专利名称：一种卵黄抗体微囊制剂的制备方法及用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及治疗、预防轮状病毒感染生物新药的制备以及开发，特别是抗轮状病毒卵黄抗体微囊制剂的制备方法及用途。
背景技术：
腹泻病是我国儿童的高发病，约占儿科总住院人数的12% 24%，其中8 12月以轮状病毒引起的秋季腹泻为主。应用抗轮状病毒鸡卵黄免疫球蛋白(IgY)治疗轮状病毒性肠炎，为采用被动免疫保护及治疗轮状病毒性肠炎提供了一条新途径。但迄今为止，注射仍然是这类药物临床应用的唯一给药途径，存在突出问题是·药物在血液中半衰期短，需长期频繁注射，造成患者在身体、精神、经济上的极大负担，患者治疗依从性差； 注射剂型生产条件苛刻，需严格控制热源、内毒素等指标，造成工艺复杂，生产成本高；·由于无载体保护，药物贮运条件苛刻，贮运成本高等，这些问题最终会限制IgY抗体药物产品的品种与市场。因此，发展该药物非注射给药途径是当前国内外医药界共同关注的重大课题，也是世界性难点。可能的非注射给药途径有吸入给药、粘膜给药、眼部给药、口服给药等。其中，口服给药因方便、安全而成为国际抗体药物的发展前沿，但面临的重大难题是·药物直接口服易被胃酸及消化道酶降解； 作为水溶大分子，药物释放难以控制。
针对上述难题，目前采取的研究对策有·添加蛋白酶抑制剂； 肠溶包衣；籲结肠给药； 微囊载体等。其中，生物微囊技术可能是实现蛋白质药物口服给药最有希望的解决途径。生物微囊技术是由天然或合成的高分子材料通过生物材料相互作用，制备成微囊这种多单元剂型，延长与胃肠道的接触时间，从而达到缓慢释放的目的；微囊膜具有选择通透特性，可控制不同分子的释放；保护微囊内生物分子的酶解、酸碱降解。理论分析及实践表明，在小肠，粒径< ΙΟμπι颗粒性物质可通过约占小肠面积25%的集合淋巴小结(即 peyer’ s小结)快速吸收入血。peyer’ s小结中 ，微皱折细胞(即M细胞)是吸收转运微粒的功能细胞。当微粒在肠腔被M细胞内吞后，通过囊性转运方式被转运到M细胞基底面凹腔释出，经淋巴管进入胸导管，再汇总到上腔静脉，进入体循环。因此，如果将IgY药物包封在粒径< IOym的微球载体中，既能保护药物在口服途径中不被降解，还能携带药物通过小肠上皮吸收屏障。
针对上述问题，本项目利用家禽受到外来抗原(细菌、病毒等微生物)的刺激会产业免疫应答并生成相应抗体且抗体主要沉积在鸡蛋的蛋黄中这一特点，以产蛋母鸡作为生物反应器，大量、连续的产业化生产卵黄免疫球蛋白，为生产无公害、无污染的保健食品、生物制品和药物提供源头材料。同时针对抗轮状病毒鸡卵黄免疫球蛋白口服给药面临的重大难题(消化道酶屏障及酸屏障)，结合中科院大连化学物理研究所天然多糖基生物微囊技术在有效屏蔽消化道酶、释放控制、黏附可控性方面优势籲壳聚糖、海藻酸钠来源广、成本低，符合载药微囊规模化研发需求； 改性壳聚糖、海藻酸钠能在全生理条件下快速形成微球控释膜，实验表明该膜能截留胃蛋白酶、胰蛋白酶，而微球中药物能通过膜控制释放；同时，该膜能保护生物质免受胃酸破坏(例与游离状态相比，微囊化酵母细胞GS115在胃酸中存活率可提高200倍以上)，进行IgY 口服制剂的研究，为实现IgY 口服制剂的产品性能提升提供技术支撑。
发明内容
本发明的目的是要提供一种安全、可靠、经济简便、易于推广适用面广的针对轮状病毒的卵黄IgY抗体微囊制剂及其制备方法与应用。
一种卵黄抗体微囊制剂的制备方法及用途，它是由轮状病毒制备的疫苗，注射到健康产卵的雌禽体内，经此免疫后，取卵黄经除菌、分离提取，纯化得到抗轮状病毒的IgY 制剂或将含多种轮状病毒的IgY抗体制剂按比例混合，将混有IgY抗体的海藻酸盐溶液以液滴的方式加入到壳聚糖的混合液中，制备成凝胶态的AP微囊，即抗轮状病毒卵黄抗体微囊制剂。
