一种调节脂代谢的蛋白及其应用的制作方法

专利名称：一种调节脂代谢的蛋白及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物制药；更具体地，本发明涉及一种调节脂代谢的蛋白及其应用。
背景技术：
非酒精性脂肪肝(Nonalcoholicfatty liver disease, NAFLD)会引起许多肝脏慢性疾病，如肝硬化、肝癌和肝脏衰竭(1-3)。NAFLD的发生与年龄，二型糖尿病和高血脂相关(4)。肝脏脂肪化是NAFLD的早期症状，它的发生也是和年龄、二型糖尿病和高血脂相关的(5，6)。小鼠随着年龄增长或者在高脂食物喂养情况下都会发生肝脏脂肪化(7)。甘油三酯在肝脏中的过度积累会导致肝脏脂肪化，其中的机制包括:增加的脂肪摄入、增强的脂肪合成和脂肪氧化及肝脏脂肪向外输出的减少(8)。脂代谢能够被许多转录后修饰所调控，如:磷酸化、泛素化和乙酰化(9，10)。蛋白的乙酰化修饰已经成为调控细胞代谢的一种非常重要的转绿后修饰(11)，同时乙酰化是一个动态的过程，这个过程受乙酰化酶和去乙酰化酶所调控。SIRTl是一个NAD+依赖的去乙酰化酶，在肝脏中敲除SIRTl会影响脂肪酸氧化造成肝脏脂肪化(12)。肝脏特异性敲除另一个去乙酰化酶SIRT6会增加糖原和甘油三酯的合成从而形成脂肪肝(13)。乙酰化酶也参与了许多的脂代谢过程。SREBP是脂代谢中关键的调控因子，有报导发现乙酰化酶P300能够乙酰化SREBP从而增加它的稳定性(14，15)。另外的报导发现，p300还可以乙酰化脂代谢的另一个关键的调控因子PPAR Y (16)。乙酰化酶GCN5被报导能够乙酰化PGC-1 β从而抑制它的下游参与脂代谢的基因的表达(17)。乙酰化酶PCAF被发现能够乙酰化并增强β -catenin的稳定性(18),而β -catenin可以影响脂代谢和肝脏中甘油三酯的浓度(19)。虽然一些乙酰化酶被发现参与脂代谢的调控，但参与肝脏脂代谢的乙酰化酶还需要更多的研究。 蛋白乙酰基转移酶-1 (Pattl)是本实验室克隆并鉴定的一个新的乙酰化酶，它属于 GNAT(GCN5 related N-acetyltransferase) family,同时 Pattl 在肝脏中是高表达的
(20)。但是，以往它在肝脏中的作用还不清楚。

发明内容
本发明的目的在于提供一种调节脂代谢的蛋白及其应用。在本发明的第一方面，提供蛋白乙酰基转移酶-UProteinacetyltransferase-1, Patti)的下调剂的用途,用于制备改善肝脏脂代谢的组合物。在一个优选例中，所述的组合物还用于:缓解或治疗脂肪肝，缓解年龄相关的肝脏脂肪化，降低体脂肪含量，增加瘦体重，增强葡萄糖耐受能力，降低肝脏脂肪含量，减少肝脏中年龄相关的甘油三酯含量，降低低密度脂蛋白-胆固醇含量，减弱肝细胞脂肪酸摄取能力，降低肝脏中⑶36基因的表达，降低肝脏中PPARy的表达，降低肝脏中ACL基因的表达，降低肝脏中FAS基因的表达，降低肝脏中EL0VL6基因的表达，上调ACC蛋白磷酸化水平，降低肝脏中ACC的活性，减弱体内脂肪合成，上调CPT-1蛋白的表达和活性，提高肝脏ATP水平和/或提高脂肪酸氧化能力。在另一优选例中，所述的蛋白乙酰基转移酶-1的下调剂选自(但不限于):特异性干扰蛋白乙酰基转移酶-1的编码基因表达的干扰分子；或特异性与蛋白乙酰基转移酶-1结合的结合分子(如能够抑制蛋白乙酰基转移酶-1活性的抗体或配体)。在另一优选例中，所述的干扰分子选自(但不限于):反义核酸、小干扰RNA、dsRNA、微小RNA ;或能表达或形成所述反义核酸、小干扰RNA、dsRNA、微小RNA的构建物。在另一优选例中，所述的干扰分子是小干扰RNA(SiRNA)，其序列具有18_22bp的序列长度，且能够与蛋白乙酰基转移酶-1的mRNA互补并导致蛋白乙酰基转移酶-1的表达被下调。在另一优选例中，所述的干扰分子具有SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3所示的核苷
