专利名称：二氧化硅基超声造影剂/hifu增效剂及其制备方法
技术领域：
本发明涉及纳米材料技术领域，特别涉及医用纳米生物材料技术领域，具体涉及一种可兼用作超声造影剂和HIFU增效剂的介孔二氧化硅纳米胶囊材料及其制备方法。
背景技术：
目前无创治疗的理念已经成为未来医学发展的新方向。超声疗法是向组织中沉积声能的最小侵入或非侵入性方法。高强度聚焦超声(High Intensity Focused Ultrasound, HIFU)作为最具有代表性的非侵入性和非放射性新型治疗模式，目前已经在临床上针对某些疾病(诸如子宫肌瘤)取得了巨大的成功。然而，HIFU在肿瘤特别是恶性肿瘤(癌症)的手术治疗上还没有得到广泛的应用。要解决这一难题，有两个关键点必须要得到有效的解决一个就是如何利用目前临床广泛使用的成像系统(诸如超声成像(US)、核磁共振成像(Magnetic Resonance Imaging, MRI)、CT、PET、X光等等)对病变部位进行高质量的成像，为HIFU的超声能量聚焦提供高质量的图像依据；另一个是在对病变部位进行精确的定位后，在利用HIFU进行无创手术时， 如何有效地提高HIFU的治疗效果，即如何在低超声功率下能得到高效的治疗效果。目前商业化的针对HIFU无创手术治疗的引导方式主要有两种超声成像(US)引导和核磁共振成像(MRI)引导。其中，超声成像是一个多功能、非侵入性、低风险、低价、便携的实时成像技术，是目前世界上应用最广泛的成像技术之一。然而，由于缺乏有效的造影剂，其对组织成像的空间/时间分辨率仍较低，不能满足一些早期疾病的诊断，其应用仍受到较大的限制。开发生物相容性好、造影性能优异的超声成像造影剂是解决超声成像低分辨率的有效途径之一。目前超声造影剂的研发仍局限在普通的微泡，即为包裹提高超声分辨的温敏型氟碳气体的微米级聚合物或有机脂质体微泡。由于其稳定性差，在血管内存留时间较短而影响靶向物质与受体的结合，且其粒径较大(多为微米级)，因而不能穿透血管内皮间隙，属于血池显像，限制了它们对血管外疾病的诊断与治疗(Ultrasonics，2004, 42，343)。而对于高强度聚焦超声(HIFU)增效消融治疗的研究也仅限于商用的微米级有机微泡。研究表明，肿瘤部位的血管内皮间隙至多允许直径小于700nm的颗粒穿过(Prοc. Natl. Acad. Sci. USA，1998，95，4607)。因此，寻找高效、小型化的影像学(超声、CT、MRI)共享型造影剂已成为分子显像领域的一个重要研究方向，也成为临床诊断和疾病治疗的迫切需要。近年来粒径在几十至几百纳米范围内可调控纳米造影剂引起人们极大的关注(Angew. Chem. -Int. Edit.，2003，42，3218)，它可以穿越血管内皮间隙，而微泡类造影剂/增效剂仅能发生血池内超声显像的局限，从而大大提高了对血管外病变组织的早期诊断能力。介孔纳米材料，例如介孔二氧化硅空心纳米材料具有巨大的空腔纳米结构、高比表面积、大孔容、可以负载客体分子而可用于吸附剂、催化剂载体和药物载体等相关领域。 例如CN100998335A公开一种核壳结构的稀土纳米抗菌剂，其包括球形介孔二氧化硅作为载体以及抗菌剂。近年来介孔二氧化硅空心纳米材料在生物医药领域的应用研究引起了广泛关注，特别是作为抗癌药物传输体系有望实现临床应用。可见，目前国内外对介孔二氧化硅纳米材料的研究主要集中在药物或DNA的运输以及药物的释放等方面，而在超声成像领域的应用鲜有报道。粒径大、薄壁的纳米介孔二氧化硅材料本身对于超声就有一定的超声增强作用。 结合其本身所具有的大比表面积、高孔容量、良好的可修饰性、优异的化学及热稳定性以及良好的生物相容性和可降解性等优点(Nano Lett.，2003，3，609 ；Biomaterials, 2010, 31，1085)。Pei-Lun Lin 等(Adv. Mater. , 2009, 21，3949)首次报道了利用无机空心纳米粒子(SiO2)作为超声成像造影剂。然而由于S^2壳层没有孔道结构，无法实现在空腔内部担载温敏型的氟碳化合物超声造影剂，造影效果差，同时也无法实现药物的装载，难以赋予造影和治疗双重功能的结合。该研究尚属于起步阶段，有关无机SiO2纳米超声造影剂的生物学效应以及与超声之间的相互作用机制还未涉及。此外，介孔二氧化硅纳米材料真正使用前必须全面深入了解其包括毒性、降解性等在内的一系列生物相容性问题。