专利名称：西南银莲花总皂苷的制备方法及其在制备药物中的用途的制作方法
技术领域：
本发明属于医药、兽药技术领域，涉及一种西南银莲花总皂苷制备方法及其抗肿瘤的用途，如用于肺癌、肝癌、胃癌、结肠癌、胶质瘤、乳腺癌、宫颈癌、白血病、淋巴癌等。
背景技术：
西南银莲花(Anemone davidii Franch)，又名铜钱草(湖北)、铜骨七(四川) 和钻骨风(贵州)，来源于毛茛科银莲花属西南银莲花的干燥根状茎，生长于海拔950 3500m的山地中，分布于西南及湖北西部和湖南西北部。具有活血止痛、祛瘀消肿和补肾之功效，可用于治疗跌打损伤、风湿痛、劳伤、阳痿和腰痛。现代药理研究表明西南银莲花具有祛风湿、消痈肿、抗癌、抗肿瘤、抗菌等多种功效。该植物富含五环三萜皂苷，尤以齐墩果酸糖苷和常春藤配基糖苷为主，在体外可以明显抑制肺癌、结肠癌、卵巢癌、乳腺癌、肾癌、前列腺癌、黑素瘤以及白血病等癌细胞的生长。经过反复研究发现，西南银莲花的水提液、醇提液及其碱水解产物均具有抗肿瘤活性，尤其是碱水解产物，活性更强，经过进一步成分分析研究，发现其为皂苷类成分。
发明内容
本发明利用现代分离技术对西南银莲花进行系统的化学成分分离，从中分离得到一种以3-0- α -L-吡喃鼠李糖-(1 — 2) [ β -D-吡喃葡萄糖-(1 — 4) ] - α -L-吡喃阿拉伯糖齐墩果酸皂苷为主的西南银莲花总皂苷，通过体外抗肿瘤活性筛选研究，发现该总皂苷部位具有显著的抗肿瘤作用，而且其碱水解产物的活性明显强于水解前，成分分析发现，碱水解后产物中总皂苷含量较水解前大大提高。西南银莲花药材资源丰富，水解产物活性明确， 制备工艺简单易行，适合工业化大量生产，可作为制备抗肿瘤药物，具有广阔的市场前景和开发价值。本发明的技术方案如下1、西南银莲花总皂苷在制备抗肿瘤药物中的应用。2、西南银莲花总皂苷在制备抗肺癌、肝癌、胃癌、结肠癌、胶质瘤、乳腺癌、宫颈癌、 白血病、淋巴癌药物中的应用。4、西南银莲花总皂苷制备方法，包括以下步骤第一步，将西南银莲花药材粉碎成粗粉，用水或0. 1-95%乙醇浸泡0.5-2h，6_12 倍量加热回流提取2-3次，每次l-3h，过滤，合并滤液。上述滤液于50-7(TC减压浓缩至 0. 5-1. Og生药材/mL，无醇味，0-4°C冷藏过夜，析胶，滤过，即得西南银莲花提取物。第二步，西南银莲花提取物水溶液中加入氢氧化钠溶液调到PH10-13，加热沸腾 4-10小时，每30-60分钟测PH，保持在PH10-13，放冷，加盐酸溶液，调PH3-7，离心，去沉淀， 即得西南银莲花提取物水解液。第三步，西南银莲花提取物水解液，经过DlOl或AB-8或ADS-17大孔树脂或小孔树脂吸附，依次用水、30-40%乙醇、50-80%乙醇、95%乙醇洗脱，收集50-80%乙醇洗脱部分，即得西南银莲花总皂苷。经抗肿瘤药理实验，证明该西南银莲花总皂苷为西南银莲花抗肿瘤有效部位。经成分分析，发现西南银莲花总皂苷中主要含有3-0-α -L-吡喃鼠李糖_(1 — 2) [β -D-吡喃葡萄糖-(1 — 4) ] - α -L-吡喃阿拉伯糖齐墩果酸皂苷、3-0- α -L-吡喃鼠李糖基-(1 — 2) - α -L-吡喃阿拉伯糖齐墩果酸皂苷、3-0- β -D-吡喃木糖基-(1 — 3) - α -L-吡喃鼠李糖基-(I — 2)-a-L-吡喃阿拉伯糖齐墩果酸皂苷、3-0-β-D-吡喃木糖基 (1 — 3) - α -L-吡喃鼠李糖基(1 — 2) [_ β -D-吡喃葡萄糖基(1 — 4) ] - α -L-吡喃阿拉伯糖齐墩果酸皂苷、3-0- α -L-吡喃鼠李糖基(1 — 2) - α -L-吡喃阿拉伯糖常春藤皂苷等皂苷类成分。
