专利名称：一种来源于纳豆的脂肪酶抑制剂及其制备方法和用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种脂肪酶抑制剂及其用途，特别涉及一种来源于纳豆的脂肪酶抑制剂及其用途。本申请是申请号为200710175440. O的分案申请。
背景技术：
随着经济的发展、人们生活水平的提高以及生活方式的改变，肥胖已成为全球成年人最大的慢性疾病。据研究报道，肥胖与许多现代疾病直接相关，肥胖者患心脑血管疾病、糖尿病、高血压、冠心病、胆囊疾病、痛风、呼吸道疾病、和某些肿瘤的风险很大，而高血脂、内脏脂肪更是诸多生活习惯病的元凶，因此肥胖不仅影响人的外观体型，而且严重威胁到了人类的健康。目前，美国FDA只批准了2种药物可以长期用于肥胖症治疗西布曲明 (Sibutramine)和奥利司他(Orlistat)。西布曲明是一种单胺类神经递质再摄取抑制剂， 它作用于中枢神经系统以减少摄食而降低体重，但该药可能引起患者血压升高、心率加快， 且不能用于冠心病、心率失常和卒中等病史的患者中，使该药应用受到限制。肥胖症和高胆固醇血症在一定程度上与脂肪摄入有关，饮食脂肪在胃肠道被脂肪酶尤其是胰脂肪酶水解为脂肪酸和甘油三酯才能被人体吸收。因此，对胰脂肪酶的抑制可以导致对脂肪吸收的抑制，进而达到减肥降脂的目的。
发明内容
本发明的一个目的在于公开一种来源于枯草芽孢杆菌属(Bacillussubtilis)微生物，尤其是纳豆芽孢杆菌(Bacillus subtilis natto或Bacillus natto)的脂肪酶抑制剂，本发明的另一个目的在于公开这种脂肪酶抑制剂的制备方法及用途。本发明目的是通过如下技术方案实现的本发明脂肪酶抑制剂的制备方法如下将纳豆芽孢杆菌(保藏于“中国微生物菌种保存管理委员会普通微生物中心”，位于北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所；保藏号为CGMCC2186，保藏日期2007 年9月25日)，在琼脂斜面培养基上进行活化培养，培养温度30-40°C，培养时间为16-48 小时；将活化后的纳豆芽孢杆菌转入种子培养基中培养16-48小时；再将上述培养好的种子培养基中的种子液移至固体发酵培养基中培养16-144小时，或移至液体发酵培养基中培养16-144小时，培养温度为30-40°C，液体培养pH控制范围4_9，即可得到含有抑制脂肪酶的活性成分，即纳豆脂肪酶抑制素的培养物；再用已知的提取分离技术获取和分离对于固体发酵，在上述培养物中加入1-5重量倍的50% -95%乙醇，超声30-90分钟，滤出提取液，再加入1-3重量倍的50 % -95 %乙醇，第二次超声30-90分钟，滤出提取液，合并两次乙醇提取液；用60°C -90°C水浴薄膜减压蒸发浓缩，将浓缩液用1-4倍体积乙酸乙酯萃取三次，合并三次乙酸乙酯萃取液，用50°C -90°C水浴减压旋转蒸发浓缩至膏状，得含有脂肪酶抑制活性成分，即纳豆脂肪酶抑制素的乙酸乙酯萃取浓缩物；对于液体发酵，将上述培养物离心，得离心清液和湿菌体沉淀；离心清液用 80°c -10(TC水浴薄膜减压蒸发浓缩，得浓缩液；将浓缩液用1-3倍体积氯仿萃取三次，合并三次氯仿萃取液，用50°C -90°C水浴减压旋转蒸发浓缩氯仿萃取液，浓缩至膏状，得含有脂肪酶抑制活性成分的氯仿萃取物；湿菌体沉淀放-10°C -30°C冰箱冷冻15-30小时，置室温解冻后加入1-3倍体积倍甲醇，超声提取2次，每次30-90分钟；合并两次提取液，用 400C -70°C水浴减压旋转蒸发浓缩至无醇味，得含有脂肪酶抑制活性成分，即纳豆脂肪酶抑制素的甲醇提取浓缩物。