然而，在这方面国际上的基础研究工作的报道还十分有限。可喜的是，最近，中科院上海硅酸盐研究所施剑林等在介孔二氧化硅纳米材料的生物相容性基础研究和生物医学应用研究方面取得了一系列创新性研究成果从体外到体内、从细胞到活体组织和血液，系统考察了介孔二氧化硅纳米材料的生物降解性、细胞毒性、血液相容性、药代动力学和组织相容性，证明了介孔二氧化硅纳米材料具有良好的生物相容性，为其在生物医药领域的应用研究提供了重要的生物安全性参考资(Biomaterials 2010， 31， 1085; Biomaterials 2010， 31， 3335； Biomaterials 2010, 31,
7785; Small 2009， 5， 2722; Small 2010， DOI 10. 1002/ smll. 201001459)。最近，CN102068706A公开一种二氧化硅超声成像造影材料的制备方法，其通过表面修饰使二氧化化硅微球表面连有聚乙二醇，然而其也未涉及HIFU增效的作用。可见，目前对于利用纳米生物材料同时实现超声造影和对HIFU治疗进行增效的研究还未见报道，
更无相关专利可寻，有待进一步研究。
发明内容
面对现有技术存在的上述问题，本发明人经过锐意的研究，意识到近几年发展起来的介孔纳米材料可以有效地解决这一问题。即、介孔纳米材料，尤其是对生物相容性好的介孔二氧化硅空心纳米材料进行表面修饰并使其装载用于HIFU增效的分子可兼用作超声造影剂/HIFU增效剂。本发明人意识到可对介孔二氧化硅纳米材料进行表面改性，使其表面带有氨基、 羧基或巯基等活性官能团，然后进行表面修饰与聚二乙醇相连可增加其分散性进而可增加其超声成像效果。此外，本发明人还意识到介孔纳米材料由于具有大的空腔结构(空心球)，可以装载大量的客体分子有望用于HIFU增效。此外，空腔结构和孔道结构还可以赋予该纳米材料药物包覆和传输的性能，使得化疗和HIFU治疗一体化成为可能。在此，本发明提供一种二氧化硅基超声造影剂/HIFU增效剂，包括表面修饰有聚乙二醇的介孔二氧化硅纳米胶囊以及装载在所述介孔二氧化硅纳米胶囊中的用于HIFU增效的客体分子。采用本发明，很好地结合无机介孔二氧化硅纳米粒子与有机氟碳化合物的优势， 可提供有机无机复合的纳米超声造影剂/HIFU增效剂，得到更加稳定、生物相容性更好、超声造影性能更为优良、HIFU增效明显的诊疗剂。而且选用生物相容性优良的介孔二氧化硅纳米胶囊作为基体材料可进一步提高了本发明的临床应用性。又，所述介孔二氧化硅空心纳米胶囊的粒径可为100 lOOOnm，孔径可为2. 5 5nm。这种大比表面积和大孔径的空心载体结构可以更高效地装载客体分子用于HIFU增效。例如在本发明的一个优选示例中，所述用于HIFU增效的客体分子为所述介孔纳米颗粒质量的1. 7 8. 5%ο又，用于HIFU增效的客体分子可为有机氟碳化合物或者有机氟碳气体，包括全氟己烷(PFH)和全氟溴辛烷(PFOB )。在本发明中，所述介孔二氧化硅纳米胶囊还可装载有荧光标记物。这样，可更方便地跟踪试验和诊疗。本发明的二氧化硅基超声造影剂/HIFU增效剂还可包括装载在所述介孔纳米颗粒中的抗肿瘤药物。空腔结构和孔道结构可以赋予该纳米材料药物包覆和传输的性能，使得化疗和HIFU治疗一体化成为可能。所述抗肿瘤药物包括但不限于阿霉素、紫杉醇、多烯紫杉醇、长春新碱、氟尿嘧啶、甲氨喋呤、米托蒽醌、环磷腺苷、环磷酰胺、培洛霉素、硝卡介、 亚胺醌、阿柔比星、卡莫司汀、替莫唑胺、洛莫司汀、卡莫氟、替加氟、放线菌素D、丝裂霉素、 安吖啶、安磷汀、顺钼、阿拉瑞林、安鲁米特、氮芥中的一种或两种以上的混合物。另一方面，本发明提供一种制备上述二氧化硅基超声造影剂/HIFU增效剂的方法，包括对介孔二氧化硅纳米胶囊进行表面改性以使所述介孔二氧化硅纳米胶囊的表面带有氨基、羧基或巯基；使所述介孔二氧化硅纳米胶囊装载用于HIFU增效的客体分子；以及利用化学嫁接法对所述介孔二氧化硅纳米胶囊进行表面修饰以使所述介孔二氧化硅纳米胶囊的表面修饰有聚乙二醇。本发明的方法通过对介孔二氧化硅纳米材料进行表面改性和表面修饰使其与聚乙二醇相连，可增加材料的分散性和超声性能，同时使材料装载HIFU增效的客体分子形成有机无机复合多功能材料可同时实现超声造影和HIFU增效功能。本发明的方法，合成工艺简单易行、无污染、成本低。