酸序列。在本发明的另一方面，提供一种用于改善肝脏脂代谢的小干扰RNA分子，所述的小干扰RNA分子是:(a)具有SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3所示核苷酸序列的小干扰RNA分子；和/或(b)核苷酸序列与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3所示核苷酸序列互补的小干扰RNA分子。 在本发明的另一方面，提供一种用于改善肝脏脂代谢的组合物，所述的组合物含有:(I)有效量的所述的小干扰RNA分子；和(2)药学上可接受的载体。在本发明的另一方面，提供蛋白乙酰基转移酶-1的用途，用于作为筛选改善肝脏脂代谢的药物的靶标。在本发明的另一方面，提供一种筛选改善肝脏脂代谢的潜在物质的方法，所述方法包括:(I)将候选物质与包含(如表达)蛋白乙酰基转移酶-1的体系接触；(2)筛选出下调蛋白乙酰基转移酶-1的转录、表达或活性的物质，所述物质是改善肝脏脂代谢的潜在物质。在一个优选例中，步骤(I)包括:向包含(如表达)蛋白乙酰基转移酶-1的体系中添加候选物质；和步骤⑵包括:检测蛋白乙酰基转移酶-1的转录、表达或活性，并与对照组比较，其中所述的对照组是不添加所述候选物质的、表达蛋白乙酰基转移酶-1的体系；若候选物质在统计学上下调(如显著下调20%以上，较佳的下调50%以上；更佳的下调80%以上)蛋白乙酰基转移酶-1的转录、表达或活性，则该候选物质是改善肝脏脂代谢的潜在物质。在另一优选例中，所述的体系选自(但不限于):细胞体系(或细胞培养物体系)、亚细胞体系、溶液体系、动物体系或组织体系。在另一优选例中，所述的体系是细胞体系，该细胞是肝脏细胞。
在另一优选例中，所述的候选物质选自(但不限于):针对蛋白乙酰基转移酶-1设计的干扰分子、核酸抑制物、结合分子(如抗体或配体)、小分子化合物。在另一优选例中，所述的方法还包括:对获得的潜在物质进行进一步的细胞实验和/或动物试验，以从候选物质中进一步选择和确定对于改善肝脏脂代谢有用的物质。本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。


图1、构建Pattl肝脏特异敲除(PattlLKO)的小鼠。(A-D)通过Western印迹检测Pattl在PattlLKO小鼠中被特异性敲除，其在肝(A)、肌肉(B)、白色脂肪组织(C)和脑⑶中表达正常。图2、肝脏特异敲除的Pattl小鼠脂肪重量和脂肪含量都有显著降低。(A-B)通过核磁共振(NMR)检测，发现20周龄的雄性PattlLKO小鼠的脂肪重量和体脂含量比同窝对照(CTR)显著降低。(C-D) NMR检测发现，20周龄的雄性PattlLKO小鼠的瘦体重及瘦体重含量有一定的增加。(E)双因素方差分析发现，雄性PattlLKO小鼠与同窝对照比有略微的增加，p =0.0413。 (F)在15-17周对摄食进行检查，发现雄性PattlLKO小鼠的摄食量略有增加。(G)葡萄糖耐受(GTT实验显示)15周龄的雄性PattlLKO小鼠对葡萄糖的耐受性略高于同窝对照。(H)为(G)的曲线下面积。(I)胰岛素耐受性实验(ITT)显示，雄性PattlLKO小鼠的胰岛素耐量与同窝对照相似。(J)为(I)的曲线下面积。η = 10-12/ 组，*ρ < 0.05，**ρ < 0.0l0图3、特异敲除肝脏Pattl可以保护雄性小鼠肝脏对抗肝脏脂肪变性(A)肝脏切片苏木精-曙红染色显示，31周龄雄性PattlLKO小鼠肝脏中的脂滴积累显著少于同窝对照小鼠。(B)肝脏Pattl敲除缓解了年龄相关的肝脏甘油三酯的积累。(C-D)雄性PattlLKO小鼠肝脏中游离脂肪酸(FFA)含量降低，而总胆固醇(TC)含
量没有显著差异。(E) 31周龄的雄性PattlLKO小鼠的肝脏占体重的百分比与同窝对照没有差异。(F-G)肝脏Pattl的敲除对31周龄雄性PattlLKO小鼠肝功能没有显著的影响。η=10-12/group, *p < 0.05, **p < 0.01。图4、PattlLKO小鼠肝实质细胞能够对抗棕榈酸诱导的脂肪堆积。⑷在如图所示不同浓度的棕榈酸处理18小时后，PattlLKO小鼠的原代肝细胞中脂滴的积累显著少于同窝对照的原代肝细胞。(B)为(A)的红色荧光通过酶标仪检测后得到的量化结果。(C)Western检测不同浓度棕榈酸处理后原代肝细胞中Pattl的蛋白水平。
(D)PattlLKO小鼠的原代肝细胞对棕榈酸诱导的甘油三酯的积累有抵抗作用。*p
