专利名称：新颖乳酸菌株及其调节免疫反应的用途的制作方法
技术领域：
本发明是关于新颖乳酸菌株及其用于调节免疫反应的用途。
背景技术：
免疫系统是身体用来抵抗外来微生物或毒素的防御系统。在免疫系统中，T细胞受刺激后可能分化成第I型辅助T细胞(Thl)、第2型辅助T细胞(Th2)、以及调控型T细胞(Treg)。其中，Thl细胞主导细胞调节的免疫反应，可分泌干扰素-Y (IFN_y)，以及促进树突细胞和巨噬细胞分泌细胞激素-12 (IL-12)与细胞毒杀T淋巴细胞的增生，有助于对抗病毒感染及癌细胞。Th2细胞则主导体液免疫反应，可分泌细胞激素-4 (IL-4)、细胞激素-5(IL-5)及细胞激素-13 (IL-13)，促使B细胞增生及刺激免疫球蛋白E(IgE)的产生，可对抗游离的病菌；但过度的Th2反应可能导致发炎及过敏反应，例如，气喘、过敏性鼻炎、湿疹、荨麻疹、及胃肠疾病等。另，调控型T细胞是负责调节Thl及Th2细胞的平衡，可透过分泌TGF-P或IL-10来执行此调节能力。已有报导指出调控型T细胞可抑制自体免疫与过敏或气喘反应，目前认为可用于过敏疾病的预防与治疗。许多研究显示乳酸菌(Lactobacillus sp.)具免疫调节功效,可抑制发炎或缓和异位性皮肤炎、过敏性鼻炎或气喘等过敏疾病，其作用机制包括调节细胞激素的分泌、 控制Thl与Th2反应的平衡及影响抗体的产生等。然而，乳酸菌功效具有菌株特异性 (strain-specific effects),根据菌株种类的不同而有不同表现,且自然界尚有许多乳酸菌株尚未被发现或予以充分地研究。
发明内容
本发明是从台湾健康幼儿粪便检体分离出新颖乳酸菌株MP137及MP108，其与现有已知的菌株不同。本发明的新颖乳酸菌株具有免疫调节功效，特别是使个体的免疫反应趋向于Thl免疫反应，抑制Th2免疫反应，有助于对抗病菌感染及降低过敏反应。因此，在一方面，本发明提供一种经分离的乳酸菌株，其中该乳酸菌株具有选自以下所组成的群的菌株的特性MP137菌株，寄存于中华民国财团法人食品工业发展研究所， 寄存编号为BCRC910484 ；以及MP108菌株，寄存于中华民国财团法人食品工业发展研究所， 寄存编号为BCRC910483。特定而言，本发明提供新颖的乳酸菌株MP137及MP108。在另一方面，本发明提供一种包含前述乳酸菌株的组合物。该组合物可为药物或食品，可用于调节个体的免疫反应，特别是促使个体的免疫反应趋向于Thl免疫反应，避免 Th2免疫反应,更特别是降低个体的过敏反应。本发明的组合物具治疗气喘或过敏性鼻炎或对抗肠道致病菌感染的功效。在又一方面，本发明亦提供一种此处所描述的乳酸菌株的用于制备用于调节个体的免疫反应、治疗气喘或过敏性鼻炎或对抗肠道致病菌感染的药物或食品的用途。本发明亦包括一种于所需个体调节免疫反应、提升肠道免疫力、抑制免疫反应、治疗气喘或过敏性鼻炎、或对抗肠道致病菌感染的方法，其包括将有效量的所述乳酸菌株投与至该个体中。本发明的各个具体实施例的细节说明如后。本发明的其他特征将会经由以下各个具体实施例中的详细说明及申请专利范围而清楚呈现。无须进一步的阐述，皆相信本发明所属技术领域技术人员基于前述说明即可利用本发明至最广的程度。因此，可以理解以下的说明仅仅是作为例示说明的用，而非以任何方式限制其余的揭露内容。
为说明本发明的目的，图式中显示的具体实施例是目前最佳的。然而，应理解的是本发明不限于所示的具体实施例。图I系本发明分离株MP137在显微镜下观察到的型态。图2系本发明分离株MP108在显微镜下观察到的型态。图3显示实施例3. 2的小鼠试验流程。图4A和图4B显示经本发明的MP108菌株及MP137处理的小鼠呼吸道阻力变化测