本发明脂肪酶抑制剂的优选制备方法如下将纳豆芽孢杆菌(保藏于“中国微生物菌种保存管理委员会普通微生物中心”，位于北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所；保藏号为CGMCC2186，保藏日期2007 年9月25日)，在琼脂斜面培养基上进行活化，培养温度37°C ±1°C，培养时间为22-26小时；将活化后的纳豆芽孢杆菌转入种子培养基中培养20-24小时；将上述培养好的种子培养基中的种子液移至固体发酵培养基中培养68-96小时，或移至液体发酵培养基中培养 68-96小时，培养温度均为37°C 土 1°C，液体发酵pH控制范围为4. 5-8. 5，即可得到含有脂肪酶抑制活性成分，即纳豆脂肪酶抑制素的培养物；再用已知的提取分离技术获取和分离对于固体发酵，在上述培养物中加入2. 5重量倍的95%乙醇，超声60分钟，滤出提取液，再加入2重量倍的80%乙醇，第二次超声60分钟，滤出提取液，合并两次乙醇提取液；用80°C水浴薄膜减压蒸发浓缩，将浓缩液用2-3倍体积乙酸乙酯萃取三次，合并三次乙酸乙酯萃取液，用70°C水浴减压旋转蒸发浓缩至膏状，得含有脂肪酶抑制活性成分，即纳豆脂肪酶抑制素的乙酸乙酯萃取浓缩物；对于液体发酵，将上述培养物离心，得离心清液和湿菌体沉淀；离心清液用 80-10(TC水浴薄膜减压蒸发浓缩，得浓缩液；将浓缩液用2倍体积氯仿萃取三次，合并三次氯仿萃取液，用70°C水浴减压旋转蒸发浓缩氯仿萃取液，浓缩至膏状，得氯仿萃取物；湿菌体沉淀放_20°C冰箱冷冻24小时，置室温解冻后加入2-3体积倍甲醇，超声提取2次，每次 60分钟；合并两次提取液，用60°C水浴减压旋转蒸发浓缩至无醇味，得含有脂肪酶抑制活性成分，即纳豆脂肪酶抑制素的甲醇提取浓缩物。其中，上述培养基可以包含一种或多种碳源和一种或多种氮源和任选营养无机盐和/或微量元素碳源包括但不限于淀粉、葡萄糖、鹿糖、糊精、糖蜜、甘油，优选葡萄糖；氮源包括但不限于大豆、大豆粉、大豆饼粉、花生粉、花生饼粉、酵母提取物、牛肉提取物、蛋白胨、大豆蛋白胨、麦芽提取物、玉米浆，固体培养优选大豆，液体培养优选大豆蛋白胨；营养无机盐包括但不限于磷酸盐磷酸氢钠、磷酸氢钾、磷酸氢铵、氯化钠、氯化钙、硫酸镁、硝酸钾、硫酸铵、碳酸钙，优选磷酸氢钠、氯化钙和硫酸镁。其中，上述提取分离技术中所使用的乙醇、乙酸乙酯、氯仿、甲醇等溶剂可以用其他水不混溶剂如乙酸丁酯、二氯甲烷等，或水可混溶剂丙酮、乙腈、正丙醇、正丁醇、异丙
醇等代替。本发明的脂肪酶抑制剂是通过培养枯草芽孢杆菌属微生物(Bacillussubtilis) 尤其是纳豆芽孢杆菌(Bacillus subtilis natto或Bacillusnatto)来获得,包括枯草芽孢杆菌属微生物的诱变育种菌种；本发明是通过抑制脂肪酶活性而达到减肥降脂的目的， 其新颖性在于①该脂肪酶抑制剂来源于食用纳豆，对人体没有毒副作用该脂肪酶抑制剂选择性地作用于胃肠道脂肪酶尤其是胰脂肪酶，而对蛋白酶和淀粉酶等没有抑制作用。下述实验例和实施例用于进一步说明但不限于本发明。实验例I :本发明纳豆脂肪酶抑制剂对脂肪酶抑制作用实验I、制备样品溶液定量称取上述纳豆提取物(或浓缩物)I. 000克，用5毫升95%乙醇溶液溶解，不溶物离心去除，再用95%乙醇适当稀释，稀释浓度见表1，取稀释液I毫升按照下述脂肪酶活力抑制率的测定方法检测。2、脂肪酶活力抑制率的测定A.