专利名称：改性蚕丝及其制备方法
技术领域：
本发明涉及医药领域，特别涉及一种止血高分子材料。
技术背景
在战场上、自然灾害中及各种日常突发性事故中，不可控制的过量出血往往是导致50-80%伤员死亡的主要原因。有效的控制出血成为挽救患者伤亡的关键要素。新研发的桑蚕丝素蛋白具有良好的生物相容性、生物可降解性、迅速止血和促进伤口愈合等优点。
蚕丝是天然大分子聚合物，天然蚕丝主要由丝素蛋白和丝胶蛋白组成，而丝素蛋白的主要成分有甘氨酸(gly)，丙氨酸(ala)及丝氨酸(ser)。丝素蛋白纤维表面疏水，血浆蛋白与丝素蛋白之间存在强的疏水相互作用，能交联血浆蛋白从而凝血；此外，凝血因子也能交联丝素蛋白形成凝块。作为止血材料，天然蚕丝可用碱性肥皂水煮将丝胶蛋白去掉(脱胶)，仅仅只保留丝素蛋白；此外，丝素蛋白应适当改变其晶体结构，增加吸水性、蛋白酶再吸收及血浆吸收，才能更好的发挥止血功能。天然蚕丝成本低廉，原材料充沛，易于操作，在潮湿环境中强度也较大、对于生长的细胞有生物适应性，药物可渗透性，生物相容性好，可降解等优点，广泛运用于生物医学、生物技术领域，是可研发的最具发展潜力的止血材料。发明内容
本发明的目的之一在于提供一种改性丝素蛋白，其在二级结构发生变化后，具有较好的止血效果。
为实现上述目的，本发明的技术方案为改性蚕丝，用多晶X射线衍射仪，铜靶，λ = 0. 15418 nm,电压36 Kv,电流20 mA，扫描范围为5°-40 °，以每分钟1 °的速度进行常规扫描，所述改性蚕丝的X-射线衍射的特征衍射峰为主衍射峰在2 θ =21，此外两个小衍射峰分别在2 θ =9及2 θ =24，其中，在所述2 θ =21,2 θ =9及 2 θ =24的特征峰为β折叠片层结构的特征峰；2)在4000-400-1 cm进行傅立叶转换红外一衰减全反射光谱，吸收峰分别在3观2. 4、 1619. 9、1513. 9、1444. 4、1222. 7,617. 1 cnT1，及特有的 995. 1,696. 2 cnT1 的吸收峰。
进一步，所述改性蚕丝X-射线衍射在2 θ =21的主衍射峰为未改性蚕丝的2. 4-2. 5 倍，所述未改性蚕丝具体为仅通过充分脱胶处理的天然蚕丝。
进一步，用固态核磁共振仪对所述改性蚕丝进行二级结构的鉴定20 22ppm的反平行β -折叠片层结构存在且占整个改性蚕丝的至少10% ；16 ISppm处松散螺旋、无规则线圈结构少于所述天然蚕丝。
本发明的目的之二在于提供上述改性蚕丝的制备方法，该方法成本低，操作简单。
为实现上述目的，本发明的技术方案为 所述的改性蚕丝的制备方法，具体包括以下步骤 A脱胶处理取天然蚕丝，用脱胶溶液对天然蚕丝进行充分的脱胶处理，得脱胶蚕丝；所述天然蚕丝和脱胶溶液的以g/ml计为1:100-1000 ；所述脱胶溶液由质量分数为0. 25%的十二烷基硫酸钠溶液及质量分数为0. 25%的碳酸钠溶液组成； B改性处理将步骤A所得脱胶蚕丝用水和/或体积分数为10%的甲醇溶液进行在37 °C条件下处理 4小时，得改性蚕丝。
进一步，将步骤B改性处理后所得的改性蚕丝漂洗干净，室温自然晾干或37°C烘干，得改性蚕丝。
进一步，将步骤A所得脱胶蚕丝水煮不低于1小时后，再进行改性处理。
进一步，所述碳酸钠溶液的温度为90-100°C。
进一步，步骤B中，改性处理的温度为65°C。
本发明的目的之三在于提供所述改性蚕丝的新应用，该应用为临床中止血提供了新思路。