<0.05，**p < 0.01。图5、肝脏Pattl特异敲除能减少脂肪酸的摄取和脂质的合成(A-B)经过Real time PCR检测，在如图所示2个与脂肪酸摄入相关的基因中，⑶36的mRNA在9周和31周PattlLKO小鼠的肝脏中显著下调。η = 4-6/组。(C)通过检测3H-棕榈酸的摄入，发现PattlLKO小鼠原代肝细胞的脂肪酸摄入显著降低。(D-E)在如图所示的脂代谢关键调控因子中，PPARa在9周的PattlLKO小鼠肝脏中下调，同时PPAR Y在9周和31周的PattlLKO小鼠肝脏中显著降低。η = 4-6/组。(F-G)在如图所示的参与脂肪酸和甘油三酯合成的酶中，ACL在9周和31周小鼠肝脏中显著下调。η = 4-6/组。(H、J) western检测9周和31周PattlLKO小鼠肝脏样品发现，在如图所示的参与脂合成的酶中，ACL、FAS和EL0VL6的蛋白水平显著下调，同时磷酸化的ACC显著上调。η =4-6/组。(1、K)对(H、J)中蛋白水平的定量。(L)ACC为脂肪酸合成途径中的限速酶，它的活性在PattlLKO小鼠的肝脏中显著下调。η = 8/组。(M)通过检测3H-葡萄糖在新和成脂肪中的含量，发现PattlLKO小鼠原代肝细胞的脂肪酸合成速率显著低于同窝对照小鼠的原代肝细胞。< 0.05，**ρ < 0.01。图6、肝脏Pattl特异敲除能增强肝脏脂肪酸氧化。(A) western检测发现，脂肪酸氧化途径中的限速酶CPT-1的蛋白水平在9周和31周雄性PattlLKO小鼠的肝脏中显著上调。(B)对(A)图中CPT-1蛋白水平的定量。η = 4-6/组。(C)CPT-1的活性在雄性PattlLKO小鼠肝脏中显著升高。(D)ACS是催化脂肪酸进入线粒体进行β氧化的一个重要的酶，它在雄性PattlLKO小鼠肝脏中的活性显著升高。η = 8/组。(E)通过检测3H-棕榈酸氧化所释放的3H2O,发现雄性PattlLKO小鼠原代肝细胞的脂肪酸氧化增强。(F)在饥饿6小时后，9周和31周的雄性PattlLKO小鼠肝脏中ATP水平与同窝对照小鼠有显著升高。8-12/组。(G-L) 22周龄的雄性PattlLKO小鼠在夜间显示出降低的呼吸熵(RQ)，增加的耗氧量(VO2)和总的能量消耗(TEE)。n = 10/group O *p < 0.05，**p < 0.01。图7、Pattl在PattlLKO小鼠的胰腺、肾脏和褐色脂肪组织(BAT)中表达水平与同窝对照相似。图8、对照小鼠的脂肪重量和体脂含量随着年龄增加呈增长趋势，PattlLKO小鼠在6周龄和9周龄时的脂肪重量和体脂含量显著低于同窝对照小鼠。η = 8-12/组，*ρ
<0.05，**Ρ < 0.01。图9、雄性PattlLKO小鼠显示升高的空腹血糖和降低的低密度脂蛋白-胆固醇(LDL-C)，空腹胰岛素、血清中的甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、高密度脂蛋白-胆固醇(HDL-C)和游离脂肪酸(FFA)水平保持不变。η = 8-12/组，*ρ < 0.05。图10、(A-B)与9周小鼠相比，31周小鼠肝脏中的Pattl蛋白水平略有降低。(C)与9周小鼠相比，31周小鼠肝脏中的Pattl的mRNA水平略有降低。η = 6/组，*ρ < 0.05, **Ρ < 0.01。(D)小鼠肝脏中Pattl的蛋白水平不受饥饿和再喂食条件的影响。η = 3 (E)在胰岛素处理不同时间后，小鼠原代肝细胞中的Pattl蛋白水平没有显著变化。图11、雄性PattlLKO小鼠肝脏中去乙酰化酶SIRTl和SIRT3的mRNA水平与同窝对照相比没有显著性差异。图12、通过转染siRNA，能够下调肝细胞中Pattl的蛋白表达水平。