具体实施例以3-0-α-L-吡喃鼠李糖-(1 — 2) [ β _D_卩比喃葡萄糖-(1 — 4)]-α-L-吡喃阿拉伯糖齐墩果酸皂苷为主的西南银莲花总皂苷制备方法为实施案例1第一步，将西南银莲花药材粉碎成粗粉，用水浸泡0.5-2h，6_12倍量加热回流提取2-3次，每次l-3h，过滤，合并滤液。上述滤液于50-70°C减压浓缩至0. 5-1. Og生药材/ mL, 0-4°C冷藏过夜，析胶，滤过，即得西南银莲花提取物。第二步，西南银莲花提取物水溶液中加入氢氧化钠溶液调到PH10-13，加热沸腾 4-10小时，每30-60分钟测PH,保持在PH10-13,放冷，加盐酸溶液，调PH 3-7,离心，去沉淀，即得西南银莲花提取物水解液。第三步，西南银莲花提取物水解液，经过DlOl或AB-8或ADS-17大孔树脂或小孔树脂吸附，依次用水、30-40%乙醇、50-80%乙醇、95%乙醇洗脱，收集50-80%乙醇洗脱部分，即得西南银莲花总皂苷。经XNY皂苷检测法检测，总皂苷含量为75%。经抗肿瘤药理实验，证明该西南银莲花总皂苷为西南银莲花抗肿瘤有效部位。实施案例2第一步，将西南银莲花药材粉碎成粗粉，用10%乙醇浸泡0.5-2h，6_12倍量加 热回流提取2-3次，每次l-3h，过滤，合并滤液。上述滤液于50-7(TC减压浓缩至0. 5-1. Og生药材/mL，无醇味，0-4°C冷藏过夜，析胶，滤过，即得西南银莲花总皂苷。第二步，西南银莲花提取物水溶液中加入氢氧化钠溶液调到PH10-13，加热沸腾 4-10小时，每30-60分钟测PH，保持在PH10-13，放冷，加盐酸溶液，调PH3-7，离心，去沉淀， 即得西南银莲花提取物水解液。第三步，西南银莲花提取物水解液，经过DlOl或AB-8或ADS-17大孔树脂或小孔树脂吸附，依次用水、30-40%乙醇、50-80%乙醇、95%乙醇洗脱，收集50-80%乙醇洗脱部分，即得西南银莲花总皂苷。经XNY皂苷检测法检测，总皂苷含量为73%。经抗肿瘤药理实验，证明该西南银莲花总皂苷为西南银莲花抗肿瘤有效部位。实施案例3第一步，将西南银莲花药材粉碎成粗粉，用20%乙醇浸泡0. 5-2h，6_12倍量加热回流提取2-3次，每次l-3h，过滤，合并滤液。上述滤液于50-7(TC减压浓缩至0. 5-1. Og生药材/mL，无醇味，0-4°C冷藏过夜，析胶，滤过，即得西南银莲花提取物。
第二步，西南银莲花提取物水溶液中加入氢氧化钠溶液调到PH10-13，加热沸腾 4-10小时，每30-60分钟测PH,保持在PH10-13,放冷，加盐酸溶液，调PH 3-7,离心，去沉淀，即得西南银莲花提取物水解液。第三步，西南银莲花提取物水解液，经过DlOl或AB-8或ADS-17大孔树脂或小孔树脂吸附，依次用水、30-40%乙醇、50-80%乙醇、95%乙醇洗脱，收集50-80%乙醇洗脱部分，即得西南银莲花总皂苷。经XNY皂苷检测法检测，总皂苷含量为76%。经抗肿瘤药理实验，证明该西南银莲花总皂苷为西南银莲花抗肿瘤有效部位。实施例4、第一步，将西南银莲花药材粉碎成粗粉，用40%乙醇浸泡0. 5-2h，6_12倍量加热回流提取2-3次，每次l-3h，过滤，合并滤液。上述滤液于50-7(TC减压浓缩至0. 5-1. Og生药材/mL，无醇味，0-4°C冷藏过夜，析胶，滤过，即得西南银莲花提取物。第二步，西南银莲花提取物水溶液中加入氢氧化钠溶液调到PH10-13，加热沸腾 4-10小时，每30-60分钟测PH，保持在PH10-13，放冷，加盐酸溶液，调PH3-7，离心，去沉淀， 即得西南银莲花提取物水解液。