专利名称：粉防己碱在制备抑制肝星状细胞迁移的药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明属中药领域，具体涉及粉防己碱在制备抑制肝星状细胞迁移的药物中的应用。
背景技术：
粉防己碱又名汉防己甲素，是防己科植物粉防己的主要生物活性成分，属双苄基异喹啉类化合物，是Ca2+拮抗剂，既可阻滞细胞膜电压门控通道介导的Ca2+内流，还可以阻滞受体门控通道干预细胞内Ca2+分布，从而阻断有关病理过程；如抑制纤维形成细胞的增殖，ECM(extracellular matrix,细胞外基质)的合成、排泌,生长因子的促纤维化作用等。 研究发现其有对心血管系统，肝、肺纤维化、炎症反应等有较好的治疗作用。粉防己碱能够显著减轻CCl4诱导大鼠实验性肝纤维化程度，降低纤维化大鼠血清ALT、HA、PIIIP含量，改善肝功能，抑制ECM形成。临床研究显示肝硬化患者口服粉防己碱6-18个月后，血清PIIIP、HA含量显著下降，肝、肾功能不同程度得以改善，活检发现治疗后患者肝组织炎性细胞浸润明显减轻或消失，胶原纤维沉积减少，I型及III型胶原含量显著下降。各种肝脏疾病，如慢性乙型肝炎、慢性丙型肝炎，酒精性或非酒精性脂肪性肝病，自身免疫性肝病，药物性肝病，慢性血吸虫病以及一些代谢性或先天性慢性肝病都可通过肝纤维化发展成肝硬化。肝星状细胞Ofepatic Stellate Cell，HSC)在肝纤维化的发生发展中起着关键作用。在肝脏炎症状态下，HSC经多种细胞因子如血小板衍生生长因子(TOGF)和转化生长因子β UTGF-β I)的激活，活化为肌成纤维细胞并大量增殖，表达α-平滑肌肌动蛋白、合成分泌大量细胞外基质，细胞可以收缩，亦可从Disse腔内向肝细胞坏死区域迁移聚集。肝纤维化进程中，HSC所表现出的迁移特性，可导致炎症区域活化的HSC数目增多，而加重病灶局部的纤维化程度，促使疾病进展。所以，如能抑制HSC在肝损伤时向炎症区域迁移，就可能干扰或减轻肝纤维化的进程，达到抗肝纤维化的目的。而HSC的迁移受到多种细胞因子和细胞外基质成分的调控，如，H)GF、TGF-13 I等；其中TOGF是最强的促进HSC增殖迁移的刺激因子。为此，本发明设计了以TOGF诱导的人肝星状细胞株(LX-2)迁移的筛选平台，筛选出粉防己碱抑制HSC迁移的适宜浓度及其最佳的工作浓度。目前，对粉防己碱在抑制肝星状细胞迁移中的作用尚未见相关报道。
发明内容
本发明要解决的技术问题在于提供粉防己碱的新用途。为解决上述技术问题，本发明提供粉防己碱在制备抑制肝星状细胞迁移的药物中的应用。所述粉防己碱抑制肝星状细胞迁移的有效浓度为10_4mol/L 10_7mol/L，优选为106mol/L。本发明设计了以TOGF诱导的人肝星状细胞株(LX-2)迁移的筛选平台，筛选出粉防己碱抑制HSC迁移的适宜浓度及其最佳的工作浓度。实验证明10_4mol/L、10_5mol/L、10_6mol/L和10_7mol/L 4个浓度梯度的粉防己碱均可抑制I3DGF诱导的LX-2迁移。抑制迁移作用最强的10_4mol/L组与其他3组之间有统计学差异，但10_5mol/L组和10_6mol/L组之间无统计学差异，抑制迁移作用最弱的10_7mol/L组与其它3组比较均有统计学差异。在与迁移同等条件下培养细胞时发现，10_4mol/L组较正常培养的细胞包体回缩为小圆形且明显变小，胞浆内可见黑色颗粒状物质；10_5mol/L组的部分细胞胞体亦明显回缩。遵从药物筛选原则，舍弃10_4mOl/L、10_5mOl/L粉防己碱，选择与10_7mol/L组有统计学差异者即10_6mol/L粉防己碱。从而本发明验证了 10_4mol/L 10_7mol/L的粉防己碱均可抑制TOGF诱导的HSC的迁移，从而可干扰或减轻肝纤维化的进程，达到抗肝纤维化的效果，即本发明验证了粉防己碱可用于制备抑制肝星状细胞迁移的药物。
图1是本发明试验例中细胞迁移杯(Transwell)的示意图；细胞迁移杯为一个可放置在孔板里的小杯子，其关键部分就是杯底层一张半透膜(一般是聚碳酸酯膜)此膜有 密度均一的许多微孔，孔径为8. O μ m。将Transwell放入24孔培养板中形成Transwell与培养板的双腔系统，Transwell内称上室,培养板内称下室,上下层培养液以半透膜相隔。将细胞种在上室内，由于聚碳酸酯膜有通透性，下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞，上层中的细胞亦可迁移至下层，从而可以研究下层培养液中的成分对细胞生长、运动等的影响。图2是本发明试验例中不同浓度粉防己碱对LX-2迁移和形态学的影响示意图；图2A表示对TOGF诱导的人LX-2迁移的抑制(苏木素染色，X 200)；图2B表示对LX-2形态的影响，X 200。