具体实施例方式本发明人经过深入的研究，首次证实了 Pattl蛋白在肝脏脂代谢中起着重要的作用，下调Pattl蛋白的表达不影响肝功能但能够显著降低动物的体脂含量以及改善动物的肝脏脂代谢。因此，Pattl蛋白可以作为筛选肝脏脂代谢调节药物的靶标。PattlPattl蛋白是新发现的在肝脏中高表达的蛋白乙酰化酶，以往它在肝脏中的作用还不清楚。而本发明第一次揭示了其在调节肝脏脂代谢中的作用。在本发明中，所述的P attl蛋白(多肽)可以是天然存在的，比如其可被分离或纯化自动物。此外，所述的Pattl蛋白也可以是人工制备的，比如可以根据常规的基因工程重组技术来产生重组Pattl蛋白。任何适合的Pattl蛋白均可用于本发明。所述的Pattl蛋白包括全长的Pattl蛋白或其生物活性片段(或称为活性片段)。例如，所述的Pattl蛋白的氨基酸序列可以与GenBank登录号NP_079047所示的序列基本上相同；其核苷酸序列可以与GenBank登录号NM_024771所示的序列基本上相同。经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的Pattl蛋白或其生物活性片段的氨基酸序列也包括在本发明中。Pattl蛋白或其生物活性片段包括一部分保守氨基酸的替代序列，所述经氨基酸替换的序列并不影响其活性或保留了其部分的活性。适当替换氨基酸是本领域公知的技术，所述技术可以很容易地被实施，并且确保不改变所得分子的生物活性。这些技术使本领域人员认识到，一般来说，在一种多肽的非必要区域改变单个氨基酸基本上不会改变生物活性。见Watson等Molecular Biology of The Gene,第四版，1987, TheBenjamin/Cummings Pub.C0.P224。任何一种Pattl蛋白的生物活性片段都可以应用到本发明中。在这里，Pattl蛋白的生物活性片段的含义是指作为一种多肽，其仍然能保持全长的Pattl蛋白的全部或部分功能。通常情况下，所述的生物活性片段至少保持50%的全长Pattl蛋白的活性。在更优选的条件下，所述活性片段能够保持全长Pattl蛋白的60%、70%、80%、90%、95%、99%、或100%的活性。Pattl蛋白已经公知在许多动物中以高度的保守性存在，例如在人和小鼠中，Pattl蛋白的序列相同性(同源性)达到99%。因此，可以理解，来源于不同动植物的Pattl均包含于本发明中。较佳地，它们是与GenBank登录号NP_079047或其生物活性片段所示氨基酸序列相比，序列相同性高于60 %的，更佳地是高于70 %，更佳地是高于80 %，更佳地是高于85 %，更佳地是高于88 %，更佳地是高于90 %，更佳地是高于95 %，更佳地是高于98%。用途及筛选方法本发明人构建了肝脏特异性Pattl敲除的小鼠，发现其在脂代谢方面有较明显表型。肝脏Pattl敲除的雄性小鼠的体脂含量明显减少，并且年龄相关的甘油三酯在肝脏中的积累和游离脂肪酸也显著减少，同时Pattl的敲除并不影响肝功能。与此一致的是，在Pattl敲除的小鼠肝原代细胞也显示了对于棕榈酸诱导的脂滴积累有明显的抵抗作用。更进一步研究发现，Pattl敲除的小鼠肝原代细胞显示了脂肪酸摄入、脂肪合成的降低，以及脂肪酸氧化的增强，这些脂代谢的改善缓解了肝脏特异性Pattl敲除小鼠肝脏中的脂肪积累。本发明提出了 Pattl 在脂代谢中有重要作用，这对于治疗年龄相关的脂肪肝有重要意义。基于本发明人的新发现，对Pattl的研究有着多方面的用途，所述的用途包括(但不限于):筛选下调Pattl的基因转录或蛋白表达的物质，该物质可用于制备改善肝脏脂代谢的药物。因此，本发明提供了筛选改善肝脏脂代谢的潜在物质的方法，将候选物质与表达Pattl蛋白的体系接触；筛选出抑制Pattl蛋白的编码基因的转录或Pattl蛋白表达的物质，所述物质是改善肝脏脂代谢的潜在物质。 如本文所用，所述的“下调”或“抑制”是指具有统计学意义的“下调”或“抑制”。即:显著地“下调”或“抑制”。如与不给予候选物质的对照组的蛋白活性、蛋白表达、蛋白相互作用相比，显著“下调”或“抑制”20%以上，较佳的50%以上；更佳的80%以上。所述的表达Pattl蛋白的体系选自:细胞体系(或细胞培养物体系)、亚细胞体系、溶液体系、动物体系或组织体系。例如，所述的表达Pattl蛋白的体系是肝细胞。作为本发明的优选方式，所述的方法还包括:对获得的潜在物质进行进一步的细胞实验和/或动物试验，以从候选物质中进一步选择和确定对于改善肝脏脂代谢有用的物质。当进行筛选时，可以采用本领域熟知的各种技术来确定蛋白或其编码基因的变化情况以及相互作用情况。可以采用多种常规的技术来鉴定系统中基因的转录或蛋白表达情况。这些技术包括但不限于:寡核苷酸杂交技术(如探针)，多聚酶链反应(PCR)，聚丙烯酰胺凝胶电泳，免疫印迹(如Western印迹)等。