专利名称：抑制PAR-1基因表达的siRNA及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及抑制PAR-I (蛋白酶激活受体-1)基因表达的SiRNA(小分子干扰RNA) 及其应用。
背景技术：
几乎所有肝病均具有炎症坏死，而只要有炎症坏死，肝纤维化即发生。肝纤维化的不断发展，引起肝小叶结构改建和假小叶形成，导致肝硬化；纤维组织压迫血管，引起门脉高压和肝缺血，进而加剧肝细胞坏死和炎症，如此形成恶性循环。因此，阻断肝纤维化的发生和发展，对防治肝硬化具有重要意义。而且我国肝病发病率是比较高的国家之一，所以寻找有效途径抑制肝纤维化，有相当重要的意义。肝纤维化和它导致的最后阶段的肝硬化，通常是由病毒感染，过度使用损害肝脏的药物，代谢系统疾病，和遗传因素引起的。肝纤维化的病理进程，实际上是正常的肝组织被疤痕类似的胶原蛋白代替，导致肝功能的丧失，过去认为这个过程是一个不可逆的过程， 直到最近才认为这个过程在早期是可以挽救的。根据目前的研究，表明星状细胞在这个过程中起了关键作用。正常的肝脏中，星状细胞大约占肝体积的1.4%，相当于每100个肝细胞中大约有3. 6-6个星状细胞。纤维化的过程实际上是来自于门静脉和窦周的α平滑肌细胞骨架阳性的肌纤维母细胞产生和增殖的过程。虽然这种细胞有不止一种的潜在来源， 但被研究的最为清楚的就是肝星状细胞，在它们没有被活化成α平滑肌细胞骨架阳性表型的细胞之前，它们的主要功能是贮存维生素Α，调节维甲酸的水平。可一旦被活化后，它们就成为肝纤维化中纤维胶原的主要来源，而且它们通过收缩和释放致炎和致纤维因子，潜在的调节窦间隙的血流量。活化的星状细胞还能产生基质金属蛋白酶组织抑制剂，导致基质金属蛋白酶降解肝细胞外基质的功能受损，从而使细胞外基质向胶原和纤维化转变。随着RNAi作为制药技术的成熟，已有SiRNA药物进入临床实验，siRNA药物具有如下优点(1)、特异性强，碱基的顺序决定了它的特异性；(2)、设计便利，由于人类基因库已经完成，这为siRNA的设计带来了极大的便利，可以说几乎没有基因不能作为siRNA的靶标；03)、临床研究便利，siRNA药物作为核酸类药物，不管何种siRNA都具有大致相同的药物代谢，药物分布，药物毒性，这为进入临床研究带来了极大的便利；、由于RNAi —开始就已将特定基因作为靶标，所以siRNA分子药理学明确。
发明内容
本发明的目的在于利用RNAi (RNA干扰)技术，对候选的靶标基因进行效用、量效关系及特异性的评定，以提供能够抑制PAR-I (蛋白酶激活受体-1)基因表达的siRNA(小分子干扰RNA)，并进一步地提供该siRNA在临床上的应用。按照本发明提供的技术方案，所述siRNA为下述PAR-1-01 PAR-1-08中的任意一种，PAR-1-01 PAR-1-08 分别为PAR-1-01
正义链序列SEQIDNO.1为5'-AGGGCAGUCUACUUAAAUA-3‘
反义链序列SEQIDNO.2为5，-UAUUUAAGUAGACUGCCCU-3 ’
PAR-1-02
正义链序列SEQIDNO.3为5'-CGGCC⑶GGUGUACAUGCU-3‘
反义链序列SEQIDNO.4为5'-AGCAUGUACACCACGGCCG-3 ‘
PAR-1-03
正义链序列SEQIDNO.5为5'-CCUUCAAGAUCAGCUACUA-3‘
反义链序列SEQIDNO.6为5'-UAGUAGCUGAUCUUGAAGG-3‘
PAR-1-04
正义链序列SEQIDNO.7为5'-ACAUGUACGCCUCCAUCAU-3‘
反义链序列SEQIDNO.8为5'-AUGAUGGAGGCGUACAU⑶-3‘
PAR-1-05
正义链序列SEQIDNO.9为5'-GCAUCUUCAUC⑶CUGCUU-3‘
反义链序列SEQIDNO.10 为 5'-AAGCAGACGAUGAAGAUGC-3‘
PAR-1-06
正义链序列SEQIDNO.11 为 5'-CCACCAAC⑶CCUCCUGAU-3‘
反义链序列SEQIDNO.12 为 5'-AUCAGGAGGAC⑶UG⑶GG-3‘