具体实施例方式以下通过试验例对本发明粉防己碱的药理活性试验及结果作进一步的阐述试验例一、材料与方法(一)材料粉防己碱Tetrandrine,分子式(C38H42N2O6),分子量623,纯度彡 ％ % (byHPLC),购自于南京泽朗医药科技有限公司。人肝星状细胞株LX-2，其制备方法为约15g重正常人肝脏组织先后经链酶蛋白酶和胶原酶消化后，由8. 2% Nycodenz离心分离得肝星状细胞(HSC)。细胞用含10%胎牛血清的M199培养液培养。当细胞长满培养皿后，用胰蛋白酶和EDTA消化传代，每7_10传代一次。当HSC培养传到4代，将SV40T-抗原DNA转染入HSC，获得细胞株LX-1。该细胞用含10%胎牛血清的DMEM培养液培养7代后，与原代细胞相比形态发生明显变化，增殖加快。LX-2是以含1%胎牛血清的DMEM培养液培养半年后筛选得到的耐低血清(2%胎牛血清)培养的细胞株(具体参见L Xu, A Y Hui,E Albanis,M J Arthur, S M 0’Byrne,WS Blaner,PMukherjee,S L FriedmaniF J Eng. Human hepatic stellate cell lines,LX-1and LX-2 new tools for analysis of hepatic fibrosis Gut 2005 ;54 :142-151.)。
O. 1% I 型胶原溶液(Col I，lot 107K2331)(美国 sigma 公司)。PDGF (血小板衍生生长因子)，分子量12. 4kDa, Cat. No. 220BB，纯度> 97% (SDSPAGE)购于 R&D Systems, Inc。( 二 )方法1.粉防己碱浓度配制粉防己碱取20mg。粉防己碱溶于3. 2ml DMSO (二甲基亚砜)中，成l(T2mol/L储存液。将上述粉防己碱储存液均分别经O. 45 μ m滤膜过滤除菌，以含3 % FBS的DMEM培养基依次稀释为 l(T4mol/L，l(T5mol/L，l(T6mol/L，l(T7mol/L 共 4 个浓度梯度。 2.细胞迁移筛选实验(采用如图1所示的细胞迁移杯)(I)细胞培养与药物孵育将LX-2用含10% FBS DMEM在Φ IOOmm的培养皿中培养至细胞密度达到80%左右。于迁移实验开始前24h，将细胞按表I或表2分组，每组I皿并将培养液更换为3%FBSDMEM。于迁移实验开始12h前，按照分组情况加入培养液或相应药物的浓度进行孵育，药物孵育时间为12h。表1.粉防己碱筛选实验细胞分组和孵育用药
分空白对PDGF 组PDGFPDGFPDGFPDGF组昭相 /、、、-H1.+10'4 mol/L 组+ΙΟ·5 mol/L组+ΙΟ·6 mol/L组+ΙΟ·7 mol/L组用3%FBS3%FBSIO'4 mol/LIO'5 mol/L粉IO'6 mol/L粉IO'7 mol/L粉药粉防己碱防己碱防己碱防己碱 表2.粉防己碱的最佳浓度统一筛选实验细胞分组和孵育用药
分组空白对照组 PDGF组 PDGF +
粉防已碱组
用药^3%FBS3%FBS 粉防已碱(2)以I型胶原包被细胞迁移杯半透膜将I型胶原用DMEM以1: 100稀释至10 μ g/ml (Col I溶液)。取24孔板，加入Col I溶液600 μ I/孔；用无菌镊子取细胞迁移杯放入加有Col I溶液的培养孔内，在每个细胞迁移杯内加入Col I溶液400μ1。放入恒温箱，37°C，45min。(3)接种细胞从恒温箱中取出孵育培养24h的LX-2，用胰蛋白酶传代细胞后，用含3% FBS的DMEM重悬细胞并调整细胞数为2 4X IO5个/ml。取出已包被Col I溶液的细胞迁移杯，吸弃细胞迁移杯内液体并用DMEM清洗2次，移入另一 24孔板(每孔预加O. 5ml含3% FBS的DMEM)。每个细胞迁移杯内加入300 μ I细胞悬液，放入CO2培养箱，37°C，lh。
(4)药物配制与添加①TOGF的添加将接种有LX-2的细胞迁移杯取出，吸弃上层培养液后移入另一24孔板，并依照表I或表2加药(每组3孔)；含TOGF各组中加入TOGF并使其终浓度为10ng/mlο②粉防己碱筛选将粉防己碱依照表3加药(每组3孔)。本实验重复3次。表3粉防己碱筛选实验药物添加表
空白对~PDGF 组 PDGFPDGFPDGFPDGF
昭钼+IO'4 mol/L +IO-5 mol/L组 +IO-6 mol/L组 +IO-7 mol/L组/、、、>-~π.