在本发明中，可通过挥发浸渍或真空灌注使所述介孔二氧化硅纳米胶囊装载用于 HIFU增效的客体分子。本发明装载用于HIFU增效的客体分子的方式简便、易行。在本发明中，所述介孔二氧化硅纳米胶囊可通过传统的选择性蚀刻法合成，包括 采用去离子水和乙醇作为溶剂、氨水作为碱化剂、正硅酸乙酯TEOS作为硅源、以及采用硅烷偶联剂作为结构导向剂制得实心二氧化硅纳米球；以及采用碳酸钠水溶液作为蚀刻剂蚀刻所述实心二氧化硅纳米球。此外，所述介孔二氧化硅纳米胶囊还可通过一步法合成即、以全氟十七烷三甲基氧硅烷作为硅烷偶联剂，将乙醇、正硅酸乙酯和全氟十七烷三甲基氧硅烷在室温下搅拌30 分钟 6小时后，以去离子水作为溶剂、氨水作为碱化剂在30 50°C下反应1 6小时。该方法利用了特殊的全氟十七烷三甲基氧硅烷PDES强的疏水氟碳链段与醇水之间的作用， 一步法即可合成介孔二氧化硅纳米胶囊。
再一方面，本发明还提供另一种制备上述二氧化硅基超声造影剂/HIFU增效剂的方法，包括将乙醇、正硅酸乙酯和硅烷偶联剂在室温下搅拌30分钟 6小时后，然后加入用于HIFU增效的客体分子，以去离子水作为溶剂、氨水作为碱化剂在30 50°C下反应1 6 小时，得到装载有用于HIFU增效的客体分子的介孔二氧化硅纳米胶囊；对所述介孔二氧化硅纳米胶囊进行表面改性以使所述介孔二氧化硅纳米胶囊的表面带有氨基、羧基或巯基； 以及利用化学嫁接法对所述介孔二氧化硅纳米胶囊进行表面修饰以使所述介孔二氧化硅纳米胶囊的表面修饰有聚乙二醇。采用该方法，可先一步法合成无机有机复合二氧化硅纳米材料后再进行表面改性和表面修饰，制备工艺简单、易行。本发明所用的硅烷偶联剂可包括十八烷基三甲基硅烷C18TMS、十六烷基三甲基溴化铵CTAB、和全氟十七烷三甲基氧硅烷PDES。优选与有机氟碳化合物有着较强作用力的表面活性剂全氟十七烷三甲基氧硅烷PDES。在本发明中，所述用于HIFU增效的客体分子与所述硅烷偶联剂的体积比可为0. 61 3 :1，以得到合适的装载量。本发明合成工艺简单易行、无任何污染(无污染物排放)、产量高、成本低、效率高、 易工业化生产；制得的二氧化硅基超声造影剂/HIFU增效剂可以有效地给肿瘤组织显影， 并且可显著提高HIFU治疗的效果，因此显示出广阔的应用前景。此外，该造影剂/增效剂比表面积高、孔容大、孔径分布均一，有利于药物在其中的高效担载，有利于实现化疗与HIFU 无创治疗的一体化。
图1示出制备本发明的二氧化硅基超声造影剂/HIFU增效剂的示意流程图2A示出以表面活性剂C18TMS作为结构导向剂制得的介孔SW2纳米胶囊的透射电镜照片；
图2B示出以表面活性剂CTAB作为结构导向剂制得的介孔SiO2纳米双层壁胶囊的透射电镜照片；
图2C示出以表面活性剂CTAB作为结构导向剂制得的介孔SiO2纳米空心胶囊的透射电镜照片；
图2D示出以新型表面活性剂PDES作为结构导向剂制得的介孔SW2纳米空心球的透射电镜照片；
图2E示出以新型表面活性剂PDES和C18TMS作为联合结构导向剂制得的介孔SW2交联球载体的透射电镜照片；
图2F示出通过一步法制备的有机无机复合的介孔S^2纳米诊疗剂的透射电镜照片； 图3 A和;3B示出介孔SiO2纳米胶囊、表面改性带有巯基的介孔SiO2纳米胶囊、表面修饰有聚乙二醇的介孔SW2纳米胶囊、以及装载有PFH且表面修饰有聚乙二醇的介孔SW2 纳米胶囊的平均粒径和^ta电位；
图3C示出表面修饰有聚乙二醇的介孔SW2纳米胶囊的红外光谱； 图4示出本发明的二氧化硅基超声造影剂/HIFU增效剂在不同温度下温敏现象的共聚焦照片；
图5示出不含本发明的二氧化硅基超声造影剂/HIFU增效剂的磷酸缓冲液对照液在不同温度下温敏现象的共聚焦照片；
图6示出本发明的带有荧光标记物的二氧化硅基超声造影剂/HIFU增效剂被细胞吞噬后的共聚焦显微照片；
图7示出本发明的二氧化硅基超声造影剂/HIFU增效剂在超声作用下的体外造影性
能；
图8示出采用体外脱气牛肝评价本发明的二氧化硅基超声造影剂/HIFU增效剂在HIFU 治疗中的增效结果；
图9示出采用荷有肿瘤的兔子模型评价本发明的二氧化硅基超声造影剂/HIFU增效剂在HIFU治疗中的增效结果。
