专利名称：一种微囊藻毒素mc-lr促二乙基亚硝胺den诱发大鼠肝癌模型建立的方法
技术领域：
本发明属于生物医药领域，具体涉及一种微囊藻毒素MC-LR促二乙基亚硝胺DEN 诱发大鼠肝癌模型建立的方法。
背景技术：
肝癌是我国常见的恶性肿瘤之一，有“癌王”之称。因此需要选择一种合适的肝癌动物模型来模拟人体肝癌的病变过程帮助肝癌的研究。诱发性肝癌模型是指用化学、物理或生物的致癌因素作用于动物而形成的肝癌模型。其中，二乙基亚硝胺(DEN)是动物肝癌是一种广泛应用的诱发剂，它诱发的肝癌过程与人体癌症演变过程非常相似。目前DEN已被国际肿瘤研究中心机构确定的致癌物质。微囊藻毒素MC是一种肝毒素，生物毒性作用的靶器官为肝脏。可从血液中转移到肝脏，主要表现为使肝脏充血肿大，严重时可导致肝出血和坏死。大鼠肝癌模型的建立方法分为移植型和原发性两种，移植型肝癌模型通常是将肝癌细胞注射到小鼠腹腔，抽取腹水后分离成细胞悬液，再打开小鼠腹腔并将细胞悬液注射到小鼠肝脏建立模型。该模型成瘤时间较短，但无法观察到肝癌发生的过程。原发性肝癌模型是利用化学致癌物质诱发大鼠肝癌缓慢发生，这种模型虽然时间较长，但可以观察到肝癌发生发展的主要阶段，有利于肝癌早期瘤前病变的检测。目前国内外有很多用DEN诱发原发性大鼠肝癌的模型，一般采用0. 25% DEN水溶液灌胃或自由饮水的方法建立大鼠肝癌模型。该模型主要存在的问题是染毒剂量不准确，时间较长，如李笑岩等人用含二乙基亚硝胺(DEN，80X10_6)饮水建立大鼠肝癌模型，其模型1-8周为肝细胞损伤期，9-16周为增生-硬化期，17-25周为癌变期。而赵金明等以二乙基亚硝胺为启动剂，藻毒素为促进剂， 构建大鼠肿瘤促进模型，观察肝脏病理形态改变，分别运用免疫组化法、原位杂交法检测肝细胞中GST-Pi蛋白和GST-Pi mRNA表达情况。结果显示实验组动物肝脏产生结节性增生灶，藻毒素单独作用不能诱导GST-Pi蛋白和GST-Pi mRNA表达，但能够促进DEN诱导产生的GST-Pi mRNA及蛋白表达。提示藻毒素具有促癌活性，但所用的藻毒素是从水华蓝藻中的初提物，并没有藻毒素纯度及类别鉴定的数据，而藻毒素有60多种，不同时间、地点所收集的水体藻样所中藻毒素的含量及类别是有差异的，这些增加了实验结果的不确定性。另夕卜，所用的藻毒素剂量为20mg/kg. bw(高剂量)、5mg/kg. bw(低剂量)(相当于干藻细胞质量)，并没有进行系列浓度实验。藻毒素专一性地作用于肝脏，主要抑制蛋白磷酸酶PP1、PP2的活性，具有明显的剂量-效应关系低剂量的藻毒素有促细胞生长作用，而高剂量可以诱导细胞凋亡，抑制细胞生长。因此，确定藻毒素类型及作用浓度范围对于促癌模型的建立显得尤为重要。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是通过慢性毒理实验，在低浓度下建立藻毒素MC-LR促二乙基亚硝胺(DEN)诱发大鼠肝癌模型，在这个过程中可以通过形态学、组织病理学和蛋白表达水平观察到肝癌形成的主要阶段，包括肝细胞损伤期，肝细胞增生-肝硬化期以及肝细胞癌变期。本发明的技术方案如下
一种微囊藻毒素MC-LR促二乙基亚硝胺(DEN)诱发大鼠肝癌模型的建立方法，步骤为
1.大鼠肝癌模型的建立
A、选取体重为150士5g的SD雄性大鼠15只，给予一周的适应时间，饲养期间给予充足的食物，并做好各项消毒措施；
B、用纯水将DEN配成浓度为0.25%的溶液；
C、用无水甲醇将藻毒素纯品粉末溶解，配制成lmg/ml的藻毒素溶液；
D、将0.25%的DEN溶液和lmg/ml的藻毒素溶液注射到大鼠腹腔内，使DEN终浓度为 10mg/kg,藻毒素终浓度为lOPg/kg ；
E、上述过程每五天进行一次，共处理4个月；
F、模型建立过程中始终观察大鼠的食欲，饮水，皮毛，精神等情况；