定的结果。图5显示小鼠的肺冲洗液中发炎细胞种类分析结果，Mon表示单核细胞、Eos表示是酸性白血球、Neu表示是中性白血球以及Lym表示淋巴球细胞。图6A和图6B显示实施例4的排除实验结果，其中图4A针对沙门氏菌的实验结果， 以及图4B是针对大肠杆菌的实验结果。图7A和图7B显示实施例4的置换实验结果，其中图7A针对沙门氏菌的实验结果， 以及图7B是针对大肠杆菌的实验结果。
具体实施例方式除非另有说明，否则此处使用的全部技术和科学名词与本发明所属技术领域技术人员通常所了解的意义相同。此处所使用的冠词“一”是指该冠词的一或一个以上(即，至少一个)的文法受词。本发明提供新颖乳酸菌株MP137及MP108，其具免疫调节功效。MP137菌株于2010 年11月19日寄存于德国微生物保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, DSMZ, Inhoffenstra ^ e 7B, 38124 布伦瑞克市,德国)，寄存编号为DSM24230。MP108菌株于2010年11月19日寄存于德国微生物保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH，DSMZ，Inhoffenstra^ e 7B， 38124布伦瑞克市，德国)，寄存编号为DSM24229。本发明的乳酸菌株MP137及MP108系由台湾健康幼儿粪便来源经分离取得。经初步试验，此等菌株为革兰氏阳性杆菌(图I及2)，且不具触酶、氧化酶活性及运动性，不产生内生孢子，于好氧及厌氧环境下皆会生长，再进一步进行16S rDNA序列分析及API 50CHL系统鉴定，结果如SEQ ID NO :3及SEQ ID NO :4以及表I及表2 (实施例2)所示。 综合鉴定结果，MP137确认为一种新颖的酪乳杆菌副干酪亚种(Lactobacillus paracasei subsp. paracasei)菌株，而MP108确认为一种新颖的鼠李糖乳酸杆菌(Lactobacillus rhamnosus)菌株。
本发明的MP137及MP108菌株可以任何方式存在，包括活菌或死菌形式，亦包括具相同特征的等同菌株及由该等菌株衍生所得的菌体或产物。本文所使用的“免疫调节” 一词，当用于形容一物质时，是指该物质具有改变或调整至少一种免疫系统的功能的能力，包括但不限于，改变或调整免疫系统的成员细胞或作用分子(例如，细胞激素及抗体)的数量(或含量)及/或活性。相关领域已发展各种测试方法,评估一种物质的免疫调节功能。本文所使用的“治疗”一词包括为了治愈、愈合、减轻、舒缓、改变、矫正、改善、改进或影响该疾病、该疾病的症状、该疾病引起的残疾或罹患该疾病的倾向的目的，而将包含一或多种活性剂的组合物施用或投与至患有该疾病、该疾病的症状或有罹患该疾病的倾向的个体，或对该等个体进行其他处理。例如，根据本发明，治疗气喘或过敏性鼻炎包括施予需要的个体一活性成分，以达到降低或减缓气喘或过敏性鼻炎的症状，例如，降低呼吸道收缩现象、减少肺部发炎及改善鼻部症状(如流鼻水、鼻塞、鼻子痒、打喷嚏等)或非鼻部症状 (如眼睛或耳朵痒、喉咙痒、眼睛红、流眼泪等)。本发明的乳酸菌株具免疫调节功效。在一具体实施例中，本发明的乳酸菌株可调节细胞激素的产生，例如，提升个体的IL-12、IL-10或IFN-Y的产生，以及抑制个体的 IL-4、IL-5或IL-13的产生。