专利名称：一种人类多肽在制备免疫调节剂中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及人类多肽，具体是一种人类多肽在制备免疫调节剂中的应用。
背景技术：
免疫系统由免疫器官(如胸腺、脾脏)、免疫组织(皮肤、粘膜组织)、免疫细胞(如T、 B淋巴细胞)、免疫因子(如白介素IL、干扰素IFN、肿瘤坏死因子TNF-a、TGF_b)等组成，维持着机体对感染性抗原的反应和自身耐受的平衡。在正常情况下，机体通过免疫调控机制和适度的免疫应答，识别自体抗原与异体抗原，防止病原微生物的入侵，监视并清除机体内癌变的细胞，并保持内环境的稳定。Bakaguchi，2005; Sakaguchi et al，2008]
调节性T细胞(Regulatory T cell，Treg)是体内一种具有独特调节作用的特异性T 细胞亚群，该类T细胞在维持和调节免疫平衡状态中起着重要作用。天然的Treg起源于胸腺，表达CD4+⑶25 ；获得性Treg可在外周由⑶4+⑶25- T细胞诱导产生，其分子表面表达特异性的转录抑制因子R)xp3，又可表达⑶4、⑶25、⑶152等膜分子，主要功能具有免疫抑制性(suppressive)和免疫无能性(anergic)。[Sakaguchi, 2000，2003，2005 ； Sakaguchi and Powrie, 2007；Sakaguchi et al.，2008]
FoxP3是控制Treg发生发展的最主要转录因子，在⑶4+⑶25+调节性T细胞的形成和功能方面起中枢作用。体内胸腺和外周CD4+CD25+调节性T细胞富含 ^0ΧΡ3 ；人为破坏小鼠 ^ΧΡ3基因导致小鼠出现致死性炎症性疾病；患有R)xP3基因突变的病人临床表现(如胸腺萎缩、脾脏肿大、淋巴结生发滤泡增生、新生儿糖尿病、甲状腺功能低下、胃肠炎、贫血、血小板减少等)与CD4+CD25+调节性T细胞缺陷小鼠出现的诸多免疫疾病相似。 FoxP3是Treg的最重要的功能标志，检测R)xP3表达可作为判定Treg数量和功能的方法。[Sakaguchi, 2003 ； Ko et al. , 2005 ； Setoguchi et al. , 2005 ； Sakaguchi et al., 2006；Nomura and Sakaguchi, 2007；Ono et al. , 2007；Onishi et al., 2008；Sakaguchi et al.，2010]
Treg细胞在维持自身免疫稳定、预防自身免疫性疾病以及控制移植排斥反应等免疫调节方面发挥非常重要的保护作用。在自身免疫性疾病、过敏性疾病、器官移植术后免疫排斥反应、移植物抗宿主反应(GVHR)等免疫病理过程中，Treg细胞数量较健康人明显减少，并且缺乏正常免疫调节活性。将⑶4+⑶25+ Treg细胞缺陷小鼠的T细胞转移至裸鼠中会导致许多自身免疫病，而预先输入Treg细胞可预防这类疾病的发生；将正常小鼠脾脏的Treg 细胞去除后转移给同基因型T细胞缺陷小鼠，将导致各种器官特异性自身免疫病(包括I 型糖尿病、甲状腺炎和胃炎)和系统性消耗疾病，而注射CD4+CD25+Treg细胞群可以抑制这些自身免疫病的发生，从而证明了 Treg细胞具备免疫调节能力，可以预防自身免疫病的胃；[Sakaguchi et al. , 1985；Sakaguchi and Sakaguchi, 1988；Sakaguchi et al., 1995；Sakaguchi, 2005；Setoguchi et al.，2005]
研究显示，通过诱导Treg细胞介导的免疫抑制和免疫适应，可以有效地改善自身免疫性疾病(如NOD小鼠I型糖尿病)、过敏性疾病(如哮喘)、移植免疫排斥反应、GVHR等免疫病理。[Singer et al. , 1993；Sgouroudis and Piccirillo, 2009；Fan et al. , 2010；Gaidot et al.，2011;Leslie, 2011]