第三步，西南银莲花提取物水解液，经过DlOl或AB-8或ADS-17大孔树脂或小孔树脂吸附，依次用水、30-40%乙醇、50-80%乙醇、95%乙醇洗脱，收集50-80%乙醇洗脱部分，即得西南银莲花总皂苷。经XNY皂苷检测法检测，总皂苷含量为77%。经抗肿瘤药理实验，证明该西南银莲花总皂苷为西南银莲花抗肿瘤有效部位。实施例5、第一 步，将西南银莲花药材粉碎成粗粉，用60%乙醇浸泡0.5_2h，6-12倍量加热回流提取2-3次，每次l-3h，过滤，合并滤液。上述滤液于50-7(TC减压浓缩至0. 5-1. Og生药材/mL，无醇味，0-4°C冷藏过夜，析胶，滤过，即得西南银莲花提取物。第二步，西南银莲花提取物水溶液中加入氢氧化钠溶液调到PH10-13，加热沸腾 4-10小时，每30-60分钟测PH，保持在PH10-13，放冷，加盐酸溶液，调PH3-7，离心，去沉淀， 即得西南银莲花提取物水解液。第三步，西南银莲花提取物水解液，经过DlOl或AB-8或ADS-17大孔树脂或小孔树脂吸附，依次用水、30-40%乙醇、50-80%乙醇、95%乙醇洗脱，收集50-80%乙醇洗脱部分，即得西南银莲花总皂苷。经XNY皂苷检测法检测，总皂苷含量为78%。经抗肿瘤药理实验，证明该西南银莲花总皂苷为西南银莲花抗肿瘤有效部位。实施例6、第一步，将西南银莲花药材粉碎成粗粉，用70%乙醇浸泡0. 5-2h，6_12倍量加热回流提取2-3次，每次l-3h，过滤，合并滤液。上述滤液于50-7(TC减压浓缩至0. 5-1. Og生药材/mL，无醇味，0-4°C冷藏过夜，析胶，滤过，即得西南银莲花提取物。第二步，西南银莲花提取物水溶液中加入氢氧化钠溶液调到PH10-13，加热沸腾 4-10小时，每30-60分钟测PH，保持在PH10-13，放冷，加盐酸溶液，调PH3-7，离心，去沉淀， 即得白西南银莲花提取物水解液。第三步，西南银莲花提取物水解液，经过DlOl或AB-8或ADS-17大孔树脂或小孔树脂吸附，依次用水、30-40%乙醇、50-80%乙醇、95%乙醇洗脱，收集50-80%乙醇洗脱部分，即得西南银莲花总皂苷。经XNY皂苷检测法检测，总皂苷含量为74%。经抗肿瘤药理实验，证明该西南银莲花总皂苷为西南银莲花抗肿瘤有效部位。实施例7、 第一步，将西南银莲花药材粉碎成粗粉，用95%乙醇浸泡0.5_2h，6-12倍量加热回流提取2-3次，每次l-3h，过滤，合并滤液。上述滤液于50-7(TC减压浓缩至0. 5-1. Og生药材/mL，无醇味，0-4°C冷藏过夜，析胶，滤过，即得西南银莲花提取物。第二步，西南银莲花提取物水溶液中加入氢氧化钠溶液调到PH10-13，加热沸腾 4-10小时，每30-60分钟测PH，保持在PH10-13，放冷，加盐酸溶液，调PH3-7，离心，去沉淀， 即得西南银莲花提取物水解液。第三步，西南银莲花提取物水解液，经过DlOl或AB-8或ADS-17大孔树脂或小孔树脂吸附，依次用水、30-40%乙醇、50-80%乙醇、95%乙醇洗脱，收集50-80%乙醇洗脱部分，即得西南银莲花总皂苷。经XNY皂苷检测法检测，总皂苷含量为75%。经抗肿瘤药理实验，证明该西南银莲花总皂苷为西南银莲花抗肿瘤有效部位。本发明中采用XNY皂苷检测法测定总皂苷含量，方法如下1、常春藤皂苷元对照品溶液的制备精密称取常春藤皂苷元对照品5mg于50mL容量瓶中，以甲醇溶解，定容，配成 0. lmg/mL的标准品溶液，冷藏保存备用。