具体实施例方式参照说明书附图，并结合下述实施方式进一步说明本发明，应理解，说明书附图及下述实施方式仅用于说明本发明，而非限制本发明。参见图1，其示出本发明的二氧化硅基超声造影剂/HIFU增效剂的两种方法的示例制备流程。首先，在第一种方法中，在步骤Si，可采用不同的制备工艺制备具有不同孔道结构和表面特性的介孔S^2纳米载体。例如采用传统的选择性蚀刻法，通过蚀刻实心S^2纳米球制得介孔S^2纳米载体。也可通过一步法合成介孔S^2纳米载体。选择性刻蚀法合成不同的介孔SiA纳米胶囊载体制备过程可以去离子水和乙醇作为溶剂，氨水作为碱催化剂，可采用不同的硅烷偶联剂(例如，十八烷基三甲基硅烷 C18TMS、十六烷基三甲基溴化铵CTAB、全氟十七烷三甲基氧硅烷PDES等)作为结构导向剂， 加入正硅酸乙酯(TEOS)作为硅源在一定的温度下反应一定的时间并处理，得到介孔SiO2纳米载体材料。大致过程如下一定量的离子水、乙醇和氨水溶液，在水浴中30°C搅拌一定时间，逐滴加入一定量的TE0S，可以观察到溶液呈乳白色状(sSi02)。然后分别加入一定量的 TEOS和不同的量的C18TMS、CTAB、PDES，30°C水域中搅拌一段时间后，将产物收集后充分洗涤。配制Na2CO3的水溶液，加入上述离心产物，水域一定温度下(例如，50 80°C )搅拌一定时间(例如，30min IOh)去除中间的实心SW2内核，将产物收集后充分洗涤、真空干燥， 煅烧得到不同孔结构的介孔SW2纳米胶囊载体(MSNCs)。一步法合成新型介孔SiO2纳米胶囊载体材料制备时，首先将一定比例的乙醇、 TEOS以及特殊的氟碳硅烷PDES室温搅拌一定时间(例如，30min 6h)后，以去离子水和氨水作为溶剂和碱催化剂，在一定温度(例如，30 50°C)的水浴中反应一定时间(例如，1 他)，得到的产物经过通过充分洗涤、真空干燥，煅烧得到新型介孔基S^2纳米胶囊载体材料(PMSNCs)。应理解，这里尽管采用新型的与有机氟碳化合物有着较强作用力的表面活性剂PDES作为示例结构导向剂，但应理解也可采用其它与有机氟碳化合物有着较强作用力的合适表面活性剂。上述制备方法采用正硅酸乙酯(TEOS)作为硅源，但应理解，也可采用其它非功能性的硅源。本发明的方法可通过采用不同表面活性剂制备具有不同表面特性的介孔SiO2 纳米材料，例如采用新型的表面活性剂PDES，由于其具有较强的结合有机氟碳化合物的能力，可增加制得的纳米材料负载有机氟碳化合物的能力，进而提高HIFU的增效作用。通过不同的制备工艺(例如，选择性腐蚀、一步法合成空心胶囊)、采用不同的表面活性剂材料 C18TMS, CTAB和PDES作为结构导向剂，可制备出不同形貌(空心胶囊，杂化介孔材料)、粒径大小(100 lOOOnm)、介孔结构(有序/无序，孔径2. 3 5nm,孔容0. 2 1. 4cm3/g)。接着在步骤S2，对制得的介孔S^2纳米材料进行表面修饰以使其表面带有氨基、 羧基或巯基等活性官能团。表面改性的操作可采用本领域技术人员熟知的常用方法。然后，在步骤S3，采用不同的装载工艺(例如，挥发浸渍法，真空灌注法)装载用于 HIFU增效的客体分子(有机氟碳化合物或氟碳气体)得到无机有机复合纳米材料。装载的大致过程可如下所示将不同条件制备出的介孔SiO2纳米胶囊粉体经过一定的预处理过程(例如，溶解，脱气)，加入一定量(例如1 10 μ L/mg MSNCs )的有机氟碳化合物(Ρ 、 PF0B)或者灌注入氟碳化合物气体，经过一定时间的搅拌或超声，得到复合的纳米诊疗剂 (MSNC-PFH, PMSNC-PFH).选择生物相容性良好的有机氟碳化合物(Pi7H)作为负载分子，其具有良好的超声敏感及温敏特性，在超声作用或56°C产生相变，由液态转变为超声高弹性的氟碳气泡，并从载体的介孔孔道中缓慢、持续地释放，稳定、有效地增强超声成像及HIFU 增效消融的能力。最后，在步骤S4对制得的复合纳米材料进行表面修饰。本发明所选用的表面修饰材料为公认具有良好生物相容性的生物大分子聚乙二醇。聚乙二醇的修饰方法可采用领域技术人员熟知的常用方法，例如采用由酰胺基活化的聚乙二醇，或者辅助采用合适的缩合剂或连接剂。经过一定表面修饰后纳米材料可分散到PBS的溶液中，配制成不同浓度的溶液，封存。制备不同的无机载体之后，装载不同相变温度、超声敏感特性的良好生物相容性的有机氟碳化合物(Pra、PFOB)或者有机氟碳气体(Pra气体、pfob气体)，赋予良好的可修饰性及优异的化学及热稳定性的无机介孔纳米载体材料优良的超声敏感特性。