氧，超声下65°C反应lh，③将最后得到的黑色液体利用外加磁场沉淀，弃除上层清液以除外未包覆的杂质后，再加入二次蒸馏水定容至60ml，溶勻即成 CMCTS-Fe3O4NP胶体液，密封4°C保存备；步骤三以乳糖为乳糖化试剂，借助CMCTS分子上的游离氨基作交联基团，通过还原氨化法偶联上乳糖中的去唾液酸半乳糖配体，制备同时具有磁靶向和肝靶向性的乳糖修饰的羧甲基壳聚糖磁性纳米复合物(Gal-CMCTS-Fi5304NP)①将制备的60ml CMCTS-Fe3O4NP胶体液利用超声37°C分散均勻，②称取336mg乳糖和168mg氰基硼氢化钠慢慢加入上步液体中， 利用超声在37°C搅拌反应lh，③将最后得到的黑色液体利用凝胶的分子筛特性，经葡聚糖凝胶kphedaxG-25柱层析分离，选择0. lmol/L碳酸氢铵溶液洗脱，收集洗脱部分即为较纯化的(GaI-CMCTS-Fi53O4NP)胶体液，真空冰冻干燥保存备用。
全文摘要
本发明涉及乳糖化羧甲基壳聚糖Fe3O4纳米粒基因载体的制备方法，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是分三步完成，其特征是步骤一采用传统共沉淀法利用化学式Fe2++2Fe3++8OH-→Fe3O4+4H2O制备Fe3O4纳米粒子，传统共沉淀法是在生成磁性物质的同时产生磁性高分子微球的制备方法；步骤二采用共混包埋法将具有良好水溶性和生物相容性的羧甲基壳聚糖包覆于磁性粒子表面，制备羧甲基壳聚糖磁性纳米复合物(CMCTS-Fe3O4NP)；步骤三以乳糖为乳糖化试剂，借助CMCTS分子上的游离氨基作交联基团，通过还原氨化法偶联上乳糖中的去唾液酸半乳糖配体，制备同时具有磁靶向和肝靶向性的乳糖修饰的羧甲基壳聚糖磁性纳米复合物(Gal-CMCTS-Fe3O4NP)。
文档编号A61K47/36GK102309762SQ20111026872
公开日2012年1月11日 申请日期2011年9月6日 优先权日2011年9月6日
发明者俞铖, 冯盈, 李厚祥, 李鹏, 毛勤生, 薛万江, 郭益冰 申请人:薛万江