为实现上述目的，本发明的技术方案为 所述的改性蚕丝在制备止血材料中的应用； 所述的应用，所述改性蚕丝为0. 01-lg/L。
本发明的有益效果在于本发明所涉及的改性蚕丝，主要成分丝素蛋白成分，通过改造，降低了丝素蛋白的结晶度；改性蚕丝止血效果优于日本及美国学者使用二元溶液改造的蚕丝材料。丝素蛋白经处理适度改性后，蛋白二级结构主要为折叠结构，降低了无规则卷曲结构，这个结构能利于更好地结合血小板，进而迅速促进血栓形成。其本改造的止血蚕丝材料稳定性佳；在使用相同剂量的情况下，本改造的止血蚕丝材料与二元溶液处理改性蚕丝材料及云南白药相比，促凝血效果更好。
为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步的详细描述，其中图1天然蚕丝材料外观，其中A为天然蚕茧，B为蚕丝脱胶后丝素蛋白，C为丝素蛋白烘干；图2不同处理后丝素蛋白烘干后外观，其中A为脱胶烘干蚕丝，B为本发明蚕丝材料烘干，C为二元溶液(10%Ca(NO;3)2甲醇)处理蚕丝材料烘干；图3为改造的止血蚕丝材料X-射线衍射图谱，其中a为蚕丝直接脱胶后检测结果；b 为本发明的蚕丝材料检测结果；c为二元溶液(10%Ca(No3)2甲醇)处理检测结果；图4为改造的止血蚕丝材料傅立叶红外光谱图谱，a为蚕丝直接脱胶后检测结果；b为本发明的蚕丝材料检测结果；c为二元溶液(10%Ca(No3)2甲醇)处理检测结果；图5为改造的止血蚕丝材料固相核磁共振图谱，其中a为蚕丝直接脱胶后检测结果；b 为本发明的蚕丝材料检测结果；c为二元溶液(10%Ca(No3)2-甲醇)处理检测结果；图6为改造的止血蚕丝材料扫描电镜观察图谱，其中a为蚕丝直接脱胶后检测结果； b为本发明的蚕丝材料检测结果；c为二元溶液(10%Ca(No3)2甲醇)处理检测结果；图7为改造的止血蚕丝材料体外凝结实验，其中a为蚕丝直接脱胶后检测结果；b 为本发明的蚕丝材料检测结果；c为二元溶液(10%Ca(No3)2甲醇)处理检测结果。各种丝素蛋白材料均取0. 01克加入抗凝兔血中，其中b在加入后20秒就出现凝结现象，该图为加入各物质后20分钟拍摄。结果显示本发明的止血蚕丝材料在体外能迅速促进血凝结； 图8为改造的止血蚕丝材料体外凝结实验扫描电镜观察图谱，a为脱胶蚕丝；b为本发明处理的蚕丝材料；c为二元溶液(10%Ca(No3)2甲醇)处理的蚕丝；图9为改造的止血蚕丝材料动物肝脏止血效果，其中a为脱胶蚕丝；b为本发明的蚕丝材料；c为二元溶液(10%Ca(No3)2甲醇)处理的蚕丝材料。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面对本发明的优选实施例进行详细的描述。以下将参照附图，对本发明的优选实施例进行详细描述。优选实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件进行。
实施例1改性蚕丝的制备取天然蚕丝(见图1-A)，用脱胶溶液对天然蚕丝进行充分的脱胶处理，得脱胶蚕丝(见图1-B)；所述脱胶溶液为质量分数为0. 25%的十二烷基硫酸钠溶液及质量分数为0. 25%的碳酸钠溶液，所述天然蚕丝和脱胶溶液以g/ml计为1:100 ；将所得脱胶蚕丝用蒸馏水和体积分数为10%的甲醇溶液在37°C条件下处理4小时，目的在于增加脱胶蚕丝的β折叠。无论是蒸馏水与体积分数为10%的甲醇溶液混合后在37°C条件下处理4小时，还是用蒸馏水及体积分数为10%的甲醇溶液分别在37°C条件下处理共计4小时，或用蒸馏水或体积分数为10%的甲醇溶液之一在37°C条件下处理4小时，均可实现增加β折叠的目的。本实施例采用的是蒸馏水与体积分数为10%的甲醇溶液混合后在37°C条件下处理4小时的方案。 改性处理完成后，用蒸馏水漂洗干净，室温自然晾干或37°C温箱烘干(见图1-C)，得改性蚕丝。