对灌注、浸渍有机氟碳化合物的复合材料，利用表面预先修饰的官能团(-NH2, -C00H, -SH等)，采用温和的化学嫁接方法进行表面修饰(PEG等)，既保证了氟碳化合物不损失又赋予复合材料在 PBS中良好的分散性。又参见图1，其还示出制备本发明的二氧化硅基超声造影剂/HIFU增效剂的另一种方法，与上述方法不同的是，在该方法中，首先采用一步法制备无机有机复合的纳米材料，即、在制备纳米材料载体的同时完成装载有机氟碳化合物的过程，然后再进行表面改性和表面修饰。在步骤Si’，通过一步法制备无机有机复合的纳米材料取一定量的乙醇、PDES表面活性剂和TEOS作为前躯体溶液，室温搅拌一定时间(30min 他)，加入一定量(例如， 0. 61 3倍于PDES量)的有机氟碳化合物(PFH、PF0B)，以去离子水和氨水作为溶剂和碱催化剂，在一定温度(30 50°C )的水浴中反应一定时间(1 他)，观察到溶液呈乳白色状， 将产物收集后充分洗涤，得到复合的诊疗剂(PMSN-PFH)。采用有机无机交联一步法可合成具有优良的超声敏感特性的稳定的有机无机复合的介孔纳米诊疗剂材料。该方法中的表面改性(S2’)和表面修饰的步骤与第一种方法类似，在这里不再累述。本发明提供了一种简单、环境友好的方法制备出具有良好分散性、良好生物相容性、粒径可控和孔径可控、超声造影性能优良、HIFU增效明显的多功能的纳米材料。本发明选用不同的硅烷偶联剂(例如，十八烷基三甲基硅烷C18TMS、十六烷基三甲基溴化铵CTAB、全氟十七烷三甲基氧硅烷PDES等)、不同的合成工艺可制备出不同形貌(空心胶囊，杂化介孔材料)、粒径大小、介孔结构(及表面特性的介孔S^2纳米载体材料；其次， 利用介孔S^2纳米胶囊载体材料丰富的孔道及空腔体积，选择不同的超声敏感的有机氟碳化合物(例如，全氟己烷pra、全氟溴辛烷PF0B)或者氟碳气体，采用合适的装载方式(例如， 挥发浸渍法，真空灌注法)将疏水性的氟碳化合物进行装载，制备无机有机复合的介孔SW2 纳米基诊疗剂体系材料；同时还可以利用特殊的PDES表面活性剂与有机氟碳化合物的作用力，在载体制备的过程当中加入有机氟碳化合物(pra、PFOB等)，一步法制备粒径和孔径可控的有机无机复合介孔SiO2纳米基诊疗剂材料。本发明首次结合无机介孔纳米粒子与有机氟碳化合物的优势，设计制备出有机无机复合的纳米超声造影剂/HIFU增效剂，得到稳定、生物相容性良好、超声造影性能优良、HIFU增效明显的诊疗剂体系。此外，本发明还可以整合其它功能模块，例如荧光成像、PET成像、CT成像和超声成像等，得到更加智能化的纳米药物/造影剂输送体系。重要的是，利用介孔SiO2纳米基载体的可控孔结构和表面的可修饰性，在担载有机氟碳化合物之前还可以实现亲/疏水药物的担载，实现材料诊断、HIFU治疗、药物化疗、药物缓释和靶向作用的多种功能的复合，因此可以实现HIFU无创治疗和化疗的一体化，为肿瘤的治疗提供更好、更有效的治疗方案。图2A 2F分别示出以表面活性剂C18TMS、CTAB、PDES作为结构导向剂制得的介孔SiA纳米材料以及一步法制得的介孔SiA纳米材料的透射电镜照片(TEM照片)。结果表明不同方法制备的载体材料均具有良好的分散性、可控的孔径和空腔体积。图3 A和;3B示出介孔SiO2纳米胶囊、表面改性带有巯基的介孔SiO2纳米胶囊、 表面修饰有聚乙二醇的介孔SW2纳米胶囊、以及负载有PFH且表面修饰有聚乙二醇的介孔 SiO2纳米胶囊的平均粒径和^ta电位；图3C示出表面修饰有聚乙二醇的介孔SiA纳米胶囊的红外光谱；从图中可以看出，经巯基(-SH)和马来酰亚胺作用后，材料在温和的条件下可以在表面修饰上PEG，保证了材料在PBS溶液中良好的分散性。图4示出本发明的二氧化硅基超声造影剂/HIFU增效剂在不同温度下温敏现象的共聚焦照片；从图中可以看出在室温下，装载的全氟己烷(Pra)稳定存在于MSNCs中，进行一次70°c加热之后，超声敏感/温敏的Pra发生相变产生气泡，即可以起到超声增强的作用；70°C二次加热之后可以观察到气泡长大等空化效应。图示出不含本发明的二氧化硅基超声造影剂/HIFU增效剂的磷酸缓冲液对照液在不同温度下温敏现象的共聚焦照片。从图中可以发现无明显气泡产生。图6示出本发明的带有荧光标记物的二氧化硅基超声造影剂/HIFU增效剂被 MCF-7、Hela和细胞吞噬后的共聚焦显微照片；细胞核被DAPI染色并呈现出蓝色。 