胰岛淀粉样多肽(Islet amyloid polypetitide)又称胰淀素(Amylin)，于1987年由瑞典病理学家Westermark P和新西兰学者Cooper GJ分别从人胰岛素瘤和II型糖尿胰腺组织中发现。[Cooper et al. , 1987；Westermark et al. , 1987]人 IAPP (Human IAPP, hIAPP)由37个氨基酸组成，分子中第二和第七位半胱氨酸残基之间形成二硫键，羟基末端酰胺化，中间第20 - 29位氨基酸组成具有种属差异性，与致淀粉样变能力密切相关。电镜和免疫组化染色显示，hIAPP与胰岛素(insulin)共存于成人胰岛b细胞内。正常人胰腺组织中含有与胰岛素相当数量的hIAPP阳性细胞，血液中hIAPP含量也与血胰岛素水平密切相关。I型糖尿病病人胰腺组织内和血液里几乎检测不到hIAPP ；胰岛素抵抗和高胰岛素血症的患者，hIAPP的含量也高；晚期II型糖尿病病人胰腺组织内和血液里的hIAPP 水平也常常下降。hIAPP是胰岛淀粉样变的主要组分，胰岛淀粉样变又是人类II型糖尿病的病理特征。加之hIAPP调节糖代谢和胰岛素、胰高血糖素(glucagon)等相关激素分泌的作用，因此自hIAPP发现以来，hIAPP与糖尿病的关系就一直为人关注。自1999年至2010 年，我们收集了香港中文大学医学院、北京协和医院和解放军总医院病理科436例2型糖尿病的人体解剖组织样本以及相应临床资料，详细观察了胰腺组织改变，系统研究了胰岛淀粉样变的临床病理学特征，结果显示hIAPP有可能具有重要内分泌调节作用。Bhao et al. , 2003;Zhao et al. , 2008;Zhao et al. , 2009a;Zhao et al. , 2009b;Zhao et al.,2010] 在体内外研究hIAPP的生物学功能和药理疗效过程中，我们发现hIAPP不仅对体内糖稳态 (glucose homeostasis)起调节作用，而且可以诱导Treg细胞形成，调节炎症反应和免疫因子分泌。目前罕有利用人类多肽来诱导Treg细胞介导免疫抑制，从而改善自身免疫性疾病、过敏性疾病、组织器官移植术后免疫排斥反应和GVHR。国内外目前还未见有关hIAPP能诱导Treg细胞并具免疫抑制作用的报道。
发明内容
本发明的目的是将人类多肽(hIAPP)应用于制备免疫调节剂，供自身免疫疾病、组织器官移植、GVHR或炎症疾病使用。本发明的技术方案如下一种人类多肽的新用途，它是用于诱导人外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cell，PBMC)转化为 CD4+CD25+Foxp3+调节性 T 细胞，干预自身免疫性疾病，即是将人类多肽制成增强CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞抑制效应的注射剂或口服剂，以干预自身免疫性疾病，其使用浓度为1 lOOOOnmol/L新鲜的 hIAPP溶液/日，一次性使用。本发明所述的人类多肽，其氨基酸序列为KCNTATCATQRLANFLVHSSNNFGAILSSTNVG SNTY，它能诱导⑶4+⑶25+Foxp3+调节性T细胞，可应用于防治自身免疫性I型糖尿病。经实验表明，上述的人类多肽体外预处理人外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cell，PBMC)，显著增加了 CD4+CD25+Foxp3+调节性 T 细胞的构成比，能诱导⑶4+⑶25+Foxp3+调节性T细胞，具有增强⑶4+⑶25+Foxp3+调节性T细胞抑制效应的作用，可以制成作为增强CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞抑制效应的免疫调节剂，以干预自身免疫性疾病。经hIAPP干预NOD小鼠自身免疫性糖尿病实验表明，hIAPP成功诱导NOD小鼠脾脏淋巴细胞转化为⑶4+⑶25+Foxp3+调节性T细胞，可以有效防治自身免疫性糖尿病。本发明所述的人类多肽为全长肽hIAPPij，由美国康乃狄格州纽黑文市耶鲁大学 fl(Keck Biotechnology Center, Yale University, New Haven, CT) 供。使用时需配制成新鲜的hIAPP溶液。所述hIAPP溶液的配制，包括如下步骤