准备试剂、橄榄油乳液及测定酶液橄榄油乳化液的制备取橄榄油12ml与阿拉伯树胶22. 5g，研磨均匀，加水研磨至 300ml，用18000转/min的匀质机乳化2次，每次3分钟；取乳剂在显微镜下检查，90%乳粒的直径在3 μ m以下，并不得有10 μ m的乳粒，即可；牛胆盐溶液的制备精密称取牛胆盐8. Og,置于50ml烧杯中，以水溶解，转移至 IOOml容量瓶中定容；O. lmol/L氢氧化钠溶液的制备精密称取氢氧化钠2. 0g，加水溶解定容至 500ml ；三羟甲基氨基甲烷缓冲液制备取三羟甲基氨基甲烷3.030g，用O. lmol/L盐酸溶液调PH值至8. 0，加水至500ml，摇匀，再调节pH值至8. O ；脂肪酶溶液的制备精密称取胰脂肪酶(SIGMA L3126)于容量瓶中，用冷却至5°C 以下的三羟甲基氨基甲烷缓冲液溶解，制成每Iml中含胰脂肪酶100活力单位的溶液，作为酶原液备用；绘制标准曲线时，将酶原液用三羟甲基氨基甲烷缓冲液稀释至不同梯度90u/ ml、80u/ml、70u/ml、60u/ml、50u/ml、40u/ml、30u/ml、20u/ml、10u/ml 的测定酶液；0u/ml 的测定酶液(酶空白)是在水浴中煮沸15-30分钟的酶原液。B.建立脂肪酶测活体系1)95%乙醇为样品空白溶液脂肪酶测活体系取橄榄油乳液25ml、8%牛胆盐溶液2ml与水10ml，置IOOml三角瓶中，加95%乙醇溶液1ml，用O. lmol/L氢氧化钠溶液调节pH值至9. O ；2)样品溶液脂肪酶测活体系取橄榄油乳液25ml、8%牛胆盐溶液2ml与水10ml， 置IOOml三角瓶中，加Iml上述样品溶液，用0. lmol/L氢氧化钠溶液调节pH值至9. O。C.绘制脂肪酶抑制率“Y%”与pH变化幅度“ ΛρΗ”关系标准曲线绘制标准曲线时，先将不同梯度的测定酶液换算成对应的抑制率，抑制率换算公式Y(% ) = (X0-Xn)/X0Υ(% )-表示脂肪酶抑制率X0-表示酶原液浓度(u/ml)Xn-表示不同稀释度的酶液浓度(u/ml)；设定酶浓度为零时，抑制率为100%;设定酶原液浓度的抑制率为O，将酶原液按一定梯度稀释成 90u/ml、80u/ml >7Ou/ml、60u/ml、50u/ml、40u/ml、30u/ml、20u/ml、IOu/ml 的测定酶液，则对应的抑制率Y%分别为10%,20%,30%,40%,50%,60%,70%,80%,90%； 按照标准曲线绘制法绘制标准曲线，本发明的标准曲线绘制法如下将上述95%乙醇空白溶液脂肪酶测活体系在37°C水浴中保温10分钟，用O. Imol/ L氢氧化钠溶液调节pH值至9. O ;精密量取上述不同梯度浓度的测定酶液I体积份，分别加至空白溶液测活体系中，在37°C水浴中准确反应5分钟，同时记录反应前后pH值，并计算反应前后pH差值；用酶浓度为100u/ml时反应前后的pH差值,分别减去酶浓度为90u/ml、 80u/ml、70u/ml、60u/ml、50u/ml、40u/ml、30u/ml、20u/ml、10u/ml、0u/ml 时反应前后的 pH 差值，即得到对应不同抑制率的PH变化幅度“ ΛρΗ”值；以抑制率为纵坐标，“ ΛρΗ”值为横坐标，绘制脂肪酶抑制率“Υ%”与pH变化幅度“ΛρΗ”关系标准曲线，并得到95%为空白样品溶液的脂肪酶抑制率计算公式。D.