在另一具体实施例中，本发明的乳酸菌株可调节个体的免疫球蛋白的产生，例如，提升个体的IgG2a及抑制IgE的产生。本领域具通常知识者可了解细胞激素IL-12及IFN-Y与免疫球蛋白IgG2a的产生代表Thl免疫反应；细胞激素IL_4、IL_5 及IL-13与免疫球蛋白IgE的产生代表Th2免疫反应；以及细胞激素IL-10的产生代表调节型T细胞的活化，其负责调节Thl及Th2反应的平衡，可用于过敏疾病的预防与治疗。因此，本发明的乳酸菌株可促使个体的免疫反应趋向于Thl免疫反应，抑制Th2免疫反应，有助于对抗病菌感染及降低过敏反应。又在本发明的特定实施例中，本发明的乳酸菌株可提升个体的IgA的产生。本领域具通常知识者已知IgA在肠道免疫系统扮演重要角色，其会被分泌至肠道黏膜外，与抗原形成免疫复合体(immune complex),以此种方式防止细菌侵入。因此，本发明的乳酸菌株可提升个体肠道免疫力。在又一具体实施例中，本发明的乳酸菌株可对抗肠道致病菌的感染，包括但不限于沙门氏菌及大肠杆菌。在特定实施例中，本发明的乳酸菌株可抑制或取代肠道致病菌吸附于肠道上，因此，具有预防或治疗肠道致病菌感染的功效。此外，在另一具体实施例中，本发明的乳酸菌株可降低呼吸道阻力的产生及/或降低肺部发炎。因此，本发明的乳酸菌株尚可用于治疗气喘。气喘是一种呼吸道发炎疾病， 支气管因发炎细胞及黏液增加，且管壁水肿，因此，造成呼吸道阻力增加，病患呼吸困难、胸闷，严重时造成猝死。本领域已发展出标准动物模式测试呼吸道阻力，可参见以下实施例。再者，本领域技术人员已知，过敏性鼻炎呈现Th2细胞增多的趋势，而且，近年来 Thl/Th2免疫调节剂已为预防与治疗过敏性鼻炎的重点研究之一。根据本发明，此处所描述的乳酸菌株尚可用于对抗过敏性鼻炎。在一具体实施例中，本发明的乳酸菌株可与其他抗过敏药物并用。此处所述抗过敏药物可为此领域已知可用于治疗过敏的药物，特别是治疗过敏性鼻炎药物，包括但不限于抗组织胺、去充血剂及抗发炎药物(如，白三烯素拮抗剂、类固醇、肥大细胞稳定剂、色甘酸钠、酮替芬等)。在一特定实施例中，本发明的乳酸菌株与抗组织胺并用。本发明的乳酸菌株可视需要与抗过敏药物同时使用或依序先后使用。在另一方面，本发明亦提供一种包含前述乳酸菌株的组合物。在一实施例中，本发明的组合物包括MP137菌株。在另一实施例中，本发明的组合物包括MP108。特定而言，本发明的组合物可用于调节个体的免疫反应。在一具体实施例中，本发明的组合物可调节细胞激素的产生，例如，提升个体的IL-12、IL-10或IFN-Y的产生，以及抑制个体的IL-4、IL-5或IL-13的产生。在另一具体实施例中，本发明的组合物可调节个体的免疫球蛋白的产生，例如，提升个体的IgG2a及抑制IgE的产生。因此，本发明的组合物可促使个体的免疫反应趋向于Thl免疫反应，抑制Th2免疫反应，有助于对抗病菌感染及降低过敏反应。另，本发明的组合物尚可抑制个体呼吸道阻力的产生及/或降低肺部发炎，可用以治疗气喘。本发明的组合物也可用以治疗过敏性鼻炎。在又一具体实施例中，本发明的组合物可提升个体的IgA的产生，具提升个体肠道免疫力的功效。本发明的组合物还可用于对抗肠道致病菌的感染，包括但不限于沙门氏菌及大肠杆菌。典型地，本发明的组合物包含有效量的乳酸菌株，以达此处所述功效。该有效量可视各种因素而变动，例如，投用途径、个体的体重及种类，以及投予目的。技术人员可根据此处的揭示及此现有技术已建立的方法依经验决定个案的剂量。