通过上述方法初步筛选出的物质可构成一个筛选库，以便于人们最终可以从中筛选出能够对于改善肝脏脂代谢真正有用的物质。本发明还提供了采用所述筛选方法获得的可用于改善肝脏脂代谢的潜在物质。所述物质是下调Pattl蛋白的抑制剂、拮抗剂或下调剂。本发明还提供了一种制备改善肝脏脂代谢的药物的方法，所述方法包括:合成和/或纯化前述筛选获得的对于改善肝脏脂代谢有用的物质，作为用于改善肝脏脂代谢的药物。可将获得的对于改善肝脏脂代谢有用的物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8,较佳地pH约为6-8,尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于):肌内、静脉内、或皮下给药。Pattl蛋白的下调剂及其用途基于本发明人的上述新发现，本发明提供了一种Pattl蛋白的下调剂的用途，用于制备改善哺乳动物肝脏脂代谢的组合物。所述的Pattl的下调剂还用于:缓解或治疗脂肪肝，缓解年龄相关的肝脏脂肪化，降低体脂肪含量，增加瘦体重，增强葡萄糖耐受能力，降低肝脏脂肪含量，减少肝脏中年龄相关的甘油三酯含量，降低低密度脂蛋白-胆固醇含量，减弱肝细胞脂肪酸摄取能力，降低肝脏中⑶36基因的表达，降低肝脏中PPARy的表达，降低肝脏中ACL基因的表达，降低肝脏中FAS基因的表达，降低肝脏中EL0VL6基因的表达，上调ACC蛋白磷酸化水平，降低肝脏中ACC的活性，减弱体内脂肪合成，上调CPT-1蛋白的表达和活性，提高肝脏ATP水平和/或提高脂肪酸氧化能力。如本文所用，所述的Pattl基因或蛋白的下调剂包括了抑制剂、拮抗剂、阻滞剂、阻断剂等。所述的Pattl基因或蛋白的下调剂是指任何可降低Pattl蛋白的活性、降低Pattl基因或蛋白的稳定性、下调Pattl蛋白的表达、减少Pattl蛋白有效作用时间、或抑制Pattl基因的转录和翻译的·物质，这些物质均可用于本发明，作为对于下调Pattl有用的物质，从而可用于改善肝脏脂肪代谢。例如，所述的下调剂是:特异性干扰Pattl基因表达的小干扰RNA分子或反义核苷酸；或特异性与Pattl结合的抗体或配体。作为本发明的一种优选方式，所述的Pattl的下调剂是一种特异性与Pattl结合的抗体。所述的抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体。可用Pattl蛋白免疫动物，如家兔，小鼠，大鼠等来生产多克隆抗体；多种佐剂可用于增强免疫反应，包括但不限于弗氏佐剂等。与之相似的，表达Pattl或其具有抗原性的片段的细胞可用来免疫动物来生产抗体。所述的抗体也可以是单克隆抗体，此类单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制备(见Kohler等人，Nature 256 ；495,1975 ；Kohler 等人，Eur.J.1mmunol.6:511,1976 ；Kohler 等人，Eur.J.1mmunol.6:292,1976 ;Hammerling 等人，In Monoclonal Antibodies and T CellHybridomas, Elsevier, N.Y.,1981)。作为本发明的一种优选方式，所述的Pattl的下调剂是一种Pattl特异性的小干扰 RNA 分子(siRNA)。如本文所用，所述的“小干扰 RNA (small interfering RNA, siRNA) ”是指一种短片段双链RNA分子，能够以同源互补序列的mRNA为靶目标降解特定的mRNA，这个过程就是RNA干扰(RNA interference)过程。小干扰RNA可以制备成双链核酸的形式，它含有一个正义链和一个反义链，这两条链仅在杂交的条件下形成双链。一个双链RNA复合物可以由相互分离的正义链和反义链来制备。因此，举例来讲，互补的正义链和反义链是化学合成的，其后可通过退火杂交，产生合成的双链RNA复合物。对小干扰RNA的制备方法没有特别的限制，包括但不限于:化学合成法，体外转录法等。在得知了 Pattl与肝脏脂肪代谢的相关性以后，可以制备出所述的小干扰RNA，从而用于改善肝脏脂肪代谢。此外，小干扰RNA包含的正义链和反义链可通过一个或多个编码正义链和反义链的表达盒来制备。当正义链和反义链由一个单独的表达盒编码时，它们可以从生成的转录物中断裂形成分离的正义链和反义链，其后杂交生成双链小干扰RNA。