组
TE^3%FBS^3%FBS^IO'4 mol/L10_5 mol/L粉^10_6 mol/L粉^10_7 mol/L粉
层粉防己碱防己碱防己碱防己碱
下 3%FBS PDGF PDGF +IO4PDGF+IO'5 PDGF+106 PDGF+107
层mol/L粉防mol/L粉防己 mol/L粉防己 mol/L粉防己
己喊喊喊喊③粉防己碱的最佳浓度统一筛选以含3% FBS的DMEM配制；筛选出的粉防己碱的最佳浓度，依照表4加药(每组3孔)。本实验重复3次。表4粉防己碱的最佳浓度统一筛选实验药物添加表
空白对照组PDGF组PDGF +
粉防已碱组^±1 一3%FBS3%FBS 粉防已碱
下层 3%FBSPDGF PDGF +
粉防已碱(5)细胞培养将加入各相应药物的培养装置放入CO2培养箱，370C，6h。(6)细胞固定与染色取出细胞迁移杯，PBS清洗2次；医用消毒棉签轻轻擦去细胞迁移杯底部半透膜内侧面未迁移的细胞，PBS清洗2次；将其放入盛有4%多聚甲醛的24孔板内固定IOmin，PBS清洗I次；放入盛有苏木素的24孔板染色10min，PBS清洗2次；放入盛有100%酒精24孔板中固定Imin ;室温自然晾干。用手术刀片小心将半透膜自细胞迁移杯底部取下，置于载玻片上，中性树胶封片。(7)细胞计数200倍显微镜下观察细胞，由上至下取5个视野计数。(8)统计学方法
将每样本5个视野细胞数相加，求得均数。用SPSS13. O统计软件进行数据分析处理，结果以i±S表示，采用单因素方差分析，Q检验。
(9)药物筛选原则①选择对细胞生长和形态无影响的粉防己碱浓度。②在满足上条规定的前提下，选择同一粉防己碱同批迁移试验中迁移细胞数量少而有统计学差异的浓度低者，即抑制迁移效率最佳者。如各浓度间迁移细胞数量无统计学差异，则选择抑制迁移效果最佳者，即迁移细胞数量绝对值最小者。③在筛选出的粉防己碱最佳浓度的同批迁移实验结果中，选择有统计学差异抑制
率最闻者。3.细胞生长和形态观察实验在24孔板中培养LX-2，培养条件、时间和药物添加均同上述各细胞迁移筛选实验。各实验均重复3次。二、结果粉防己碱抑制TOGF致细胞迁移的浓度筛选实验结果如图2所示，与空白组相比，PDGF组可有效诱导LX-2迁移，其差异有统计学意义(P < O. 05)。l(T4mol/L、l(T5mol/L、10-6mol/I^Pl(Tmol/L 4个浓度的粉防己碱均可抑制TOGF诱导的LX-2迁移(P均<0.05)；抑制迁移作用最强的10_4mol/L组与其他3组之间有统计学差异，但10_5mol/L组和10_6mol/L组之间无统计学差异，抑制迁移作用最弱的10_7mol/L组与其它3组比较均有统计学差异(见表5，图2A)。在与迁移同等条件下培养细胞时发现，10_4mol/L组较正常培养的细胞包体回缩为小圆形且明显变小，胞浆内可见黑色颗粒状物质；l(T5mol/L组的部分细胞胞体亦明显回缩(见图2B)。遵从药物筛选原则，舍弃10_4mol/L、10_5 mol/L粉防己碱，选择与10^7mol/L组有统计学差异者即10_6mol/L粉防己碱。表5粉防己碱抑制细胞迁移的数量比较(X 土SD)
权利要求
1.粉防己碱在制备抑制肝星状细胞迁移的药物中的应用。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述粉防己碱抑制肝星状细胞迁移的有效浓度为 10 4mol/L 10 7mol/L0
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述粉防己碱抑制肝星状细胞迀移的有效浓度为 10—6mol/L。
全文摘要
本发明公开了粉防己碱在制备抑制肝星状细胞迁移的药物中的应用。本发明设计了以PDGF诱导的人肝星状细胞株(LX-2)迁移的筛选平台，发现10-4mol/L～10-7mol/L的粉防己碱均可抑制PDGF诱导的肝星状细胞(HSC)的迁移。
文档编号A61P1/16GK102988367SQ20111027464
公开日2013年3月27日 申请日期2011年9月16日 优先权日2011年9月16日
发明者徐列明, 张展 申请人:上海中医药大学附属曙光医院