较佳地，本发明的组合物含有IO8Cfu以上的乳酸菌株。在一具体实施例中，本发明的组合物含有IO9-IO12Cfu的乳酸菌株；特定而言，本发明的组合物含有2. 5xl09-5xl0ncfu的乳酸菌株；更特定而言，本发明的组合物含有5xl09cfu的乳酸菌株(cfu代表菌落形成单位(colony-forming unit))。为有利于达到所述功效及/或传输目的，本发明的组合物可进一步与生理上可接受的载剂调配成所需形式。此处“生理上可接受的载剂”系指该载剂与本发明组合物内所含有效成分兼容，其较佳为能稳定该活性成分并且对欲投予的个体或欲施用的环境无害。本发明的组合物可利用各种已知的常规方法与适当载剂调配成所需形式。生理上可接受的载剂的实施例包括但不限于赋形剂或稀释剂，例如，羧甲基纤维素钠、山梨糖醇、滑石、葡聚糖、乳糖、蔗糖、甘露醇及其类似物；黏结剂，例如，阿拉伯胶、海藻酸钠、乙基纤维素、洋菜、明胶、淀粉、羟基纤维素、羟丙基纤维素及其类似物；润滑剂，包括硬脂酸、硬脂酸钙、硬脂酸镁、滑石、氢化油、蜡及其类似物；湿润剂；乳化和悬浮剂等。本发明组合物的形式可为锭剂、丸剂、粉末、糖锭、片剂、悬浮液、乳剂、溶剂、糖浆及软和硬明胶胶囊。在一特定实施例中，本发明的组合物系粉末形式。在另一特定实施例中，本发明的组合物系胶囊形式。此外，本发明组合物较佳以口服方式投予。本发明的组合物可被制成药物或食品，例如，优格、奶酪及乳酸菌粉等。本发明的组合物亦可包括其他添加物，包括但不限于，抗氧化剂，例如，生育醇、二丁基羟基甲苯、 丁基羟基甲氧苯、抗坏血酸；甜味剂，例如，甜菊糖、代糖、糖精；着色剂，例如，甜菜红、桅子蓝、姜黄素；以及防腐剂，例如，钠苯酸盐、亚硫酸盐、苯甲酸、己二稀酸等。在一具体实施例中，本发明的组合物进一步包括一或多种其他抗过敏药物，包括但不限于抗组织胺、去充血剂及抗发炎药物(如，白三烯素拮抗剂、类固醇、肥大细胞稳定剂、色甘酸钠、酮替芬等)。本发明亦提供一种套组，其包括一或多个第一剂量单位，其包括有效量的本发明的乳酸菌株，以及一或多个第二剂量单位，其包括有效量的其他抗过敏药物。特定而言，其中的乳酸菌株可与抗过敏药物同时使用或依序先后使用。本发明亦包括一种于所需个体调节免疫反应、提升肠道免疫力、抑制免疫反应、治疗气喘或过敏性鼻炎、或对抗肠道致病菌感染的方法，其包括将有效量的所述乳酸菌株投与至该个体中。在一实施例中，所述乳酸菌株是MP137菌株。在另一实施例中，所述乳酸菌株是MP108。较佳地，所述乳酸菌株系以口服投与至所需个体中。在本发明的方法中，服用剂量可视需要予以调整。较佳地，服用剂量为每日IO8Cfu以上的乳酸菌株。在一具体实施例中，服用剂量为每日IO9-IO12Cfu的乳酸菌株；在另一具体实施例中，服用剂量为每日
2.5X109-5X10ncfu的乳酸菌株；在又一具体实施例中，服用剂量为每日5x IO9Cfu的乳酸菌株。本领域的技术人员可基于本文揭示的内容，使用任何公知方法及技术依需要调配本发明的组合物。本发明将由下列实施例做进一步的说明，但实际发明并不局限于此说明书所陈述的实施例。现在将参考下列作为说明而非限制目的的具体实施例而更明确地描述本发明。实施例I :菌株的分离及培养采集台湾健康幼儿粪便检体，于37°C下，以乳酸杆菌(Lactobacillus)选择性培养基的Rogosa平板培养基培养48至72小时,培养得乳酸杆菌疑似菌株的各菌落。取该培养物涂布于MRS平板上，于37°C下厌氧培养48至72小时，挑选生长于平板上的单一菌落进一步纯化，并依实施例2的叙述进行菌株鉴定，获得分离菌株MP137及MP108。