测定方法及样品溶液脂肪酶抑制率的计算空白溶液测定将上述95%乙醇空白溶液脂肪酶测活体系在37°C水浴中保温10 分钟，用O. lmol/L氢氧化钠溶液调节pH值至9. O ;精密量取酶原液Iml加至空白溶液测活体系中，在37°C水浴中准确反应5分钟，同时记录反应前后pH值，并计算空白溶液反应前后的PH差值，记为Al ;另取在水浴中煮沸15-30分钟的上述酶原液I体积份，照上述方法测定作酶空白对照，PH差值记为AO ;则空白溶液酶反应的pH变化值为Λ A = Al-AO ；样品溶液测定将样品溶液脂肪酶测活体系在37°C水浴中保温10分钟，用 O. lmol/L氢氧化钠溶液调节pH值至9. O ;精密量取酶原液I体积份加至样品溶液测活体系中，在37°C水浴中准确反应5分钟，同时记录反应前后pH值，并计算样品溶液反应前后的 PH差值，记为BI ;另取在水浴中煮沸15-30分钟的上述酶原液I体积份，照上述方法测定作酶空白对照，PH差值记为BO ;则样品溶液酶反应的pH变化值为ΛΒ = B1-B0 ；测定样品的脂肪酶抑制率的计算用空白溶液酶反应的pH变化值(ΛΑ)减去样品溶液酶反应的PH变化值(ΛΒ)，即得到空白溶液与样品溶液酶反应的“ Λ pH”值，即ΛρΗ = Λ A-Λ B，将此“ Λ pH”值代入上述相应的空白溶液的脂肪酶抑制率计算公式，即求得测定样品的脂肪酶抑制率，结果见表I :表I纳豆提取物的脂肪酶活力抑制率
测定样品样品浓度(mg/ml)脂肪酶活力抑制率(％)乙酸乙酯萃取物20. 260. 4氯仿萃取物20. 471. 7乙醇提取物20. I49. I甲醇提取物20. 455. 4实验例2 :本发明纳豆脂肪酶抑制剂对脂肪酶抑制作用实验定量称取上述纳豆提取物(或浓缩物)I. 000克，用5毫升95%乙醇溶液溶解，不溶物离心去除，再用95%乙醇适当稀释，稀释浓度见表2，取稀释液I毫升按照下述脂肪酶活力抑制率的测定方法检测。2、脂肪酶活力抑制率的测定A.准备试剂、橄榄油乳液及测定酶液三羟甲基氨基甲烷缓冲液制备取三羟甲基氨基甲烷3.030g，用0. lmol/L盐酸溶液调pH值至8. 5，加水约500ml，摇匀，再调节pH值至8. 5，定容至500ml ；橄榄油乳化液的制备取橄榄油12ml与阿拉伯树胶22. 5g，研磨均匀，加水研磨至 300ml，用18000转/min的匀质机乳化2次，每次3分钟；取乳剂在显微镜下检查，90%乳粒的直径在3 μ m以下，并不得有10 μ m的乳粒，即可；牛胆盐溶液的制备精密称取牛胆盐8. Og,置于50ml烧杯中，以水溶解，转移至 IOOml容量瓶中定容；O. lmol/L氢氧化钠溶液的制备精密称取氢氧化钠2. 0g，加水溶解定容至 500ml ；脂肪酶溶液的制备精密称取胰脂肪酶(SIGMA L3126)于容量瓶中，用冷却至5°C 以下的三羟甲基氨基甲烷缓冲液溶解，制成每Iml中含胰脂肪酶100活力单位的溶液，作为测定酶液备用。B.建立脂肪酶测活体系I).空白溶液脂肪酶测活体系取橄榄油乳液25ml、8%牛胆盐溶液2ml与水 10ml，置IOOml三角瓶中，加甲醇溶液lml，用O. lmol/L氢氧化钠溶液调节pH值至9. O ;2).样品溶液脂肪酶测活体系取橄榄油乳液25ml、8%牛胆盐溶液2ml与水 10ml，置IOOml三角瓶中，加样品溶液1ml，用O. lmol/L氢氧化钠溶液调节pH值至9.0。C.脂肪酶活力的测定及抑制率的计算I)空白溶液脂肪酶活力的测定将上述空白溶液脂肪酶测活体系在37°C水浴中保温10分钟，用O. lmol/L氢氧化钠溶液调节pH值至9. O ;精密量取上述测定酶液1ml，在 37°C水浴中准确反应10分钟，立即加入95%乙醇30ml，加入2滴酚酞指示液，用0. Imol/ L氢氧化钠滴定液滴定至测定体系溶液变为粉色,记录消耗0. lmol/L氢氧化钠滴定液的量 (ml)，记为Al。