MSNC-PFH被FITC标记呈现出绿色。从图片中可以看出绿色的荧光出现在胞浆中，证明 MSNC-PFH纳米粒子可以被癌细胞吞噬。图7示出本发明的二氧化硅基超声造影剂/HIFU增效剂在超声作用下的体外造影性能；与PBS对照组比较，MSNC-PFH材料在超声作用下释放出气泡显著增强了超声成像的性能。图8示出采用体外脱气牛肝评价本发明的二氧化硅基超声造影剂/HIFU增效剂在 HIFU治疗中的增效结果；其示出注入0.3mL MSNC-ΡΠΙ材料后牛肝在HIFU作用下的消融结果的B超图。由图可知，在70W-10S作用后，Pi7H没有达到相变温度，只有MSNCs对于HIFU消融的贡献。在120W4S时，Pra发生相变，从MSNCs中释放处理，产生气泡，显著增加了 HIFU的消融结果。图9示出采用荷有肿瘤的兔子模型评价本发明的二氧化硅基超声造影剂/HIFU增效剂在HIFU治疗中的增效结果。其示出将MSNC-Pra材料通过种植VX2肿瘤的瘤兔耳静脉注射后HIFU消融肿瘤后的超声成像的B超图。从图中可以显著地看出在肿瘤部位，经过 HIFU消融之后，肿瘤部位的灰度值明显增强，显示出HIFU消融产生损伤。肿瘤消融前后数码图片说明了 MSNC-Pra可以有效实现HIFU消融肿瘤的能力。体外和体内的实验结果表明本发明提供的这种多功能纳米材料可以有效地用作超声造影剂，精确地为HIFU治疗定位肿瘤部位，并有效地提高HIFU的治疗效果。重要的是，这种新型的多功能材料还可以进行抗癌药物的担载和传输，因此可以将HIFU治疗和化疗进行相互辅助治疗，从而提高肿瘤的治疗效果。本发明进一步例如以下实施例以更好地说明本发明。同样应理解，以下实施例是为了更好地说明本发明，而非限制本发明。实施例1
合成介孔SW2纳米胶囊35. 7 mL乙醇，5 mL去离子水和1. 57 mL氨水在30°C水域中搅拌30 min。迅速加入3 mL正硅酸乙酯(TEOS)搅拌Ih。之后，再加入2. 5 mL TEOS和1 mL十八烷基三甲基硅烷(C18TMS)继续搅拌lh，得到的白色沉淀离心。配制0. 6 M的Na2CO3 水溶液，加入上述白色沉淀80°C搅拌刻蚀0. ^！。得到的沉淀水洗3次，干燥后550 °C煅烧 6 h0实施例2
合成负载荧光的有序介孔S^2纳米胶囊35. 7 mL乙醇，5 mL去离子水和1. 57 mL氨水在30°C水域中搅拌30 min。迅速加入3 mL正硅酸乙酯(TEOS)搅拌lh。之后，再加入2 mL TEOS后反应后离心分散在14mL水中；取上述溶液2mL，75 mg CTAB，去离子水15 mL，乙醇 15 mL 和氨水 0.275 mL搅拌 0.5 h。最后加入 0.125 mL TEOS 和 150uL FITC_APTES30°C 搅拌2 h。在IOmL水中加入212 mg Na2CO3,加入离心产物，50°C反应10 h，甲醇中回流去除表面活性剂CTAB，得到负载荧光的有序介孔空心球载体。实施例3
重复实施例2的方法，但在70°C蚀刻反应2 h，得到负载荧光的有序介孔铃铛型载体。实施例4
重复实施例2的方法，但在80°C蚀刻反应0.证，得到负载荧光的有序介孔双层壁载体。实施例5
一步法制备粒径和孔径可控的介孔SiA纳米胶囊载体材料11. 9 mL乙醇，0. 833 mL TE0S,0. 345 mL PDES溶液在30°C水域中搅拌1.证，加入1. 67 mL去离子水和0. 523 mL氨水在30°C水域中反应lh。离心分散。实施例6
一步法制备无机有机复合的粒径和孔径可控的介孔SiO2纳米基诊疗剂体系材料11. 9 mL乙醇，0.833 mL TE0S，0. 345 mL PDES溶液室温搅拌Ih后加入0. 5mL全氟己烷，30°C水域中搅拌30 min，加入1.67 mL去离子水和0. 523 mL氨水在30°C水域中反应lh。离心分散。
实施例7
将不同合成工艺先得到介孔S^2纳米胶囊干燥后溶解在二氯甲烷中，加入一定量的超声温敏聚合物全氟己烷(Pra)IO μ L/mg MSNCs，在40°C加热套中缓慢搅拌一定时间，挥发二氯甲烷并装载Pra在介孔的孔道和空腔中。后续处理参照实施例1。实施例8
重复实施例7的方法，但将介孔S^2纳米胶囊干燥后溶解在二氯甲烷中，加入一定量的超声温敏聚合物全氟溴辛烷(PFOB) 10 μ L/mg MSNCs0实施例9