所述的小干扰RNA可通过采用适当的转染试剂被输送到细胞内，或还可采用本领域已知的多种技术被输送到细胞内。本发明还提供了一种组合物，它含有有效量(如0.000001-50wt% ;较佳的0.00001-20 丨％;更佳的，0.0001-10wt% )的所述的Pattl的下调剂，以及药学上可接受的载体。所述的组合物可用于改善肝脏脂代谢。如本文所用，所述“有效量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。所述“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。该术语指这样一些药剂载体:它们本身并不是必要的活性成分，且施用后没有过分的毒性。合适的载体是本领域普通技术人员所熟知的。在组合物中药学上可接受的载体可含有液体，如水、盐水、缓冲液。另外，这些载体中还可能存在辅助性的物质，如填充齐U、润滑剂、助流剂、润湿剂或乳化剂、PH缓冲物质等。所述的载体中还可以含有细胞转染试剂。在得知了所述Pattl基因或蛋白的下调剂的用途后，可以采用本领域熟知的多种方法来将所述的下调剂或其编码基因、或其药物组合物给药于哺乳动物。包括但不限于:皮下注射、肌肉注射、经皮给予、局部给予、植入、缓释给予等；优选的，所述给药方式是非肠道给予的。优选的，可采用基因治疗的手段进行。如，可直接将Pattl的下调剂通过诸如注射等方法给药于受试者；或者，可通过一定的途径将携带Pattl的下调剂的表达单位(比如表达载体或病毒等，或siRNA)递送到祀点上,并使之表达活性的Pattl下调剂,具体情况需视所述的下调剂的类型而定，这些均是本领域技术人员所熟知的。

本发明所述的Pattl的下调剂的有效量可随给药的模式和待治疗的疾病的严重程度等而变化。优选的有效量的选择可以由本领域普通技术人员根据各种因素来确定(例如通过临床试验)。所述的因素包括但不限于:所述的Pattl基因或蛋白的下调剂的药代动力学参数例如生物利用率、代谢、半衰期等；患者所要治疗的疾病的严重程度、患者的体重、患者的免疫状况、给药的途径等。通常，当本发明的Pattl的下调剂每天以约0.00001mg-50mg/kg动物体重(较佳的0.0001mg-10mg/kg动物体重)的剂量给予，能得到令人满意的效果。例如，由治疗状况的迫切要求，可每天给予若干次分开的剂量，或将剂量按比例地减少。下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。材料与方法小鼠饲养
所有的小鼠实验均按照中科院营养所实验动物管理和使用委员会的相关规定进行。实验小鼠可以自由获取食物及饮水，饲养于SPF级动物房，环境温度22±3°C，湿度35±5%，12小时昼夜周期(每天早上6: 30亮灯)。Alb-Cre小鼠购于美国JacksonLaboratory,并按照其提供的方法进行基因型鉴定。肝脏特异性Pattl敲除小鼠的构建从野生型129/SvJ小鼠出发，采用常规的基因同源重组方法建立Pattl敲除小鼠，使得PattlmRNA上编码Pattl蛋白第84-237位氨基酸的碱基被敲除，表达出无活性片段(即蛋白第1-83位)。简述如下:构建Pattl基因外显子5-8两端插入1xP位点的重组质粒，以Not I线性化后显微注射到129/SvJ小鼠的受精卵使其与小鼠基因组发生同源重组。挑选重组阳性的受精卵植入母鼠的输卵管或子宫内。出生的小鼠即为Pattliw+小鼠，Pattliw+小鼠自交后得到Pattlwirai小鼠。得到Pattliwirai后，将其与Alb-Cre小鼠进行杂交，得到双杂合子Pattl+/1°x，Cre+/-鼠，随后双杂合子小鼠互交得到肝脏特异性Pattl敲除小鼠(PattlLKO):PattlWl°x，Cre+/-小鼠，该小鼠同PattllWl°x杂交得到PattlLKO小鼠及其同窝对照小鼠Pattliwirai进行后续实验。葡萄糖耐受实验葡萄糖耐受性实验前，将小鼠饥饿15小时，检测空腹血糖后，腹腔注射葡萄糖溶液(根据小鼠体重，2g/kg)，然后分别用血糖仪检测注射后15、30、60和120分钟小鼠尾静脉血液中葡萄糖的浓度。血糖用血糖仪(FreeStyle, Alameda, California, USA)检测。胰岛素耐受实验胰岛素耐受性 实验，实验前小鼠禁食4小时，之后检测空腹血糖后，根据体重注射