2.形态学检测
在每个月末以颈椎脱白法处死大鼠，打开腹腔，完整地取出肝脏后用PBS缓冲液清洗， 记录体重、肝重并计算肝重体重比及观察肝脏的颜色和质地，并拍照；
3.组织病理学检测
取部分肝叶经10%中性甲醛溶液固定Mh，石蜡包埋，切片后经HE染色，显微镜下观察细胞的变化；
4.GST-Pi蛋白表达含量检测
将冻存于_80°C冰箱的肝组织取0. 5g于5ml PBS缓冲液中并加入IOOmM的酶抑制剂PMSF后进行超声裂解，超声一次时间为2S，停6S，共Hmin。超声结束后4°C条件下 12000rpm/min离心10分钟，取上清，用^festern Blot法检测GST-Pi的表达含量。由附图1可见模型组的大鼠肝重体重比随藻毒素MC-LR处理时间的延长呈明显递增趋势，其中，(DEN+MC-LR)处理组较DEN处理组肝重体重比增长较快，说明藻毒素lOPg/kg MC-LR具有明显的促进肝细胞增生的作用。由图2可见模型组在诱癌至1个月时，肝脏未见明显异常，但无血色；诱癌至2个月时，肝脏质地由软变硬，表面逐渐粗糙；至3个月时，肝脏质地较硬，出现肝硬化现象，并呈现出数量不等、大小不一的灰白色圆形病灶；至4个月时，肝脏表面粗糙，多个大小不一的灰白色癌结节，可见出血和坏死，解剖时腹水现象严重。HE病理形态学观察结果
由图3可见大鼠肝脏病理学改变大致分为三期(1)诱癌至1个月时为肝细胞损伤期， 细胞排列比较紊乱，胞浆疏松，炎症细胞散在性分布于小叶中。(2)诱癌2个月至3个月时为肝细胞增生-硬化期，其中在2个月末肝细胞开始变性水肿，体积明显变大，小叶内可见炎症细胞侵润严重；3个月末时肝组织肝硬化小胆管增生现象严重，由纤维组织包绕形成假小叶结构并出现癌细胞增生现象。(3)至4个月为肝细胞癌变期，细胞核明显增大，胞核比例增大，核分裂相增多，尚可见多核和巨核细胞。由图4不同时期GST-Pi蛋白表达含量检测结果图可以看到正常组织几乎不表达GST-Pi, DEN联合藻毒素MC-LR (lOPg/kg)处理组在1个月时GST-Pi开始表达，但表达量很少，约为正常组的1. 5倍；这与形态学和病理学上检测为肝细胞损伤期结果一致。在2个月时，GST-Pi表达增强，表达量约为正常组的3倍；这与形态学和病理学检测为肝细胞增生期的结果一致。在3个月时GST-Pi表达明显增强，表达量约为正常组的4倍；这与形态学和病理学检测为肝硬化期结果一致。4个月时GST-Pi表达量与正常组相比最高，这与形态学和病理学检测为肝细胞癌变期结果一致。本发明的有益效果
1.成功建立藻毒素MC-LR促二乙基亚硝胺(DEN)诱发的大鼠肝癌模型；
2.大鼠肝脏外观及病理学切片清晰地观察到大鼠肝脏癌变的一系列过程，即肝细胞损伤期(1个月)，肝细胞增生-硬化期(2-3个月)和肝细胞癌变期(4个月)的组织水平及细胞水平的变化过程。3. GST-Pi蛋白检测结果显示，模型组中的肝癌发生的各个时期，GST-Pi的表达水平随时间延长呈明显递增趋势。本成果是利用微囊藻毒素MC-LR作为一种促癌剂，真正意义上快速诱发原发性肝癌模型。本项技术不仅可以用来研究原发性肝癌发生发展的机制，同时也适用于肿瘤形成过程中各种指标检测、肝癌诊断、治疗和药物的开发。因此，无论是对于人类健康，还是在经济、社会效益方面都具有良好的推广应用前景。
图1为模型组大鼠在不同时间段肝重体重比值变化图； 图2为模型组不同时间段大鼠肝脏表观图3模型组肝脏细胞不同时期的组织切片图； 图4模型组肝脏组织不同时期GST-Pi蛋白表达含量变化图。