重复实施例7的方法，但将介孔S^2纳米胶囊干燥后，通入一定量的超声温敏聚合物全氟溴辛烷气体(PFOB气体)。实施例10
重复实施例7的方法，但产物干燥后封装在带橡胶盖的小瓶中，用针筒将瓶中抽真空后加入一定量的全氟己烷(PI7H) 10 μ L/mg MSNCs0实施例11
将制备的介孔SiO2纳米胶囊100 mg，加入300uL 3-巯基丙基三甲氧基硅烷(MPTMS)在 IOOmL异丙醇中回流接上巯基，干燥后装载ΡΠΙ，分散在水中。加入1:1的马来酰亚胺PEG (MAL-PEG),室温搅拌他后放入配制的PBS溶液中透析Mh，配制成相应浓度的溶液。实施例12
将一步法制备的无机有机复合的粒径和孔径可控的介孔S^2纳米基诊疗剂体系材料 100 mg，加入300uL 3-巯基丙基三甲氧基硅烷(MPTMS)在IOOmL异丙醇中回流接上巯基，干燥后分散在水中。加入1:1的马来酰亚胺PEG (MAL-PEG),室温搅拌他后放入配制的PBS 溶液中透析Mh，配制成相应浓度的溶液。实施例13
重复实施例12的方法，但加入300uL 3-氨丙基三甲氧基硅氧烷(APTMS)，在IOOmL异丙醇中回流接上氨基。加入1 1的羧基PEG (COOH-PEG)，室温搅拌他后放入配制的PBS 溶液中透析Mh，配制成相应浓度的溶液。实施例14
重复实施例12的方法，但加入300uL 3-(3-羧基烯丙酰胺基)丙基三乙氧基硅烷，在 IOOmL异丙醇中回流接上氨基。加入1:1的氨基PEG (NH2-PEG),室温搅拌他后放入配制的PBS溶液中透析Mh，配制成相应浓度的溶液。实施例15
通过共聚焦显微镜进行细胞吞噬观察首先将FITC标记好的MSNC-Pra分散到细胞培养基中(200yg/mL)。再将细胞接种到共聚焦显微镜专用培养皿中，待细胞密度长到 60%-70%时，去掉培养基，加入含有MSNC-Pra纳米粒子的细胞培养基再共培养。去掉培养基，用PBS溶液尽量清洗掉没有被细胞吞噬的纳米粒子。最后用DAPI试剂染细胞核，转移到共聚焦显微镜下观察。图6示出FITC标记好的MSNC-Pra被MCF_7、Hela和细胞吞噬后的共聚焦显微照片；细胞核被DAPI染色并呈现出蓝色。MSNC-Pra被FITC标记呈现出绿色。从图片中可以看出绿色的荧光出现在胞浆中，证明MSNC-Pra纳米粒子可以被癌细胞吞噬。
实施例16
将担载Pra后的MSNC-Pra的PBS溶液O. 3mL封装在玻底培养皿中，加热后产生气泡并出现气泡融合长大过程；将材料注入导管中，埋入导电胶中，在超声作用下(MI=L 1)体外成像，与PBS的超声成像的结果相对比，MSNC-PFH的具有较好的超声成像效果(参见图7)。实施例17
将体外牛肝脱气30min后，利用针管注入0. 3mL MSNC-PFH的PBS溶液到牛肝皮下23mm 下。HIFU在不同功率下消融，记录B超显示消融前后的不同灰度值并对消融之后的损伤体积进行计算。参见图8，由图可知，在70W-10S作用后，Pi7H没有达到相变温度，只有MSNCs 对于HIFU消融的贡献。在120W-k时，PHI发生相变，从MSNCs中释放处理，产生气泡，显著增加了 HIFU的消融结果。实施例18
将MSNC-Pra的PBS溶液通过瘤兔的耳静脉注入到瘤兔体内，经过IOmin的循环，采用超声扫描瘤兔肝部，定位肿瘤后，采用HIFU消融肿瘤，记录消融前后的不同灰度值并对消融之后的损伤体积进行计算。参见图9，从图中可以显著地看出在肿瘤部位，经过HIFU消融之后，肿瘤部位的灰度值明显增强，显示出HIFU消融产生损伤。肿瘤消融前后数码图片说明了 MSNC-Pra可以有效实现HIFU消融肿瘤的能力。产业应用性本发明提供一种制备具有良好的生物相容性的二氧化硅基超声造影剂/HIFU增效剂及其制备方法。本发明的制备工艺简单易行、无任何污染、产量高、成本低、 效率高，得到的二氧化硅基超声造影剂/HIFU增效剂可以有效地给肿瘤组织显影，并且显著提高HIFU治疗的效果，因此显示出广阔的应用前景。此外，该多动能材料比表面积高、孔容大、孔径分布均一可调，有利于药物在其中的高效担载，有利于实现化疗与HIFU无创治疗的一体化。
权利要求
1.一种二氧化硅基超声造影剂/HIFU增效剂，其特征在于，包括表面修饰有聚乙二醇的介孔二氧化硅纳米胶囊以及装载在所述介孔二氧化硅纳米胶囊中的用于HIFU增效的客体分子。