实施例2改性蚕丝的定性1脱胶蚕丝和二元溶液改性蚕丝的处理方法1)脱胶蚕丝的处理方法天然蚕丝(彻mori)经含0. 25%(w/v)十二烷基硫酸钠(SDS)、0. 25%(w/v)碳酸钠沸水溶液(蚕丝质量与溶液体积比为1:100)煮1小时，或 0. 25%(w/v)十二烷基硫酸钠(SDS)沸水溶液(蚕丝质量与溶液体积比为1:100)煮1小时， 再经0. 25%(w/v)碳酸钠沸水溶液(蚕丝质量与溶液体积比为1:100)煮1小时，进行脱胶处理，至脱胶干净，蒸馏水沸水漂洗干净，即得脱胶蚕丝。
2) 二元溶液改性蚕丝的处理方法二元溶液(10%Ca(NO;3)2甲醇)处理蚕丝材料，详见"Develop a More Biodegradable/Biocompatible Hemostatic Fabric for Treatment of Bleeding Wouds” 一文。脱胶蚕丝(见图2 Α)、本发明蚕丝(见图2 B)及二元溶液处理蚕丝材料(见图2 C)烘干后外观见图2。
2改造止血蚕丝材料X-射线衍射各处理丝蛋白X-射线衍射采用X射线衍射仪(北京普析通用仪器有限公司生产的》)-3 多晶X射线衍射仪)(铜靶，λ = 0. 15418 nm),电压30 36 Kv,电流20 25 mA。扫描范围为5°- 40 °，以每分钟1 °的速度进行扫描。X射线衍射结果判断为衍射峰强度大，杂峰较少，结晶度较高。结果见图3，脱胶蚕丝(a)及本发明所述的改造蚕丝(b)的主衍射峰均在 2 θ =21左右的位置，此外也都有两个小衍射峰(2 θ =9、2 θ =24左右的位置)，而主衍射峰在 2 θ =21左右的位置，及小衍射峰在2 θ =9、2 θ =M左右的位置为β折叠片层结构的特征峰， 表明脱胶蚕丝(a)及本发明蚕丝(b)蛋白主要为β-折叠结构。所述改性蚕丝X-射线衍射在2 θ =21的主衍射峰的峰高为未改性蚕丝的的2. 4-2. 5倍，所述未改性蚕丝具体为仅通过充分脱胶处理的天然蚕丝(a)。
此外，在2 θ =21左右时，脱胶蚕丝(a)衍射峰强度最大，杂峰较少，结晶度最高，晶型完美；在2 θ =21左右时，本发明所述改造蚕丝材料(b)衍射峰强度较脱胶蚕丝的衍射峰强度有降低，且有少量杂峰，表明本发明的蚕丝蛋白结晶度较脱胶蚕丝的小；二元溶液改性蚕丝(c)衍射峰几乎消失，结晶度最小。
蚕丝材料傅立叶转换红外一衰减全反射光谱所有样品的傅立叶转换红外光谱均用采用Bruker TENSOR 27 FT4R光谱仪。衰减全反射附件用于获得各处理的丝素蛋白在溶剂中的波谱。所有扫描均用平均32次重复扫描从4000100-1 cm进行。结果见图4。