具体实施例方式1.选用雄性体重为150士5g左右的SD大鼠15只，并给予1周的适应时间，在大鼠饲养期间定期用0.01%的笨扎溴铵溶液擦拭浸泡消毒鼠笼，并及时更换垫料。饲养温度控制在25 °C左右，并给予充分的食物。2.将DEN溶液稀释成浓度为0. 25%的DEN溶液。3.用甲醇溶解藻毒素纯品粉末，避光条件下震荡5min，配制成lmg/ml的藻毒素母液。4.将0. 25%的DEN溶液和藻毒素溶液注射到大鼠腹腔内，使DEN终浓度为IOmg/ kg,藻毒素终浓度为lOPg/kg。5.上述过程每5天进行一次，共处理4个月。6.模型建立过程中始终观察大鼠的食欲，饮水，皮毛，精神等情况。7.解剖大鼠，取肝脏，称量体重、肝重和拍照等一系列形态学的观察。8.取部分肝叶经10%中性甲醛固定Mh，石蜡包埋，切片后经HE染色，显微镜下观察细胞的变化。9.将冻存于_80°C冰箱的肝组织取0. 5g于5ml PBS缓冲液中并加入IOOmM的酶抑制剂PMSF后进行超声裂解，超声一次时间为2S，停6S，共Hmin。超声结束后4°C条件下12000rpm/min离心10分钟，取上清进行电泳，利用GST-Pi的抗体检测GST-Pi的表达含量。
权利要求
1.一种微囊藻毒素MC-LR促二乙基亚硝胺DEN诱发大鼠肝癌模型建立的方法，其特征在于，包括以下步骤(1)DEN联合微囊藻毒素MC-LR建立大鼠肝癌模型；(2)形态学检测；(3)病理学检测；(4)GST-Pi蛋白表达含量检测。
2.根据权利要求1所述的一种微囊藻毒素MC-LR促二乙基亚硝胺(DEN)诱发大鼠肝癌模型的建立方法，其特征在于所述步骤(1)更为具体的步骤为A、选取体重为150士5gSD雄性大鼠15只，给予一周的适应时间，在大鼠饲养期间定期用0.01%的笨扎溴铵溶液擦拭浸泡消毒鼠笼，及时更换垫料，饲养温度控制在25°C左右， 并给予充分的食物和水源；B、配制0.25%的DEN溶液和lmg/ml的藻毒素MC-LR甲醇溶液；C、模型组为腹腔注射0.25% DEN溶液和lmg/ml的藻毒素MC-LR甲醇溶液，使DEN终浓度为10mg/kg，藻毒素终浓度为10 μ g/kg ；D、以上实验每五天给药一次，共处理4个月；E、在不同时期，注意观察大鼠食欲，饮水，皮毛，精神等情况。
3.根据权利要求1所述的一种微囊藻毒素MC-LR促二乙基亚硝胺(DEN)诱发大鼠肝癌模型的建立方法，其特征在于所述步骤( 更为具体的步骤为在每个月末以颈椎脱臼法处死大鼠，打开腹腔，完整地取出肝脏后用PBS缓冲液清洗，记录体重，肝重并计算肝重与体重之比，同时观察肝脏的颜色和质地，并拍照。
4.根据权利要求1所述的一种微囊藻毒素MC-LR促二乙基亚硝胺(DEN)诱发大鼠肝癌模型的建立方法，其特征在于所述步骤(3)的病理学检测的具体操作方法为取部分肝叶经用10%中性甲醛溶液固定Mh，石蜡包埋，切片后经HE染色，用光镜观察细胞的变化。
5.根据权利要求1所述的一种微囊藻毒素MC-LR促二乙基亚硝胺(DEN)诱发大鼠肝癌模型的建立方法，其特征在于步骤(4)所述的蛋白质含量测定的具体操作是将冻存于_80°C冰箱肝组织取出后进行超声裂解，4°C条件下12000rpm/min离心10分钟后，取上清液进行蛋白质免疫印迹，检测GST-Pi的表达含量。
全文摘要
本发明是用二乙基亚硝胺DEN联合藻毒素MC-LR通过腹腔注射到大鼠体内诱发大鼠肝癌模型。从肝重体重比、肝脏外观、肝组织病理学切片、GST-Pi蛋白表达水平等指标清楚地展示了大鼠肝癌发生过程中的肝细胞损伤期，肝细胞增生-肝硬化期和肝细胞癌变期过程，并且发现DEN联合藻毒素MC-LR比DEN单独诱发的肝癌模型在同一时间效果更显著，成瘤时间更短，是一种研究人体肝癌发生的理想模型。该模型的特点是清楚地展示了肝癌发生的各个阶段，有利于对肝癌发生过程机制的研究、癌前病变的检测以及治疗药物的开发。
文档编号A61K38/12GK102524180SQ201110402408
公开日2012年7月4日 申请日期2011年12月7日 优先权日2011年12月7日
发明者孙韩艳, 徐昌志, 汪宇, 沈敬良, 黄蓓 申请人:安徽大学