1. 1 人胰淀粉样素(islet amyloid polypeptide, hIAPP/Amylin)的氨基酸序列
KCNTATCATQRLANFLVHSSNNFGAILSSTNVGSNTY
1.2 hIAPP合成与纯化
全长肽hIAPP^由位于美国耶鲁大学凯克生物技术中心(Keck Biotechnology Center, Yale University, New Haven, CT)提供，该中心应用 t_boc 化学合成 hIAPP，应用反相高压液相层析纯化，纯度超过99. 95%。1.3 hIAPP 溶液配制
用1 1的三氟乙酸(TFA)和六氟异丙醇(HFIP)混合溶液预先处理冻干肽hIAPP。将溶解的hIAPP转移到一个新试管中，经过温和的氮气流动5 10分钟，使TFA/HFIP蒸发消失。冻干肽溶解在0.5%的醋酸溶液中制备成50 mmol/L的储备溶液。在使用之前，用培养基稀释储备溶液，制备新鲜的hIAPP溶液。本发明的积极意义是首次发现了氨基酸序列为KCNTATCATQRLANFLVHSSNNF GAILSSTNVGSNTY的人类多肽，于体外预处理人外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cell, PBMC)后，显著增加了人⑶4+⑶25+Foxp3+调节性T细胞的数量；体内免疫自发性自身免疫性糖尿病NOD小鼠后，显著增加小鼠脾CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞的数量，降低自身免疫性糖尿病的发生率；可有效改善免疫病理反应，防治自身免疫性疾病，且无副作用，在自身免疫病、组织器官移植以及炎症病理等方面，具有广阔的应用前景。
具体实施例方式以下通过实施例说明本发明。实施例1:制备hIAPP
(1)人胰淀粉样素(isletamyloid polyp印tide，hIAPP/Amylin)的氨基酸序列 KCNTATCATQRLANFLVHSSNNFGAILSSTNVGSNTY
(2)hIAPP合成与纯化
全长肽hIAPP^由位于美国耶鲁大学凯克生物技术中心(Keck Biotechnology Center, Yale University, New Haven, CT)提供，该中心应用 t_boc 化学合成 hIAPP，应用反相高压液相层析纯化，纯度超过99. 95%。(3)hIAPP 溶液配制
用1 1的三氟乙酸(TFA)和六氟异丙醇(HFIP)混合溶液预先处理冻干肽hIAPP。将溶解的hIAPP转移到一个新试管中，经过温和的氮气流动5 10分钟，使HFIP/TFA蒸发消失。冻干肽溶解在0.5%的醋酸溶液中制备成50 mmol/L的储备溶液。在使用之前，用培养基稀释储备溶液，制备新鲜的hIAPP溶液。
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实施例2 :hIAPP对小鼠脾细胞和人外周血单个核细胞的影响 2.1 小鼠脾脏原代细胞培养
清洁级5 6月龄C57BL/6小鼠6只由校动物实验中心提供，麻醉处死小鼠，在无菌条件下取出脾脏，研磨制备成新鲜的单细胞悬液，然后用铵酸溶血缓冲液(BD公司试剂盒) 处理脾细胞，去除红细胞后，洗涤3次，调整细胞浓度为5 X IO4细胞/毫升。原代脾细胞培养使用美国hvitrogen Gibco公司的RPMI培养基1640。在96孔板上的脾细胞(100ml) 中，分别加入1，5，10，50，100，500，1000或10000 nmol/L hIAPP新鲜配制溶液，对照组不加 hIAPP，在(X)2培养箱分别培养M，48，或72小时。最后使用奥林帕斯相差显微镜CKX41-32PH 观察细胞的密度、形态、生长情况。实验结果显示浓度为1 10000 nmol/L的hIAPP溶液，作用M 72小时后，脾细胞形态规则，比较亮，未见明显损伤、死亡或者细胞碎片。培养48小时后细胞铺满度超过 80%。与对照组相比，未见明显不同。2.2 外周血单个核细胞原代培养