丝素蛋白主要由甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸等18种氨基酸组成。其特征氨基酸带有氨基(-NH)和羧基(-C00H)，具有两性电解质性质。丝素蛋白的构象可分为Silk I和 Silk II结构。Silk I结构包括无规线团和α-螺旋；Silk II结构为反平行β-折叠。丝素蛋白结构以稳定的反平行β-折叠构象为基础，Silk I和Silk II构象可通过改变温度、 溶剂极性、PH值、应力等条件进行转变。其中3435. 7、1630 1655CHT1处为酰氨I峰的特征峰，1520 1557. 7 cnT1处为酰氨II峰，1240 1270cm"1处为酰氨III峰的特征峰，625 695 CnT1为酰氨V的吸收峰，1372. 6、1016. 6,2894. 3,3435. 7,894. 2 cnT1处吸收峰主要是纤维素的特征峰。此外，吸收峰在660 cm—1处主要为无规则卷曲；吸收峰在1655、巧46、1270、625 cnT1主要为α -螺旋结构；吸收峰在1630、1520、1240、695 cm—1为β -折叠结构，改性蚕丝的β-折叠结构不低于10%。
其中本发明改造蚕丝与所述脱胶蚕丝均有3观2. 4(酰氨I峰)、1619. 9(酰氨I峰)、 1513.9 (酰氨II峰)、1444. 4、1222. 7 (酰氨III峰)、617. 1 cm—1 (酰氨V峰)的特征峰，本发明所述改造蚕丝比上述脱胶蚕丝还多了 995. 1,696. 2 cnT1的吸收峰。本发明蚕丝材料与脱胶蚕丝主要成分为丝胶和丝素，即主要为蛋白质成分。本发明蛋白主要为折叠结构。二元溶液改造蚕丝同脱胶蚕丝相比，还多了 2915. 3,2848. 4、1463. 7、1047. 2,719. 3 cm—1吸收峰，主要为纤维素的特征谱带，故二元溶液改造蚕丝比脱胶蚕丝蛋白质成分少，纤维素成分ο
4改造的止血蚕丝材料固相核磁共振，所有样品均由固态核磁共振仪(如13C CP/ MAS NMR (AVANCE III 400, Bruker, Germany)固态核磁共振仪)进行二级结构的鉴定，操作参见"Structural Characterization and Artificial Fiber Formation of Bombyx mori Silk Fibroin in HexafIuoro-Iso-Propanol Solvent System，，一文。天然蛋白质包括α-螺旋、β-折叠、β-转角、无规则卷曲等二级结构。其中16 ISppm为Ala C α , α代表松散螺旋、无规线圈结构。20 22ppm为Ala C β, β为反平行β _折叠片层结构。
从检测结果(见图5)可以看出，三种处理材料20 22ppm的反平行β -折叠片层结构均存在；16 ISppm处松散螺旋、无规线圈结构按脱胶蚕丝(a)、本发明的蚕丝材料 (b)、二元溶液(10%Ca(No3)2甲醇)处理蚕丝(c)的顺序逐渐减少。此外170. 6ppm为Gly C原子吸收峰，结果表明二元溶液处理蚕丝材料较脱胶蚕丝、本发明蚕丝材料相比Gly发生了化学位移。表明本发明蚕丝蛋白的二级结构还是以折叠为主。
结合以上X-射线衍射、傅立叶转换红外光谱及固相核磁共振结果表明本发明蚕丝(b)蛋白①主要为折叠结构；但是本发明蚕丝②蛋白结晶度较脱胶蚕丝的要小；本发明蚕丝材料与脱胶蚕丝③主要成分为丝素蛋白。