PAR-1-07
正义链序列SEQIDNO.13 为 5'-GCAGGGCAGUCUACUUAAA-3‘
反义链序列SEQIDNO.14 为 5'-UUUAAGUAGACUGCCCUGC-3‘
PAR-1-08
正义链序列SEQIDNO.15 为 5'-GCUCUAGCCACCUGAAUAA-3‘
反义链序列SEQIDNO.16 为 5'-UUAUUCAGGUGGCUAGAGC-3‘
上述的各siRNA序列的3‘端垂悬两个dTdT，该垂悬不与mRNA序列互补，使正义链3'端更容易解链，从而增加其沉默效率。
上述的各siRNA序列可用于制备治疗肝纤维化的药物。
siRNA是RNAi途径中的中间产物，是RNAi发挥效应所必需的因子。siRNA的形
成主要由Dicer和Rde-I调控完成。由于RNA病毒入侵、转座子转录、基因组中反向重复序列转录等原因，细胞中出现了 dsRNA，Rde-I (RNAi缺陷基因-1)编码的蛋白质识别外源 dsRNA,当dsRNA达到一定量的时候，Rde-I引导dsRNA与Rde-I编码的Dicer (Dicer是一种 RNaseIII活性核酸内切酶，具有四个结构域=Argonaute家族的PAZ结构域，III型RNA酶活性区域，dsRNA结合区域以及DEAH/DEXHRNA解旋酶活性区)结合，形成酶-dsRNA复合体。 在Dicer酶的作用下，细胞中的单链靶mRNA(与dsRNA具有同源序列)与dsRNA的正义链互换，原来dsRNA中的正义链被mRNA代替而从酶-dsRNA复合物中释放出来，然后，在ATP的参与下，细胞中存在的一种RNA诱导的沉默复合体RNA-induced silencing complex (RISC, 由核酸内切酶、核酸外切酶、解旋酶等构成，作用是对靶mRNA进行识别和切割)利用结合在其上的核酸内切酶的活性来切割dsRNA上处于原来正义链位置的靶mRNA分子中与dsRNA 反义链互补的区域，形成21-23nt的dsRNA小片段，这些小片段即为siRNA。RNAi干涉的关键步骤是组装RISC和合成介导特异性反应的siRNA蛋白。siRNA并入RISC中，然后与靶标基因编码区或UTR区完全配对，降解靶标基因，因此说siRNA只降解与其序列互补配对的 mRNA。其调控的机制是通过互补配对而沉默相应靶位基因的表达，所以是一种典型的负调控机制。siRNA识别靶序列是有高度特异性的。而且它的合成非常简便，已经成为一项很成熟的技术。本发明针对PAR-I基因设计合成了 8对siRNA，该8对siRNA能够有效抑制PAR-I 基因的表达；同时由于siRNA技术越来越成熟，也为治疗肝纤维化提供了可行的药物。
图1为可见光源条件下的siRNA转染效率照片。图2为荧光激发条件下的siRNA转染效率照片。图3为荧光定量PCR检测转染不同siRNA的PAR-I基因表达水平图。图中M0CK是未转染任何siRNA的空白对照组；si-control是转染si-control的 siRNA 的无关对照组；PAR-1-01 PAR-1-08 是转染 PAR-1-01 PAR-1-08 的 siRNA 组图4为荧光定量PCR检测肝纤维化病理过程(天数)与PAR-I的mRNA的表达水平关系图。图中天数用于衡量肝纤维化病理过程图5为荧光定量PCR检测肝纤维化病理过程(天数)与TGF-betal的mRNA的表达水平关系图。图中天数用于衡量肝纤维化病理过程图6为荧光定量PCR检测肝纤维化病理过程(天数)与Collal的mRNA的表达水平关系图。图中天数用于衡量肝纤维化病理过程图7为PAR-1-01的siRNA在不同浓度下的量效曲线。图8为原代肝星型细胞体外培养不同时间的细胞形态图。图9为荧光定量PCR检测转染PAR-1-01的siRNA的原代肝星型细胞(体外培养 48小时)的PAR-I基因表达水平图。图10为荧光定量PCR检测转染PAR-1-01的siRNA的原代肝星型细胞(体外培养 48小时)的TGF-betal、Collal基因表达水平图。图11为荧光定量PCR检测转染不同浓度的PAR-1-01的siRNA的原代肝星型细胞 (体外培养48小时)的TGF-betal、Collal基因表达水平图。图12为荧光定量PCR检测转染PAR-1-01的siRNA的原代肝星型细胞(体外培养 5天)的PAR-I基因表达水平图。图13为荧光定量PCR检测转染PAR-1-01的siRNA的原代肝星型细胞(体外培养 5天)的TGF-betal、Collal基因表达水平图。图14为荧光定量PCR检测转染不同浓度的PAR-1-01的siRNA的原代肝星型细胞 (体外培养5天)的TGF-betal、Collal基因表达水平图。