2.根据权利要求1所述的二氧化硅基超声造影剂/HIFU增效剂，其特征在于，所述介孔二氧化硅纳米胶囊粒径为100 lOOOnm，孔径为2. 5 5nm，孔容为0. 2 1. 4cmVgo
3.根据权利要求1所述的二氧化硅基超声造影剂/HIFU增效剂，其特征在于，所述用于 HIFU增效的客体分子为所述介孔纳米颗粒质量的1. 7 8. 5%。
4.根据权利要求1所述的二氧化硅基超声造影剂/HIFU增效剂，其特征在于，用于 HIFU增效的客体分子包括全氟己烷和全氟溴辛烷。
5.根据权利要求1所述的二氧化硅基超声造影剂/HIFU增效剂，其特征在于，所述介孔二氧化硅纳米胶囊装载有荧光标记物。
6.根据权利要求1 5中任一项所述的二氧化硅基超声造影剂/HIFU增效剂，其特征在于，所述介孔二氧化硅纳米胶囊装载有抗肿瘤药物。
7.一种制备权利要求1 6中任一项所述的二氧化硅基超声造影剂/HIFU增效剂的方法，其特征在于，包括对介孔二氧化硅纳米胶囊进行表面改性以使所述介孔二氧化硅纳米胶囊的表面带有氨基、羧基或巯基；使所述介孔二氧化硅纳米胶囊装载用于HIFU增效的客体分子；以及利用化学嫁接法对所述介孔二氧化硅纳米胶囊进行表面修饰以使所述介孔二氧化硅纳米胶囊的表面修饰有聚乙二醇。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，通过挥发浸渍或真空灌注使所述介孔二氧化硅纳米胶囊装载用于HIFU增效的客体分子。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述介孔二氧化硅纳米胶囊通过选择性蚀刻法合成，包括采用去离子水和乙醇作为溶剂、氨水作为碱化剂、正硅酸乙酯作为硅源、以及采用硅烷偶联剂作为结构导向剂制得实心二氧化硅纳米球；以及采用碳酸钠水溶液作为蚀刻剂蚀刻所述实心二氧化硅纳米球。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述硅烷偶联剂包括十八烷基三甲基硅烷、十六烷基三甲基溴化铵、和全氟十七烷三甲基氧硅烷。
11.根据权利要求7所述的方法，所述介孔二氧化硅纳米胶囊通过一步法合成以全氟十七烷三甲基氧硅烷作为硅烷偶联剂，将乙醇、正硅酸乙酯和全氟十七烷三甲基氧硅烷在室温下搅拌30分钟 6小时后，以去离子水作为溶剂、氨水作为碱化剂在30 50°C下反应1 6小时。
12.—种制备权利要求1 6中任一项所述的二氧化硅基超声造影剂/HIFU增效剂的方法，其特征在于，包括将乙醇、正硅酸乙酯和硅烷偶联剂在室温下搅拌30分钟 6小时后，然后加入用于 HIFU增效的客体分子，以去离子水作为溶剂、氨水作为碱化剂在30 50°C下反应1 6小时，得到装载有用于HIFU增效的客体分子的介孔二氧化硅纳米胶囊；对所述介孔二氧化硅纳米胶囊进行表面改性以使所述介孔二氧化硅纳米胶囊的表面带有氨基、羧基或巯基；以及利用化学嫁接法对所述介孔二氧化硅纳米胶囊进行表面修饰以使所述介孔二氧化硅纳米胶囊的表面修饰有聚乙二醇。
13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，所述硅烷偶联剂包括十八烷基三甲基硅烷、十六烷基三甲基溴化铵和全氟十七烷三甲基氧硅烷。
14.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，所述硅烷偶联剂为全氟十七烷三甲基氧硅烷，所述用于HIFU增效的客体分子与所述硅烷偶联剂的体积比为0. 61 3 :1。
全文摘要
本发明涉及一种二氧化硅基超声造影剂/HIFU增效剂及其制备方法，所述二氧化硅基超声造影剂/HIFU增效剂包括表面修饰有聚乙二醇的介孔二氧化硅纳米胶囊以及装载在所述介孔二氧化硅纳米胶囊中的用于HIFU增效的客体分子。采用本发明，很好地结合无机介孔二氧化硅纳米粒子与有机氟碳化合物的优势，可提供有机无机复合的纳米超声造影剂/HIFU增效剂，得到更加稳定、生物相容性更好、超声造影性能更为优良、HIFU增效明显的诊疗剂。
文档编号A61K45/00GK102441179SQ20111040239
公开日2012年5月9日 申请日期2011年12月7日 优先权日2011年12月7日
发明者施剑林, 王霞, 陈航榕, 陈雨 申请人:中国科学院上海硅酸盐研究所