2、常春藤皂苷元最大吸收波长的确定精密吸取对照品溶液1ml，2份(一份做空白，一份做显色)，加入标号的干燥的具塞试管中，于60摄氏度真空干燥箱中挥干，空白组加入5ml的甲醇，显色组加入5ml的高氯酸，摇勻，显色组于70摄氏度水浴中反应15min，并时时振摇，反应完全后立即置冰水浴中冷却15min，随行试剂为空白，于岛津UV-2550紫外分光光度计，在200 700nm波长范围内进行扫描。结果供试品溶液与对照品溶液在310nm波长处有最大吸收，故确定测定波长为 310nmo3、标准曲线的绘制精密移取对照品溶液0. 3,0. 6,0. 9，1. 2，1. 5，1. 8mL各2份(一份做空白，一份做显色)，转移至IOmL的具塞试管中，于60摄氏度真空干燥箱中挥干，空白组加入5ml的甲醇，显色组加入5ml的高氯酸，摇勻，显色组于70摄氏度水浴中反应15min，并时时振摇，反应完全后立即置冰水浴中冷却15min，随行试剂为空白，于岛津UV-2550紫外分光光度计， 在200-500nm波长扫描，在310nm波长处测定吸收度。以吸收度为纵坐标，常春藤皂苷元对照品浓度为横坐标，绘制标准曲线，以吸收度A对浓度C作最小二乘法回归，得标准曲线方程为:C = 0. 022A+0. 045，R2 = 0. 999 (η = 4)，线性范围为 7. 0 34. 3 μ g/mL,质量浓度与吸收度值的线性关系良好。4、样品中总皂苷成分含量测定方法取西南银莲花药材适量，粉碎，称取药材34. 90g，用10倍量70%乙醇(即350ml)， 提取2次，每次1. 5小时，所得溶液用中速滤纸过滤，浓缩至IOOml以下，转移至IOOml的容量瓶，定容至刻度，即得0. 349g/ml的西南银莲花提取物；移取西南银莲花提取液1ml，转移至250ml的容量瓶中，定容至刻度，即得1. 396mg/ml的西南银莲花供试品溶液。精密吸取供试品溶液1ml，2份(一份做空白，一份做显色)，加入标号的干燥的具塞试管中，于60摄氏度真空干燥箱中挥干，空白组加入5ml的甲醇，显色组加入5ml的高氯酸，摇勻，显色组于70摄氏度水浴中反应15min，并时时振摇，反应完全后立即置冰水浴中冷却15min，随行试剂为空白，于岛津UV-2550紫外分光光度计，在200-500nm波长扫描，在310nm处测定其吸收度。由标准曲线求得西南银莲花总皂苷样品中总皂苷浓度并计算含量。抗肿瘤药理研究从整体、细胞水平，体内体外实验相结合，全面观察了西南银莲花总皂苷的抗肿瘤作用，体外实验结果表明，西南银莲花总皂苷对体外人肺癌、肝癌、胃癌、结肠癌、胶质瘤、乳腺癌、白血病等17种肿瘤细胞均有较好的抑制作用，其对各种受试细胞的半效抑制浓度 (IC50)范围1. 19-16. 28μ g/ml，基本上都小于10ug/ml ；体内试验表明，西南银莲花总皂苷对人肺癌、肝癌、胃癌、结肠癌、胶质瘤、乳腺癌、白血病、宫颈癌等体内裸鼠异体移植瘤呈现较强的抗癌活性。1.西南银莲花总皂苷对体外人17种肿瘤细胞的半效抑制浓度采用MTT法，选择17种人肿瘤细胞系，考察不同浓度的西南银莲花总皂苷对人肿瘤细胞增殖的影响。收集对数期各肿瘤细胞，调整细胞悬液浓度至IX IO6个/mL，于96孔板每孔加入100 μ L，置于5% CO2, 37°C孵箱中孵育24h后，至细胞单层铺满孔底(96孔平底板)，加入浓度梯度的药物皂苷(1. 5625,3. 125,6. 25、12. 5、25 μ g/mL)，每个浓度设5个复孔。待药物与细胞作用48h后，计算药物对细胞生长的抑制率(％ )。实验结果提示，西南银莲花总皂苷对各种受试细胞的生长抑制效应均呈现出良好的浓度依赖关系，对各种受试细胞的半效抑制浓度(IC5tl)范围1. 