另取在水浴中煮沸15分钟的测定酶液1ml，按照上述方法测定作为酶空白对照，记录消耗0. lmol/L氢氧化钠滴定液的量(ml)记为A0。2)样品溶液脂肪酶活力的测定将上述样品溶液脂肪酶测活体系在37°C水浴中保温10分钟，用0. lmol/L氢氧化钠溶液调节pH值至9. O ;精密量取上述测定酶液1ml，在 37°C水浴中准确反应10分钟，立即加入95%乙醇30ml，加入2滴酚酞指示液，用0. Imol/ L氢氧化钠滴定液滴定至测定体系溶液变为粉色,记录消耗0. lmol/L氢氧化钠滴定液的量 (ml)，记为BI。另取在水浴中煮沸15分钟的测定酶液1ml，按照上述方法测定作为酶空白对照，消耗0. lmol/L氢氧化钠滴定液的量(ml)，记为BO。测定样品脂肪酶抑制率的计算
抑制率丫％= (I- B1~B0 ) X 100%
Al-AO结果见表2:表2纳豆提取物的脂肪酶活力抑制率
测定样品样品浓度(mg/ml)脂肪酶活力抑制率(％)乙酸乙酯萃取物20. 255. 8氯仿萃取物20. 475. 3乙醇提取物20. I40. 权利要求
1.一种脂肪酶抑制剂，其特征在于该脂肪酶抑制剂来源于枯草芽孢杆菌属微生物，尤其是纳豆芽孢杆菌。
2.如权利要求I所述的脂肪酶抑制剂，其特征在于该脂肪酶抑制剂由如下方法制成将纳豆芽孢杆菌，在琼脂斜面培养基上进行活化培养，培养温度30-40°C，培养时间为 16-48小时；将活化后的纳豆芽孢杆菌转入种子培养基中培养16-48小时；再将上述培养好的种子培养基中的种子液移至固体发酵培养基中培养16-144小时,或移至液体发酵培养基中培养16-144小时，培养温度为30-40°C，液体培养pH控制范围4_9，即可得到含有抑制脂肪酶的活性成分，即纳豆脂肪酶抑制素的培养物；再用已知的提取分离技术获取和分离；对于固体发酵，在上述培养物中加入1-5重量倍的50% -95%乙醇，超声30-90分钟， 滤出提取液，再加入1-3重量倍的50% -95%乙醇，第二次超声30-90分钟，滤出提取液，合并两次乙醇提取液；用60°C _90°C水浴薄膜减压蒸发浓缩，将浓缩液用1-4倍体积乙酸乙酯萃取三次，合并三次乙酸乙酯萃取液，用50°C -90°C水浴减压旋转蒸发浓缩至膏状，得含有脂肪酶抑制活性成分，即纳豆脂肪酶抑制素的乙酸乙酯萃取浓缩物；对于液体发酵，将上述培养物离心，得离心清液和湿菌体沉淀；离心清液用 80°C -10(TC水浴薄膜减压蒸发浓缩，得浓缩液；将浓缩液用1-3倍体积氯仿萃取三次，合并三次氯仿萃取液，用50°C -90°C水浴减压旋转蒸发浓缩氯仿萃取液，浓缩至膏状，得含有脂肪酶抑制活性成分的氯仿萃取物；湿菌体沉淀放-10°C -30°C冰箱冷冻15-30小时，置室温解冻后加入1-3倍体积倍甲醇，超声提取2次，每次30-90分钟；合并两次提取液，用 400C -70°C水浴减压旋转蒸发浓缩至无醇味，得含有脂肪酶抑制活性成分，即纳豆脂肪酶抑制素的甲醇提取浓缩物。