5止血蚕丝材料扫描电镜观察蚕丝中的丝素蛋白含量约占蚕丝的70% 80 %，是开发利用蚕丝的主要材料。蚕丝蛋白的大分子链主要由甘氨酸(Gly，G)、丙氨酸(Ala，Α)和丝氨酸(Ser，S) 3种简单氨基酸组成，并按照一定的比例和序列排列成较为规则的链段。蚕丝蛋白以β折叠为基础，形成直径大约为10 nm的微纤维，无数微纤维密切结合组成直径大约为1 μπι的细纤维，大约100根细纤维沿长轴排列构成直径大约为10 18μπι的单纤维，即蚕丝蛋白纤维。图 6为改造的止血蚕丝材料直接扫描电镜(HITACHI，S-3400N)观察图谱，其中a为蚕丝直接脱胶后检测结果；b为本发明的蚕丝材料检测结果；c为二元溶液(10%Ca(NO;3)2-甲醇)处理检测结果。从结果看出脱胶蚕丝(a)表型正常，蚕丝呈圆柱形、表面光滑、均勻。本发明蚕丝(b)表型呈现松散表型，暴露出解离的细纤丝，呈不规则或扁平的外观。经二元溶液 (10%Ca(No3) 2-甲醇)处理的蚕丝(c)表面丢失自然形状，呈现不规则。
实施例3改性蚕丝在制备止血材料中的应用 1止血蚕丝材料体外凝结实验预装各处理丝素蛋白等量加入试管中，加入等量肝素钠抗凝兔血(丝素蛋白与抗凝兔血质量体积比例大于0. 5% (w/v)),其中本发明丝素蛋白(b)在加入后20秒就出现凝结现象，该图为加入各物质后20分钟拍摄。见图7，可以观察到本发明丝素蛋白具有较好的促凝血作用，而美国学者的二元溶液极少量促凝血，脱胶蚕丝无促凝血作用。结果显示本发明的止血蚕丝材料在体外能迅速促进血凝结。其中a为蚕丝直接脱胶后检测结果；b为本发明的蚕丝材料检测结果；c为二元溶液(10%Ca(No3)2甲醇)处理检测结果。
2止血蚕丝材料体外凝结扫描电镜观察将等量各处理蚕丝(其中a为蚕丝直接脱胶后检测结果；b为本发明的蚕丝材料检测结果；c为二元溶液(10%Ca(NO;3)2-甲醇)处理)等量加入生理盐水2_10倍稀释的兔血Ih 后，加入2. 5%戊二醛固定2-10h ；PBS洗2-3次；35%、50%、75%、85%乙醇中各洗1次，95%乙醇洗2次；无水乙醇洗2次；50%、75%、85%、95%叔丁醇各处理1次；100%叔丁醇处理2次， 抽真空，镀金，扫描电镜(HITACHI，S-3400N)观察。结果见图8。从结果看出脱胶蚕丝(a) 蚕丝呈圆柱形、表面光滑，仅能结合少量红细胞。本发明蚕丝(b)表型呈现松散暴露出细纤丝的、呈不规则扁平的蚕丝能结合较多红细胞。经二元溶液(10%Ca(No3)2-甲醇)处理的蚕丝(c)也只结合少量红细胞。结果表明本发明处理的丝素蛋白大大增加了与红细胞的结合能力。
3止血蚕丝材料大鼠肝脏止血模型建立大鼠肝脏出血模型，参考的具体操作过程如下大鼠肝脏创面模型中，使用生理盐水配制戊巴比妥钠成3%的浓度，以30mg / kg剂量施行腹腔注射麻醉后，大鼠仰卧位， 70%乙醇消毒腹部并备皮，打开腹腔找到肝脏，以特制模具在肝左叶制作IOmm左右相同尺寸创面，迅速加入等量(如10 20mg)云南白药、各蚕丝止血材料至肝脏，各自记录止血材料止血时间，结果见图9所示。云南白药止血时间为70 士 10秒；脱胶蚕丝(a)止血时间为 180士20秒；本发明的蚕丝材料止血时间为(b) 50士 10秒；二元溶液(10%Ca(No3)2甲醇) 处理蚕丝材料(c)止血时间为90士 10秒。本发明的蚕丝处理的肝脏出血量较脱胶蚕丝及二元溶液处理蚕丝出血量少。结果表明本发明的止血蚕丝材料能迅速促进脏器血栓形成， 从而迅速止血。
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过参照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。
权利要求