将分离菌株接种于MRS平板上，厌氧培养48至72小时后，挑取单一菌落接种至新鲜MRS培养液中，待菌株生长状况良好(肉眼可判断的浊度)，再取I %菌液转移至另一新鲜MRS培养液中，于适合温度培养18至24小时，重复该步骤活化菌体二次，培养所得菌液供进行后续试验。实施例2 :菌株鉴定2. I初步分析依标准方式进行初步分析，结果显示本发明的分离菌株MP137及MP108为革兰氏阳性杆菌(图I及2)，且不具触酶、氧化酶及运动性，不产生内生孢子，于好氧及厌氧环境下皆会生长。2. 216SrDNAPCR 分析针对本发明的分离菌株MP137及MP108进行16S rDNAPCR分析。使用商业套组 (AxyPrep Bacterial Genomic DNA Miniprep Kit,Anxygen Bioscience)抽取菌株的基因组DNA作为模版，在PCR离心管中添加正反引子(16S-F GGAGTTTGATCCTGGCTCAG(SEQ ID NO: I);及 16S-R2 AAGGAGGTGAT CCAGCCGCA (SEQ ID NO :2))、DNA 聚合酶、缓冲液、dNTPs 等
试剂，含量如下基因组DNA1-2 L(IOOng)Taq DNA 聚合酶(Takara Co.)0.5 LIOx缓冲液10 LdNTP 混合物(2.5mM)8 L正向引子16S-F(100 M)I L反向引子16S-R2(100 M)I LH2O77.5 L总体积100 L16S rDNAPCR 反应条件包括步骤 I 95°C，3 分钟；步骤 2 95°C，30 秒；60°C，30 秒， 72°C，45秒，进行30个循环；以及步骤3 :72°C°，10分钟，最后置于4°C终止反应。PCR反应结束后，以琼脂胶体电泳分析PCR产物，再将含有预测大小的PCR产物片段的胶体切下， 以商业套组 Gel/PCR DNA Fragments Extraction Kit (Geneaid Co.)纯化，再进行定序分析。将由定序所得DNA序列，经由商业上可获得的计算机程序(Vector NTI的config 程序，Invitrogen Co.)整理组合,得到正确的DNA序列，再传送到NCBI (http://www. ncbi. nim. nih. gov/)网站上，以核苷酸BLAST程序进行比对分析,选取16S rDNA序列比对相似度最闻的菌种名称做为菌株的初步鉴定结果。SEQ ID NO 3 及 SEQ ID NO 4 为分离菌株 MP137 及 MP108 的 16SrDNA 部分序列。 比对结果显示，分离株MP108最接近鼠李糖乳酸杆菌(Lactobacillus rhamnosus)、玉米乳杆菌(Lactobacillus zeae)、凯氏乳杆菌(Lactobacillus casei)、酿乳杆菌副干酿亚种 (Lactobacillus paracasei subsp. paracasei)与类干酪乳杆菌坚韧亚种(Lactobacillus paracasei subsp. tolerans),相似性达98%以上；而分离株MP137最接近酪乳杆菌副干酪亚种、类干酪乳杆菌坚韧亚种、玉米乳杆菌、凯氏乳杆菌与鼠李糖乳酸杆菌，相似性达98% 以上。2.3API 50CHL 系统鉴定此外，亦针对本发明的分离菌株MP137及MP108进行API 50CHL系统鉴定，表I及 2分别显示分离菌株MP137及MP108的生理生化测试结果。根据API鉴定系统分析结果，在49个测试项目中，分离菌株MP137与标准菌株酪乳杆菌副干酪亚种(Lactobacillus paracasei subsp. paracasei)BCRC 122481'接近，符合的项目有43项(表I)。表I分离菌株MP137的API鉴定系统分析结果