—种卵黄抗体微囊制剂的制备方法及用途，其微囊结构分为微囊膜与内核心部分其中，微囊膜由海藻酸盐、壳聚糖形成的聚电解质复合水凝胶膜；内核为含有IgY抗体的海藻酸盐液体环境。·
一种卵黄抗体微囊制剂的制备方法及用途，其微囊膜由海藻酸盐、壳聚糖两种高分子材料通过聚电解质络合反应形成水凝胶膜。抗体微囊的制备方法如下步骤
(I)包埋有纯化IgY的海藻酸盐凝胶微球，称之为A微球；
(2)将步骤(I)中的A微球以液滴的方式加入壳聚糖溶液中，将壳聚糖用于海藻酸盐胶囊缓释的包被膜，A微球与壳聚糖溶液体积比例同为1:1 1: 40，反应I 60分钟，反应温度在O 37°C，此时得到AP微囊取出用生理盐水洗涤。
一种卵黄抗体微囊制剂的制备方法及用途，其微囊产品的膜成分中的海藻酸盐为海藻酸的钾盐或钠盐。
一种卵黄抗体微囊制剂的制备方法及用途，其抗轮状病毒卵黄抗体的制备方法如下步骤
(I)取一种或多种轮状病毒种子毒株经复苏传代，培养增殖轮状病毒，制成轮状病毒疫苗；
(2)雌禽适应性饲养，正常产卵一周后，将步骤A制成的疫苗以一定的抗原量进行免疫，加弗氏佐剂，每次O. 5mL,皮下或肌肉注射，每7天免疫一次，免疫2 4次，一般抗轮状病毒的IgY抗体在第一次免疫14天后出现，收集卵蛋，4°C保存，隔30天可加强免疫一次；
(3)采用步骤B疫苗免疫后的卵蛋，用75%的酒精消毒上述疫苗免疫后的卵黄外壳，去壳，去卵黄膜，取出卵黄，得到该抗轮状病毒的IgY抗体。
一种卵黄抗体微囊制剂的制备方法及用途，其抗轮状病毒卵黄抗体分离、纯化的制备方法如下步骤
(I)取卵黄，巴氏消毒，直接冻干，制成含有轮状病毒IgY抗体的蛋黄粉；
(2)取卵黄，采用水稀释法(WD)法，或聚乙二醇(PEG)法，或硫酸葡聚糖法，或有机溶剂抽提法，或自然胶(藻酸钠、角叉菜胶)法，或乙醇沉淀法等方法，进行分离和提取轮状病毒的IgY抗体，采用层析法，或透析法或超滤法等方法进行纯化，利用DEAE-Sepharose F. F离子交换层析柱或亲和层析法进一步纯化IgY，制得纯的轮状病毒IgY抗体液。
IgY抗体微囊制剂，在轮状病毒感染性疾病的被动免疫治疗中的应用。
IgY抗体微囊制剂，在高危人群预防轮状病毒的感染中的应用。
上述IgY抗体微囊制剂，4 °C保存，备用。
一种卵黄抗体微囊制剂的制备方法及用途
(I)在治疗或预防抗轮状病毒感染引起的相关疾病
将含有轮状病毒IgY抗体的蛋黄粉添加于食品或制成保健食品，或直接服用轮状病毒IgY抗体制成的微囊，是针对该抗轮状病毒感染引起的相关疾病的治疗方法。此外，抗轮状病毒IgY抗体微囊制剂也可作为辅助治疗法，该轮状病毒患者在常规化疗药物方案治疗期间可同时服用，增强免疫力。
对健康人群尤其对与轮状病毒患者密切接触的高危人群，服用含抗轮状病毒IgY 抗体的微囊制剂，可以预防轮状病毒的感染。将多种轮状病毒的IgY抗体微囊制剂按比例混合，制成复合型IgY抗体微囊制剂，应用于高危人群预防轮状病毒的感染。
本发明的优点在于采用实时抗轮状病毒IgY抗体微囊制剂治疗或辅助治疗轮状病毒，能克服抗轮状病毒变异性，多态性，易产生抗药性等突出的问题。
雌禽产生有效免疫所需抗原量小，易于饲养，卵蛋收集方便，治疗费用低，治疗效果好，无明显的不良反应，是一种安全、高效、经济简便、易于推广，无交叉性、不会破坏微生态平衡、适用面广的的生物制剂，是轮状病毒病治疗药物及治疗方法的新突破。
具体实施例方式
通过下面给出的本发明的具体实施例，可以进一步清楚地了解本发明的内容，但它们不是对本发明的限定 。