从健康献血者采取外周血300毫升，经乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝，使用密度梯度法，分离外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)。经红细胞裂解和3 次洗涤后，PBMC计数达5' IO6细胞/毫升。在96孔板上的PBMC (100ml)中，分别加入1， 5，10，50，100，500，1000 或 10000 nmol/L hIAPP 新鲜配制溶液，对照组不加 hIAPP,在 CO2 培养箱分别培养对，48，或72小时。然后用PHA (lPg/ml)和LPS (2Pg/ml)刺激淋巴细胞计数。最后使用奥林帕斯相差显微镜CKX41-32PH观察细胞的密度、形态、生长情况。实验结果显示浓度为1 10000 nmol/L的hIAPP溶液，作用M 72小时后，人 PBMC形态规则，比较亮，未见明显损伤、死亡或者细胞碎片。培养对小时后细胞铺满度超过 70%。与对照组相比，未见明显不同。2. 3 上述2. 1和2. 2实验证实使用浓度范围为1 10000 nmol/L的hIAPP溶液，作用M 72小时后，小鼠脾细胞和人PBMC生长未见毒性。 实施例3 :hIAPP诱导人PBMC转化为⑶4+⑶25+Foxp3+调节性T细胞 3. 1 分离人PBMC
从3位健康献血者采取分别采取外周血300毫升(共900毫升)，经乙二胺四乙酸 (EDTA)抗凝，使用密度梯度法，分离PBMC。经红细胞裂解和3次洗涤后，PBMC计数达5' IO6 细胞/毫升；
3. 2 hIAPP 诱导 PBMC
在37°C条件下，应用hIAPP溶液(10 nmol/L)孵育M小时，对照组除了不加hiAPP外， 其余相同；
3. 3 流式细胞仪检测⑶4+⑶25+Foxp3+调节性T细胞
经处理后的人PBMC，在37°C条件下用T细胞表面抗体⑶4和⑶25反应30分钟，然后用PBS缓冲液冲洗。接着，按50:1加入BD Foxp3缓冲液，固定10分钟。固定后的PBMC用 BD Perm缓冲液增加细胞膜通透性30分钟，再洗涤2次。在37°C条件下用细胞内染色剂 Foxp3染色30分钟。最后，洗涤3次，并将染色后的PBMC重新悬浮在1 FBS缓冲液中，进行流式细胞仪(Becton Dickinson FACScan)检测。小鼠免疫球蛋白G同型抗体用作背景信号参照，结果根据⑶4+⑶25+Foxp3+调节性T细胞在⑶4阳性T细胞中的所占百分率来计算。 3. 4实验结果如表1所示
表1.人胰淀粉样素(hIAPP)诱导人PBMC转化为⑶4+⑶25+Foxp3+调节性T细胞
权利要求
1.一种人类多肽在制备免疫调节剂中的应用，其特征是它是将氨基酸序列为KCNTAT CATQRLANFLVHSSNNFGAILSSTNVGSNTY 的人类多肽制成作为诱导 CD4+CD25+Foxp3+ 调节性 T 细胞的免疫调节剂。
2.一种人类多肽在制备防治自身免疫性糖尿病药物中的应用，其特征是它是将氨基酸序列为KCNTATCATQRLANFLVHSSNNFGAILSSTNVGSNTY的人类多肽制成防治自身免疫性糖尿病药物。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征是将人类多肽制成浓度为1 lOOOOnmol/ L的注射剂或口服剂剂型。
全文摘要
本发明公开了一种人类多肽在制备免疫调节剂中的应用，它是将氨基酸序列为KCNTATCATQRLANFLVHSSNNFGAILSSTNVGSNTY的人类多肽制成作为诱导CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞的免疫调节剂。该多肽体外预处理人外周血单个核细胞(Peripheralbloodmononuclearcell，PBMC)后，显著增加了人CD4+CD25+Foxp3+调节性Ｔ细胞的数量；体内免疫NOD小鼠，可以有效防治自身免疫性糖尿病，改善免疫病理反应，防治自身免疫性疾病，在自身免疫病、组织器官移植以及炎症病理等方面，具有广阔的应用前景。
文档编号A61P37/06GK102441159SQ20111040368
公开日2012年5月9日 申请日期2011年12月8日 优先权日2011年12月8日
发明者张均智, 牟学晶, 赵海潞 申请人:赵海潞