权利要求
1.一种经分离的乳酸菌株，其特征在于，该乳酸菌株具有选自以下所组成的群的菌株的特性MP137菌株，寄存于德国微生物保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, DSMZ),寄存编号为 DSM24230 ；以及 MP108 菌株，寄存于德国微生物保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, DSMZ)，寄存编号为 DSM24229。
2.如权利要求I所述的乳酸菌株，其特征在于，所述乳酸菌株是MP137菌株，寄存于德国微生物保藏中心，寄存编号为DSM24230。
3.如权利要求I所述的乳酸菌株，其特征在于，所述乳酸菌株是MP108菌株，寄存于德国微生物保藏中心，寄存编号为DSM24229。
4.一种组合物，其特征在于，其包括如权利要求I至3中任一项的乳酸菌株。
5.如权利要求4所述的组合物，其特征在于，所述乳酸菌株为活菌或死菌。
6.如权利要求4所述的组合物，其特征在于，其为粉末或胶囊形式。
7.如权利要求4所述的组合物，其特征在于，其用于调节个体的免疫反应。
8.如权利要求4所述的组合物，其特征在于，其用于调节个体的细胞激素的产生。
9.如权利要求8所述的组合物，其特征在于，其用于提升个体的IL-12或IFN-y的产生。
10.如权利要求8所述的组合物，其特征在于，其用于提升个体的IL-IO的产生。
11.如权利要求8所述的组合物，其特征在于，其用于抑制个体的IL-4、IL-5或IL-13 的产生。
12.如权利要求4所述的组合物，其特征在于，其用于调节个体的免疫球蛋白(Ig)的产生。
13.如权利要求12所述的组合物，其特征在于，其用于提升个体的IgG2a的产生。
14.如权利要求12所述的组合物，其特征在于，其用于提升个体的IgA的产生。
15.如权利要求12所述的组合物，其特征在于，其用于抑制个体的IgE的产生。
16.如权利要求4所述的组合物，其特征在于，其用于提升个体的肠道免疫力。
17.如权利要求4所述的组合物，其特征在于，其用于抑制个体的过敏反应。
18.如权利要求4所述的组合物，其特征在于，其用于治疗气喘或过敏性鼻炎。
19.如权利要求4所述的组合物，其特征在于，其用于对抗肠道致病菌感染。
20.如权利要求19所述的组合物，其特征在于，所述肠道致病菌为沙门氏菌或大肠杆菌。
21.如权利要求4所述的组合物，其特征在于，其为药物或食品。
22.如权利要求4所述的组合物，其特征在于，其为口服形式。
23.—种如权利要求I至3中任一项的乳酸菌株的用于制备用于调节免疫反应、治疗气喘或过敏性鼻炎或对抗肠道致病菌感染的药物或食品的用途。
全文摘要
本发明是关于新颖乳酸菌株MP137及MP108，及其调节免疫反应的用途。特定而言，本发明的乳酸菌株可促进Th1反应及抑制Th2反应。
文档编号A61P1/00GK102604854SQ20111040461
公开日2012年7月25日 申请日期2011年12月7日 优先权日2010年12月8日
发明者宋璧君, 庄雅惠, 邱雪惠, 陈庆源 申请人:台湾东洋药品工业股份有限公司, 财团法人食品工业发展研究所