3.如权利要求2所述的脂肪酶抑制剂，其特征在于该脂肪酶抑制剂由如下方法制成 将纳豆芽孢杆菌，在琼脂斜面培养基上进行活化，培养温度37°C 土1°C，培养时间为22-26 小时；将活化后的纳豆芽孢杆菌转入种子培养基中培养20-24小时；将上述培养好的种子培养基中的种子液移至固体发酵培养基中培养68-96小时，或移至液体发酵培养基中培养68-96小时，培养温度均为37°C ±1°C，液体发酵pH控制范围为4. 5-8. 5，即可得到含有脂肪酶抑制活性成分，即纳豆脂肪酶抑制素的培养物；再用已知的提取分离技术获取和分离；对于固体发酵，在上述培养物中加入2. 5重量倍的95%乙醇，超声60分钟，滤出提取液，再加入2重量倍的80 %乙醇，第二次超声60分钟，滤出提取液，合并两次乙醇提取液； 用80°C水浴薄膜减压蒸发浓缩，将浓缩液用2-3倍体积乙酸乙酯萃取三次，合并三次乙酸乙酯萃取液，用70°C水浴减压旋转蒸发浓缩至膏状，得含有脂肪酶抑制活性成分，即纳豆脂肪酶抑制素的乙酸乙酯萃取浓缩物；对于液体发酵，将上述培养物离心，得离心清液和湿菌体沉淀；离心清液用80-100°C 水浴薄膜减压蒸发浓缩，得浓缩液；将浓缩液用2倍体积氯仿萃取三次，合并三次氯仿萃取液，用70°C水浴减压旋转蒸发浓缩氯仿萃取液，浓缩至膏状，得氯仿萃取物；湿菌体沉淀放_20°C冰箱冷冻24小时，置室温解冻后加入2-3体积倍甲醇，超声提取2次，每次60分钟； 合并两次提取液，用60°C水浴减压旋转蒸发浓缩至无醇味，得含有脂肪酶抑制活性成分，即纳豆脂肪酶抑制素的甲醇提取浓缩物。
4.如权利要求2或3所述的脂肪酶抑制剂，其特征在于培养基可以包含一种或多种碳源和一种或多种氮源和任选营养无机盐和/或微量元素碳源包括但不限于淀粉、葡萄糖、 蔗糖、糊精、糖蜜、甘油，优选葡萄糖；氮源包括但不限于大豆、大豆粉、大豆饼粉、花生粉、花生饼粉、酵母提取物、牛肉提取物、蛋白胨、大豆蛋白胨、麦芽提取物、玉米浆，固体培养优选大豆，液体培养优选大豆蛋白胨；营养无机盐包括但不限于磷酸盐磷酸氢钠、磷酸氢钾、 磷酸氢铵、氯化钠、氯化钙、硫酸镁、硝酸钾、硫酸铵、碳酸钙，优选磷酸氢钠、氯化钙和硫酸镁。
5.如权利要求2或3所述的脂肪酶抑制剂，其特征在于提取分离技术中所使用的乙醇、 乙酸乙酯、氯仿、甲醇等溶剂可以用其他水不混溶剂如乙酸丁酯、二氯甲烷或水可混溶剂 如丙酮、乙腈、正丙醇、正丁醇、异丙醇代替。
6.如权利要求1-3任一所述的脂肪酶抑制剂的制备方法，其特征在于该方法如下将纳豆芽孢杆菌，在琼脂斜面培养基上进行活化培养，培养温度30-40°C，培养时间为16-48 小时；将活化后的纳豆芽孢杆菌转入种子培养基中培养16-48小时；再将上述培养好的种子培养基中的种子液移至固体发酵培养基中培养16-144小时，或移至液体发酵培养基中培养16-144小时，培养温度为30-40°C，液体培养pH控制范围4_9，即可得到含有抑制脂肪酶的活性成分，即纳豆脂肪酶抑制素的培养物；再用已知的提取分离技术获取和分离；对于固体发酵，在上述培养物中加入1-5重量倍的50% -95%乙醇，超声30-90分钟， 滤出提取液，再加入1-3重量倍的50% -95%乙醇，第二次超声30-90分钟，滤出提取液，合并两次乙醇提取液；用60°C _90°C水浴薄膜减压蒸发浓缩，将浓缩液用1-4倍体积乙酸乙酯萃取三次，合并三次乙酸乙酯萃取液，用50°C -90°C水浴减压旋转蒸发浓缩至膏状，得含有脂肪酶抑制活性成分，即纳豆脂肪酶抑制素的乙酸乙酯萃取浓缩物；对于液体发酵，将上述培养物离心，得离心清液和湿菌体沉淀；离心清液用 80°C -10(TC水浴薄膜减压蒸发浓缩，得浓缩液；将浓缩液用1-3倍体积氯仿萃取三次，合并三次氯仿萃取液，用50°C -90°C水浴减压旋转蒸发浓缩氯仿萃取液，浓缩至膏状，得含有脂肪酶抑制活性成分的氯仿萃取物；湿菌体沉淀放-10°C -30°C冰箱冷冻15-30小时，置室温解冻后加入1-3倍体积倍甲醇，超声提取2次，每次30-90分钟；合并两次提取液，用 400C -70°C水浴减压旋转蒸发浓缩至无醇味，得含有脂肪酶抑制活性成分，即纳豆脂肪酶抑制素的甲醇提取浓缩物。