实施例1:
一种卵黄抗体微囊制剂的制备方法及用途包括如下步骤
(一)免疫:
选用健康母鸡，适应性饲养，正常产蛋一周后，开始免疫。注射加弗氏佐剂的轮状病毒疫苗，每次O. 5mL，皮下或肌肉注射，每7天免疫一次，共4次，抗体一般在第一次免疫 14天后出现。隔30天加强免疫一次，收集鸡蛋，4°C保存；
( 二)抗体纯化与分离制备
将上述鸡蛋外壳用75%酒精消毒，无菌环境中去壳、去卵黄膜，取卵黄，采用下述方法进行抗体制剂的制备；方法一卵黄巴氏消毒，冻干，制成含轮状病毒IgY抗体的卵黄粉，4°C保存；方法二 用WD法纯化卵黄抗体蛋白质，用微孔滤膜过滤，除菌，4°C保存；方法三用WD法纯化卵黄抗体蛋白质，调节pH4. 6 6. 0，冻融预处理后微滤(O. 45IULm)，5倍超滤浓缩，对超滤截留液用25%饱和硫酸铵盐析，经离速冷冻离心，得到IgY沉淀，PBS溶解，透析脱盐，经DEAE-Sepharose F. F离子交换层析柱法进一步纯化IgY，制得高纯度的轮状病毒IgY抗体液，4°C保存。
(三)抗轮状病毒IgY抗体微囊制剂的制备
(I)将定量的纯化IgY包埋于海藻酸盐凝胶微球，称之为A微球；
(2)将步骤(I)中的A微球以液滴的方式加入壳聚糖溶液中，将壳聚糖用于海藻酸盐胶囊缓释的包被膜，A微球与壳聚糖溶液体积比例同为1: 5，反应60分钟，反应温度37°C，此时得到AP微囊取出用生理盐水洗涤，即为抗轮状病毒IgY抗体微囊制剂。
实施例2
一种卵黄抗体微囊制剂的制备方法及用途包含如下步骤
( 一 )免疫
选用健康母鸡，适应性饲养，正常产蛋一周后，开始免疫。注射加弗氏佐剂的灭活轮状病毒疫苗，每次O. 5mL，皮下或肌肉注射，每7天免疫一次，共4次，抗体一般在第一次免疫14天后出现。隔30天加强免疫一次，收集鸡蛋，4 C保存；
( 二)抗体纯化与制备
将上述鸡蛋外壳用新洁尔灭消毒，去壳、去卵黄膜，取卵黄，采用下述方法进行抗体制剂的制备；方法一卵黄巴氏消毒，冻干，制成含轮状病毒IgY抗体的卵黄粉，4°c保存； 方法二 用WD法纯化卵黄抗体蛋白质，用微孔滤膜过滤，除菌，4°C保存；方法三用WD法纯化卵黄抗体蛋白质，调节PH6. O,冻融预处理后用微孔滤膜微滤，10倍超滤浓缩，对超滤截留液用45%饱和硫酸铵盐析，经离速冷冻离心，得到IgY沉淀，PBS溶解，透析脱盐，经 DEAE-Sepharose F. F离子交换层析柱法进一步 纯化IgY，制得高纯度的轮状病毒IgY抗体液，4°C保存。
(三)抗轮状病毒IgY抗体微囊制剂的制备
(I)将定量的纯化IgY包埋于海藻酸盐凝胶微球，称之为A微球；
(2)将步骤(I)中的A微球以液滴的方式加入壳聚糖溶液中，将壳聚糖用于海藻酸盐胶囊缓释的包被膜，A微球与壳聚糖溶液体积比例同为1: 8，反应30分钟，反应温度 30°C，此时得到AP微囊取出用生理盐水洗涤，即为抗轮状病毒IgY抗体微囊制剂。
实施例3
一种卵黄抗体微囊制剂的制备方法及用途
口服轮状病毒IgY抗体制成微囊是针对轮状病毒感染引起的相关疾病的治疗药物，每天使用IgY抗体微囊，一个月为I疗程。是针对轮状病毒感染引起的相关疾病的治疗方法。根据需要，可进行多个疗程的治疗。含轮状病毒IgY抗体的蛋黄粉添加于食品或制成保健食品，可作为辅助治疗法，患者在常规化治疗药物方案治疗同时可服用，以增强对轮状病毒的抵抗力。
实施例4
一种卵黄抗体微囊制剂的制备方法及用途
对健康人群尤其对于与轮状病毒患者密切接触的高危人群，服用含抗轮状病毒 IgY抗体的蛋黄粉添加于食品或制成保健食品，可以预防轮状病毒的感染。
实施例5
除了免疫对象采用鸭外，其他过程同以上实施例1。