1.改性蚕丝，其特征在于1)用多晶X射线衍射仪，铜靶，λ= 0.15418 nm，电压36 Kv，电流20 mA，扫描范围为 5°- 40。’以每分钟1。的速度进行常规扫描，所述改性蚕丝的X-射线衍射的特征衍射峰为 主衍射峰在2 θ =21，此外两个小衍射峰分别在2 θ =9及2 θ =24，其中，在所述2 θ =21,2 θ =9 及2 θ =24的特征峰为β折叠片层结构的特征峰；2)在4000-400-1cm进行傅立叶转换红外一衰减全反射光谱，吸收峰分别在3观2. 4、 1619. 9、1513. 9、1444. 4、1222. 7,617. 1 cnT1，及特有的 995. 1,696. 2 cnT1 的吸收峰。
2.根据权利要求1所述的改性蚕丝，其特征在于所述改性蚕丝X-射线衍射在2θ =21 的主衍射峰峰高的为未改性蚕丝的2. 4-2. 5倍，所述未改性蚕丝具体为仅通过充分脱胶处理的天然蚕丝。
3.根据权利要求2所述的改性蚕丝，其特征在于用固态核磁共振仪对所述改性蚕丝进行二级结构的鉴定20 22ppm的反平行β _折叠片层结构存在且占整个改性蚕丝的至少10% ；16 ISppm处松散螺旋、无规则线圈结构少于所述天然蚕丝。
4.权利要求1-3任一项所述的改性蚕丝的制备方法，其特征在于，具体包括以下步骤A脱胶处理取天然蚕丝，用脱胶溶液对天然蚕丝进行充分的脱胶处理，得脱胶蚕丝；所述天然蚕丝和脱胶溶液的以g/ml计为1:100-1000 ；所述脱胶溶液由质量分数为0. 25%的十二烷基硫酸钠溶液及质量分数为0. 25%的碳酸钠溶液组成；B改性处理将步骤A所得脱胶蚕丝用水和/或体积分数为10%的甲醇溶液进行在37 °C条件下处理 4小时，得改性蚕丝。
5.根据权利要求4所述的改性蚕丝的制备方法，其特征在于，将步骤B改性处理后所得的改性蚕丝漂洗干净，室温自然晾干或37°C烘干，得改性蚕丝。
6.根据权利要求4所述的改性蚕丝的制备方法，其特征在于，将步骤A所得脱胶蚕丝水煮不低于1小时后，再进行改性处理。
7.根据权利要求4所述的改性蚕丝的制备方法，其特征在于，所述碳酸钠溶液的温度为 90-100°C。
8.根据权利要求4所述的改性蚕丝的制备方法，其特征在于，步骤B中，改性处理的温度为650C 0
9.权利要求1-3任一项所述的改性蚕丝在制备止血材料中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于所述改性蚕丝为0.01-lg/L。
全文摘要
本发明涉及改性蚕丝，用多晶X射线衍射仪，所述改性蚕丝的X-射线衍射的特征衍射峰为主衍射峰均在2θ=21，此外两个小衍射峰分别在2θ=9及2θ=24，其中，在所述2θ=21、2θ=9及2θ=24的特征峰为β折叠片层结构的特征峰；在4000-400-1cm进行傅立叶转换红外--衰减全反射光谱，吸收峰分别在3282.4、1619.9、1513.9、1444.4、1222.7、617.1cm-1，及特有的995.1、696.2cm-1的吸收峰；该改性蚕丝通过脱胶处理及改性处理而得到，其丝素蛋白经处理适度改性后，蛋白二级结构主要为β-折叠结构，降低了无规则卷曲结构，这个结构能利于更好地结合血小板，进而迅速促进血栓形成。
文档编号A61L15/32GK102505452SQ20111033667
公开日2012年6月20日 申请日期2011年10月31日 优先权日2011年10月31日
发明者吴玉章, 杨霞 申请人:中国人民解放军第三军医大学