0.75U/kg的人胰岛素溶液，分别用血糖仪检测注射后15，30，60和120分钟小鼠的血糖水平。酶活性检测血清中的谷草转氨酶和谷丙转氨酶活性用上海申索佑福医学诊断用品有限公司提供的试剂盒，根据说明书进行检测。ACC的活性的检测是通过将ACC催化的脂肪酸合成与NAD的生成偶联起来，通过检测NAD的生成来检测ACC的酶活性⑴。CPT-1的酶活性检测通过偶联CoASH的释放及其与4，4’ - 二硫代联吡啶的反应⑵。ACS酶活性的检测也是通过与NAD的生成偶联来检测的(3)。甘油三酯、胆固醇和游离脂肪酸的检测肝脏甘油三酯、胆固醇和游离脂肪酸的抽提是按照(4，5)所示文献进行抽提的。40-50mg的肝脏组织或4X IO5个原代肝细胞加入ImL的氯仿/甲醇溶液(I: 2,v/v)在室温摇床上放置2小时，随后加入200 μ I的0.1M NaCl，漩涡震荡后3，OOOg离心10分钟。将200 μ I的下层有机层转移至新的试管中，放入通风橱中过夜使氯仿挥发干净。在干燥的样品中加入100 μ I的异丙醇将脂质重悬。甘油三酯和胆固醇采用上海申索佑福医学诊断用品有限公司提供的试剂盒进行检测，游离脂肪酸通过美国Biovision公司的游离脂肪酸检测试剂盒进行检测。
小鼠原代肝细胞的分离与培养小鼠原代肝细胞是从10-15周龄的小鼠肝脏中分离制备的(6)。雄性PattlLKO小鼠及其同窝对照小鼠麻醉后进行肝脏灌注。首先用含有100 μ M EGTA的Krebs Ringe含糖缓冲液(4.8mM KCl, 1.2mM MgSO4,1.2mM KH2PO4,120mM NaCl,24mM NaHCO3, 20mM 葡萄糖和5mM HEPES, pH 7.45)进行灌注，灌注液流速3ml/min。灌注15分钟后，换溶液2 (KrebsRinger含糖缓冲液中加入5mM CaCl2和100U/ml胶原酶I)进行灌注，15分钟后停止灌注并小心剪掉肝脏，置于冰上的DMEM培养基中。将肝脏剪碎并用7(^111滤网过滤后，在5(^，4°C离心2分钟。得到的原代肝细胞，用冰的DMEM洗3遍后，台盼蓝染色观察细胞活率。随后将细胞铺于事先用鼠尾胶原包被好的12孔板,细胞铺板密度为2 X IO5每孔,用DMEM培养液在37°C培养。脂肪酸诱导原代肝细胞脂滴与尼罗红染色原代肝细胞用如图所示的不同浓度的棕榈酸处理18小时后，PBS洗两遍后用2 μ g/ml的尼罗红在37°C孵育15分钟。再用PBS洗两遍后，将细胞置于荧光显微镜下拍照，随后用酶标仪对荧光进行读值(7)。免疫印迹细胞蛋白样品经SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳后，用不同抗体:Pattl⑶；ACL，Ser79-磷酸化的 ACC, ACC, FASN 和 C/EBP a (Cell Signaling) ；PATTI 和 EL0VL6 (Abeam)，CPT-1 (Alpha Diagnostics);以及 Tubulin 和 Actin (Sigma)检测相应蛋白。二抗结合后，加入ECL结合底物反应2 5分钟，用保鲜膜包好压片，先依次以5、15、30、60秒曝光显影曝光在Kodak X-Omat胶片上，再根据结果调整曝光时间或者显影液。脂肪酸摄入

脂肪酸摄入实验根据文献报导进行(9)。12孔板中的原代肝细胞加入300 μ I/孔的反应液(Hanks’balanced buffer, I % BSA 和 5 μ Ci/ml 3H_ 掠桐酸)在 37°C鮮育。5 分钟后，用冰冷的PBS将细胞洗两遍后加入100 μ I的0.3Μ的NaOH将细胞裂解，并加入闪烁液检测放射性。脂肪酸合成脂肪酸合成实验根据文献报导进行(10)。12孔板中培养的原代肝细胞在含6 μ Ci/ml的3H-葡萄糖和ImM未标记的葡萄糖的DMEM中孵育。60分钟后，用PBS将细胞洗两遍后，用上述的方法抽提细胞中的脂质，并检测其中3H的放射性。脂肪酸氧化脂肪酸氧化实验根据文献报导进行(11)。分离的小鼠原代肝细胞在培养24小时后用PBS洗两遍，随后加入300 μ I/孔的反应液(Hanks’ balanced buffer, 10mg/ml BSA和3.3 μ Ci/ml3H-棕榈酸)。