19-16. 28yg/ml见表2， 从实验结果可以看出西南银莲花总皂苷对这些细胞生长半效抑制浓度基本上均小于IOug/ ml，与顺钼效果相当，有些细胞株如胶质瘤U251、SHG-44、小鼠黑色素瘤B16等抑制效果均优于顺钼，综合各受试细胞的半效抑制浓度的结果，可以提示在体外对肺癌、肝癌、胃癌、结肠癌、乳腺癌、胶质瘤、白血病等细胞株的生长抑制作用较显著。表2西南银莲花总皂苷对各种受试细胞生长的半效抑制浓度(IC5tl，μ g/mL)
权利要求
1.西南银莲花总皂苷在制备抗肿瘤药物中的应用。
2.西南银莲花总皂苷在制备抗肺癌、肝癌、胃癌、结肠癌、胶质瘤、乳腺癌、宫颈癌、白血病、淋巴癌药物中的应用。
3.西南银莲花总皂苷的制备方法，其特征在于包括以下步骤第一步，将西南银莲花药材粉碎成粗粉，用水或0. 1-95 %乙醇浸泡0. 5-2h，6-12倍量加热回流提取2-3次，每次l-3h，过滤，合并滤液；上述滤液于50-70°C减压浓缩至 0. 5-1. Og生药材/mL，无醇味，0-4°C冷藏过夜，析胶，滤过，即得西南银莲花提取物；第二步，西南银莲花提取物水溶液中加入碱性溶液调到PH10-13，加热沸腾4-10小时， 每30-60分钟测PH，保持在PH10-13，放冷，加酸性溶液，调PH3-7，离心，去沉淀，即得西南银莲花提取物水解液；第三步，西南银莲花提取物水解液，经过DlOl或AB-8或ADS-17大孔树脂或小孔树脂吸附，依次用水、30-40 %乙醇、50-80 %乙醇、95 %乙醇洗脱，收集50-80 %乙醇洗脱部分，即得西南银莲花总皂苷；经抗肿瘤药理实验，证明西南银莲花总皂苷为西南银莲花抗肿瘤有效部位。
4.西南银莲花总皂苷的制备方法，其特征在于根据权利要求3的制备方法获得的西南银莲花总皂苷中皂苷类成分含量为70%以上。
5.根据权利要求3所述及的方法，其特征是所述步骤二中所用碱性溶液包括氢氧化钠、氢氧化钾溶液。
6.根据权利要求3所述及的方法，其特征是所述步骤二中所用酸性溶液包括盐酸、硫酸溶液。
7.根据权利要求3所述及的方法，其特征是所述步骤三中用于柱层析的吸附树脂包括非极性大孔吸附树脂(HPD100、HPD-300、HPD700、D101)、弱极性大孔吸附树脂(HPD-722、 AB-8)、中极性大孔吸附树脂(HPD-450、HPD750、HPD-800、DM-130、ADS-17)、极性大孔吸附树脂(HPD-600、NKA-9)和小孔树脂等任何一种类型。
8.根据权利要求3所述及的方法，其特征是所述步骤三中用于洗脱吸附树脂的洗脱液依次为水、30-40%乙醇、50-80%乙醇、95%乙醇洗脱，收集50-80%乙醇洗脱部分。
全文摘要
本发明涉及一种西南银莲花总皂苷的制备方法，西南银莲花总皂苷的制备方法是将西南银莲花药材粉碎成粗粉，用水或含水乙醇加热回流提取，浓缩，析胶，滤过，碱水解，酸化，离心处理，再经大孔树脂或小孔树脂吸附，依次用水、乙醇依次洗脱，收集50-80％乙醇洗脱部分，即得西南银莲花总皂苷。西南银莲花总皂苷中皂苷类成分含量为70％以上。西南银莲花总皂苷具有显著的抗肿瘤活性，包括肺癌、肝癌、胃癌、结肠癌、胶质瘤、乳腺癌、宫颈癌、白血病、淋巴癌等。
文档编号A61P35/00GK102327330SQ20111029115
公开日2012年1月25日 申请日期2011年9月29日 优先权日2011年9月29日
发明者冯育林, 刘江云, 刘艳丽, 李俊, 杨世林, 范玫玫, 许琼明, 陈兰英 申请人:江西本草天工科技有限责任公司