7.如权利要求6所述的脂肪酶抑制剂的制备方法，其特征在于该方法如下将纳豆芽孢杆菌，在琼脂斜面培养基上进行活化，培养温度37°C ± 1°C，培养时间为22-26小时；将活化后的纳豆芽孢杆菌转入种子培养基中培养20-24小时；将上述培养好的种子培养基中的种子液移至固体发酵培养基中培养68-96小时,或移至液体发酵培养基中培养68-96小时， 培养温度均为37°C ±1°C，液体发酵pH控制范围为4. 5-8. 5，即可得到含有脂肪酶抑制活性成分，即纳豆脂肪酶抑制素的培养物；再用已知的提取分离技术获取和分离对于固体发酵，在上述培养物中加入2. 5重量倍的95%乙醇，超声60分钟，滤出提取液，再加入2重量倍的80%乙醇，第二次超声60分钟，滤出提取液，合并两次乙醇提取液； 用80°C水浴薄膜减压蒸发浓缩，将浓缩液用2-3倍体积乙酸乙酯萃取三次，合并三次乙酸乙酯萃取液，用70°C水浴减压旋转蒸发浓缩至膏状，得含有脂肪酶抑制活性成分，即纳豆脂肪酶抑制素的乙酸乙酯萃取浓缩物；对于液体发酵，将上述培养物离心，得离心清液和湿菌体沉淀；离心清液用80-100°C 水浴薄膜减压蒸发浓缩，得浓缩液；将浓缩液用2倍体积氯仿萃取三次，合并三次氯仿萃取液，用70°C水浴减压旋转蒸发浓缩氯仿萃取液，浓缩至膏状，得氯仿萃取物；湿菌体沉淀放_20°C冰箱冷冻24小时，置室温解冻后加入2-3体积倍甲醇，超声提取2次，每次60分钟； 合并两次提取液，用60°C水浴减压旋转蒸发浓缩至无醇味，得含有脂肪酶抑制活性成分，即纳豆脂肪酶抑制素的甲醇提取浓缩物。
8.如权利要求6所述的脂肪酶抑制剂的制备方法，其特征在于培养基可以包含一种或多种碳源和一种或多种氮源和任选营养无机盐和/或微量元素碳源包括但不限于淀粉、 葡萄糖、蔗糖、糊精、糖蜜、甘油，优选葡萄糖；氮源包括但不限于大豆、大豆粉、大豆饼粉、花生粉、花生饼粉、酵母提取物、牛肉提取物、蛋白胨、大豆蛋白胨、麦芽提取物、玉米浆，固体培养优选大豆，液体培养优选大豆蛋白胨；营养无机盐包括但不限于磷酸盐磷酸氢钠、磷酸氢钾、磷酸氢铵、氯化钠、氯化钙、硫酸镁、硝酸钾、硫酸铵、碳酸钙，优选磷酸氢钠、氯化钙和硫酸镁。
9.如权利要求6所述的脂肪酶抑制剂的制备方法，其特征在于提取分离技术中所使用的乙醇、乙酸乙酯、氯仿、甲醇可以用乙酸丁酯、二氯甲烷水不混溶剂代替，或用丙酮、乙腈、 正丙醇、正丁醇、异丙醇水可混溶剂代替。
全文摘要
本发明公开了一种枯草芽孢杆菌属(Bacillus subtilis)微生物，尤其是纳豆芽孢杆菌(Bacillus subtilis natto或Bacillus natto)的脂肪酶抑制剂及其制备方法和用途。该脂肪酶抑制剂是先将纳豆芽孢杆菌(Bacillus subtilis natto)活化培养，再用固体发酵或液体发酵的方法制成含有抑制脂肪酶的活性成分，即纳豆脂肪酶抑制素的培养物，再进行提取分离，最终制成脂肪酶抑制剂。本发明是通过抑制脂肪酶活性而达到减肥降脂的目的，其新颖性在于①该脂肪酶抑制剂来源于食用纳豆，对人体没有毒副作用；②该脂肪酶抑制剂选择性地作用于胃肠道脂肪酶尤其是胰脂肪酶，而对蛋白酶和淀粉酶等没有抑制作用。
文档编号A61K45/00GK102579507SQ20111027859
公开日2012年7月18日 申请日期2007年9月29日 优先权日2007年9月29日
发明者何大林, 段震文, 郭树仁, 闫雪秋 申请人:北京北大维信生物科技有限公司