具体实施例方式下面结合具体附图和实施例对本发明作进一步说明。本发明利用PCR和Wfesternblot技术确定了 HSC-T6肝星型细胞能够在RNA和蛋白水平大量表达PAR-I基因，所以本发明采用大鼠HSC-T6肝星型细胞系(来自于湘雅医学院细胞库)作为siRNA筛选细胞，该细胞常规培养在DMEM高糖培养剂(含10%体积比的胎牛血清中)，培养条件为37°C，5%体积比的二氧化碳，每三天传代一次。1、siRNA的设计合成根据siRNA设计原理，针对PAR-I基因的mRNA序列设计了 8对siRNA(参见表 1)。PAR-1-01 PAR-1-06设计成大小鼠同源的siRNA，目的主要是为了能够利用大鼠的 HSC-T6细胞系进行siRNA的筛选，而不必从大鼠或小鼠的肝脏中分离肝星型细胞，同时在后续的动物实验中能够利用小鼠作为病理模型，由于小鼠体重较大鼠轻很多，所以给药剂量可以大大减少，可以大大减低siRNA合成费用。设计方法及步骤为(1)利用NCBI的核苷酸数据库分别找到大鼠和小鼠PAR-I基因的RNA序列，它们在NCBI的Accessions分别为NM_012950. 2和NM_010169. 3 ； (2)利用CLUSTAL X (2. 0)序列比对软件将两条序列进行比对并找到同源部分；(3)利用Whitehead Institute在其网站(网址为:http//jura, wi. mit. edu/bioc/siRNAext/home. php)上发布的siRNA设计软件，针对同源部分进行设计；(4)利用NCBI的blastn的程序，调用数据库nt/nr进行分析，结果显示设计的这6对 siRNA不会与大鼠、小鼠除PAR-I基因之外的其它基因的序列同源。PAR-1-07 PAR-1-08 是仅针对大鼠PAR-I基因的siRNA设计，目的在于去除同源序列这个限制因素，使得siRNA 的设计结果更加可靠。上述PAR-1-01 PAR-1-08的siRNA均由上海吉玛制药技术有限公司提供合成。为提高所述siRNA的基因沉默效率，所述PAR-1-01 PAR-1-08的siRNA的 3'端垂悬有两个由脱氧核苷组成的碱基TT。
权利要求
1.抑制PAR-I基因表达的siRNA，其特征在于，所述siRNA为 PAR-1-05 正义链序歹Ij SEQ ID NO. 9 为 5，- GCAUCUUCAUCGUCUGCUU - 3， 反义链序列 SEQ ID NO. 10 为 5，- AAGCAGACGAUGAAGAUGC- 3，。
2.如权利要求1所述的抑制PAR-I基因表达的siRNA，其特征还在于，所述siRNA的3’ 端垂悬有两个用于提高基因沉默效率的由脱氧核苷组成的悬挂碱基TT。
3.如权利要求1或2所述的抑制PAR-I基因表达的siRNA，其特征于，所述siRNA序列用于制备治疗肝纤维化的药物。
全文摘要
本发明根据siRNA设计原理，针对PAR-1基因的mRNA序列设计了8对siRNA，该8对siRNA可以用于抑制PAR-1基因表达的siRNA，由于PAR-1基因的表达水平与肝纤维化密切相关，抑制PAR-1基因的表达就能有效延缓甚至阻断肝纤维化的病理进程，达到治疗肝硬化的目的。上述8对siRNA序列可用于制备治疗肝纤维化的药物。
文档编号A61K48/00GK102382836SQ201110377429
公开日2012年3月21日 申请日期2010年1月22日 优先权日2010年1月22日
发明者张红, 潘振华, 盛青松 申请人:无锡奥瑞生物医药科技有限公司