37°C孵育I小时后，取150 μ I的反应液到新的试管中，并加入400 μ I甲醇/氯仿溶液(2: 1，ν/ν)和400 μ I 2Μ KC1/2MHC1。漩涡震荡后，在3，OOOg离心5分钟，取上层水相层检测其中3H2O的放射性。RNA抽提，逆转录及实时定量PCR肝脏总RNA 用 TRIzol (Invitrogen)提取后用 RNase-free 的 DNase I (Takara)消化。随后RNA用反转录酶M-MLV ReverseTranscriptase (Promega)进行反转。实时定量PCR(Realtime PCR)在ABI Prism 7900Sequence Detection System上进行。实时定量PCR中所用到的引物主要来自 PrimerBank(http://pga.mgh.harvard, edu/primerbank),如表 I所示。表1、实时定量PCR中所用到的引物序列
权利要求
1.白乙酰基转移酶-1的下调剂的用途，用于制备改善肝脏脂代谢的组合物。
2.权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的组合物还用于:缓解或治疗脂肪肝，缓解年龄相关的肝脏脂肪化，降低体脂肪含量，增加瘦体重，增强葡萄糖耐受能力，降低肝脏脂肪含量，减少肝脏中年龄相关的甘油三酯含量，降低低密度脂蛋白-胆固醇含量，减弱肝细胞脂肪酸摄取能力，降低肝脏中CD36基因的表达，降低肝脏中PPARy的表达，降低肝脏中ACL基因的表达，降低肝脏中FAS基因的表达，降低肝脏中EL0VL6基因的表达，上调ACC蛋白磷酸化水平，降低肝脏中ACC的活性，减弱体内脂肪合成，上调CPT-1蛋白的表达和活性，提高肝脏ATP水平和/或提高脂肪酸氧化能力。
3.权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的蛋白乙酰基转移酶-1的下调剂选自: 特异性干扰蛋白乙酰基转移酶-1的编码基因表达的干扰分子；或 特异性与蛋白乙酰基转移酶-1结合的结合分子。
4.权利要求3所述的用途，其特征在于，所述的干扰分子是小干扰RNA，其序列具有18-22bp的序列长度，且能够与蛋白乙酰基转移酶-1的mRNA互补并导致蛋白乙酰基转移酶-1的表达被下调。
5.权利要求4所述的用途，其特征在于，所述的干扰分子具有SEQID NO:1或SEQID NO:3所示的核苷酸序列。
6.种用于改善肝脏脂代谢的小干扰RNA分子，其特征在于，所述的小干扰RNA分子是:(a)具有SEQID NO:1或SEQ ID NO:3所示核苷酸序列的小干扰RNA分子；和/或 (b)核苷酸序列与SEQID NO:1或SEQ ID NO:3所示核苷酸序列互补的小干扰RNA分子。
7.种用于改善肝脏脂代谢的组合物，其特征在于，所述的组合物含有: (1)有效量的权利要求6所述的小干扰RNA分子；和 (2)药学上可接受的载体。
8.白乙酰基转移酶-1的用途，用于作为筛选改善肝脏脂代谢的药物的靶标。
9.种筛选改善肝脏脂代谢的潜在物质的方法，所述方法包括: (1)将候选物质与包含蛋白乙酰基转移酶-1的体系接触； (2)筛选出下调蛋白乙酰基转移酶-1的转录、表达或活性的物质，所述物质是改善肝脏脂代谢的潜在物质。
10.权利要求9所述的方法，其特征在于，步骤(I)包括:向包含蛋白乙酰基转移酶-1的体系中添加候选物质；和 步骤(2)包括:检测蛋白乙酰基转移酶-1的转录、表达或活性，并与对照组比较，其中所述的对照组是不添加所述候选物质的、表达蛋白乙酰基转移酶-1的体系； 若候选物质在统计学上下调蛋白乙酰基转移酶-1的转录、表达或活性，则该候选物质是改善肝脏脂代谢的潜在物质。
全文摘要
本发明涉及一种调节脂代谢的蛋白及其应用。本发明首次证实了Patt1蛋白在肝脏脂代谢中起着重要的作用，下调Patt1蛋白的表达不影响肝功能但能够显著降低动物的体脂含量以及改善动物的肝脏脂代谢。因此，Patt1蛋白可以作为筛选肝脏脂代谢调节药物的靶标。
文档编号A61P3/06GK103083668SQ20111034657
公开日2013年5月8日 申请日期2011年11月4日 优先权日2011年11月4日
发明者翟琦巍, 刘洋 申请人:中国科学院上海生命科学研究院