实施例6
除了免疫对象采用鹌鹑外，其他过程同以上实施例1。
权利要求
1.一种卵黄抗体微囊制剂的制备方法及用途，其特征是它是由轮状病毒制备的疫苗，注射到健康产卵的雌禽体内，经此免疫后，取卵黄经除菌、分离提取，纯化得到抗轮状病毒的IgY制剂或将含多种轮状病毒的IgY抗体制剂按比例混合，将混有IgY抗体的海藻酸盐溶液以液滴的方式加入到壳聚糖的混合液中，制备成凝胶态的AP微囊，即抗轮状病毒卵黄抗体微囊制剂。
2.一种卵黄抗体微囊制剂的制备方法及用途，根据权利要求1所述，其特征是微囊结构分为微囊膜与内核心部分；其中，微囊膜由海藻酸盐、壳聚糖形成的聚电解质复合水凝胶膜；内核为含有IgY抗体的海藻酸盐液体环境。
3.一种卵黄抗体微囊制剂的制备方法及用途，根据权利要求2所述，其特征是微囊膜由海藻酸盐、壳聚糖两种高分子材料通过聚电解质络合反应形成水凝胶膜。抗体微囊的制备方法如下步骤(1)包埋有纯化IgY的海藻酸盐凝胶微球，称之为A微球；(2)将步骤(I)中的A微球以液滴的方式加入壳聚糖溶液中，将壳聚糖用于海藻酸盐胶囊缓释的包被膜，A微球与壳聚糖溶液体积比例同为1:1 1: 40，反应I 60分钟，反应温度在O 37°C，此时得到AP微囊取出用生理盐水洗涤。
4.一种卵黄抗体微囊制剂的制备方法及用途，按照权利要求2或3所述的微囊，其特征在于微囊产品的膜成分中的海藻酸盐为海藻酸的钾盐或钠盐。
5.一种卵黄抗体微囊制剂的制备方法及用途，根据权利要求1所述，抗轮状病毒卵黄抗体的制备方法如下步骤(1)取一种或多种轮状病毒种子毒株经复苏传代，培养增殖轮状病毒，制成轮状病毒疫苗；(2)雌禽适应性饲养，正常产卵一周后，将步骤A制成的疫苗以一定的抗原量进行免疫，加弗氏佐剂，每次O. 5mL,皮下或肌肉注射，每7天免疫一次，免疫2 4次，一般抗轮状病毒的IgY抗体在第一次免疫14天后出现，收集卵蛋，4°C保存，隔30天可加强免疫一次；(3)采用步骤B疫苗免疫后的卵蛋，用75%的酒精消毒上述疫苗免疫后的卵黄外壳，去壳，去卵黄膜，取出卵黄，得到该抗轮状病毒的IgY抗体。
6.一种卵黄抗体微囊制剂的制备方法及用途，抗轮状病毒卵黄抗体分离、纯化的制备方法如下步骤(1)取卵黄，巴氏消毒，直接冻干，制成含有轮状病毒IgY抗体的蛋黄粉；(2)取卵黄，采用水稀释法(WD)法，或聚乙二醇(PEG)法，或硫酸葡聚糖法，或有机溶剂抽提法，或自然胶(藻酸钠、角叉菜胶)法，或乙醇沉淀法等方法，进行分离和提取轮状病毒的IgY抗体，采用层析法，或透析法或超滤法等方法进行纯化，利用DEAE-Sepharose F. F 离子交换层析柱或亲和层析法进一步纯化IgY，制得纯的轮状病毒IgY抗体液。
7.权利要求1所述IgY抗体微囊制剂，在轮状病毒感染性疾病的被动免疫治疗中的应用。
8.权利要求1所述复合型IgY抗体微囊制剂，在高危人群预防轮状病毒的感染中的应用。
全文摘要
发明公开了一种卵黄抗体微囊制剂的制备方法及用途，它是由轮状病毒制备的疫苗，注射到健康产卵的雌禽体内，经此免疫后，取卵黄经除菌、分离提取，纯化得到抗轮状病毒的IgY制剂或将含多种轮状病毒的IgY抗体制剂按比例混合，将混有IgY抗体的海藻酸盐溶液以液滴的方式加入到壳聚糖的混合液中，制备成凝胶态的AP微囊，即抗轮状病毒卵黄抗体微囊制剂。用于该轮状病毒病感染患者的被动免疫治疗，及高危人群预防轮状病毒。
文档编号A61K39/395GK102988329SQ20111027281
公开日2013年3月27日 申请日期2011年9月15日 优先权日2011年9月15日
发明者赵钢, 王智佳, 王国新 申请人:天津济命生生物科技有限公司