专利名称：干扰素λ1在制备抗肠道病毒71型药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物医药领域，涉及干扰素λ 1在制备抗肠道病毒71型药物中的应用。
背景技术：
新型肠道病毒是指近年来新发现的肠道病毒68 71型，为微小RNA病毒，具有肠道病毒的理化特性。新型肠道病毒可累及全身各个系统。新型肠道病毒感染在世界各国均有流行和传播，尤其是最近几年在东南亚和我国，婴幼儿中流行的手足口病主要是由肠道病毒 71 型(enterovirus type 71，EV71)引起。肠道病毒 71 型(enterovirus type 71， EV71)属于微小RNA病毒科人肠道病毒A血清型。EV71病毒主要感染婴幼儿，能引起婴幼儿手、足、口腔等部位出现疱疹等。少数能够引起严重的神经系统(包括脑心肌炎、肺水肿、 无菌性脑炎等)和呼吸系统疾病，甚至是死亡。由流行病学资料显示，EV71具有季节性但无地域性限制，近年来全世界各地不断有肠病毒流行的报告。但是目前尚无有效的抗EV71 病毒药物。而且大多数重症患儿病情进展迅速，在就诊时就已经发展成为严重的脑损伤，若不及时治疗很快会发展为致死性肺出血和肺水肿。有效抗EV71药物的发现和研制就显得更加迫切。EV71为正义单链RNA病毒，基因组约为7400bp。其中只有一个开放阅读框(ORF)， 被分为三个区域(Pl-P;3)，编码含2194个氨基酸的多聚蛋白。其中Pl区编码四个结构蛋白 (VP4.VP2.VP3和VPl)，非结构蛋白由P2 (2A、2B和2C)和P3 (3A、3B、3C和3D聚合酶)区编码。在其两侧为5’和3’-非编码区(UTRs)，在3’非编码区的末端含有一个多聚腺苷酸尾巴(poly-Α)，可以调控病毒的复制。目前对VPl的研究较多，VPl蛋白暴露在外，通常是宿主中和抗体的目标，使得VPl基因长期处于免疫选择压力下。EV71基因组RNA的复制过程同其他正义RNA链病毒的复制过程相同经过几轮蛋白翻译后，病毒RNA作为模板合成负义 RNA链，后者随后又作为正义RNA链合成的模板。目前，基于结构特性、所使用的受体和生物学活性，干扰素可分为三大类1型干扰素、II型干扰素和III型干扰素。其中根据I型干扰素的保守序列，又将其分为α，β， ω, κ , ε , τ , ζ , δ和ν亚型。II型干扰素仅有IFN-γ构成。III型干扰素由IFN-λ 1、 IFN- λ 2 和 IFN-λ 3 或白介素 19(IL_29)、白介素-28A(IL_28A)和白介素-28B(IL_28B) 所构成。基于其抗病毒、抗肿瘤和免疫调节活性，I型干扰素已被用于临床治疗，包括病毒感染如HCV和HBV、癌症如黑色素瘤以及多发性硬化症。但是I型干扰素会引起严重的负作用，包括流感样症状、骨髓抑制、胃肠道症状、自身免疫性失调诱导或加剧、神经毒性反应和情绪抑郁。I型干扰素的另一问题是，某些病人会产生I型干扰素抗性。IFN-λ s作为III型细胞因子家族新成员，具有和I型干扰素相似的抗病毒、抗肿瘤和免疫调节作用。而且III型干扰素激活的基因似乎也与I型干扰素的相同。由于 IFN-λ s受体特异性表达模式，IFN-λ s可作为除I型干扰素外另一治疗选择，且能降低I型干扰素引起的负作用。Zymogenetics公司最近研发了 IL-四聚乙二醇形式(PEG-IL-29) 用于治疗病毒感染。临床Ia和Ib期研究结果似乎很客观，而且没有明显的免疫介导的负作用。因为中枢神经系统对IFN- λ s基本无反应，所以相对IFN- α/β , IFN- λ s的神经毒性很小。基于以上对于IFN- λ s的研究取得的成果，本发明想证实IFN- λ 1是否是有效的抗EV71病毒药物。目前还无相关文献报道IFN-λΙ与EV71的关系，但本发明的实验结果显示，IFN-λ 1可以作为一种有效的抗EV71的药物，具有很大的开发前景。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供IFN-λ 1在制备抗EV71病毒药物中的应用， 从而为临床上EV71病毒性疾病的治疗提供一种安全有效毒副作用小的药物。在小鼠感染模型中，I型干扰素IFN- α能够保护小鼠抵抗EV71感染和抑制EV71 复制。关于三型干扰素IFN-λΙ和EV71复制间关系的研究还没有报道。采用体外细胞模型-RD细胞，来研究IFN-λ 1抑制病毒的复制等抗病毒机制。EV71感染RD细胞引起明显细胞致病作用(CPE)现象，而且明显上调了 IFN-λ ImRNA水平。为了研究RD细胞是否会对IFN-λ 1处理做出反应，我们检测了 IFN-λ 1受体的表达情况，结果显示RD细胞中 IFN- λ Rl和IL20RB mRNA表达水平要高于H印G2细胞O倍)。而且，IFN- λ 1对RD细胞几乎没有毒性作用，不会抑制细胞生长。因此，体外实验证明用IFN-λ 1作抗EV71病毒药物是对细胞没有毒性的。接着我们做了探索性的实验，用lOng/mL IFN-λ 1和30U/mL IFN-α分别处理 EV71感染的RD细胞，通过Real-time PCR和Western Blot检测发现，IFN- λ 1确实能降低细胞内以及上清中EV71拷贝数，说明IFN-λ 1具有抗EV71活性。随后我们研究了 IFN-λ 1抗EV71活性的剂量依赖性和时间效应。发现IFN-λ 1 对EV71复制的抑制具有一定剂量依赖性，50ng/mL IFN- λ 1处理后的效果最好。在25ng/ mL IFN- λ 1处理后，第18小时病毒抑制率达到最大，在实验时间内(32h)，IFN-λ 1都具有抗病毒活性。所有实验结果都说明，IFN-λ 1是一种很有潜力的抗EV71药物，可以用于制备抗 EV71药物。本发明也公开了抗EV71的药物，其中含有IFN-λ 1，其制备方法按制药工业现有技术制备。此外，我们建立快速检测EV71病毒拷贝数的方法。我们建立的Real-time PCR检测方法具有高度特异性，其灵敏度可达到10个拷贝数。自制标准品可靠、重复性高，且结果较好，节约了成本，省去了探针的设计以及探针法反应条件的摸索。为以后EV71病毒滴度检测提供了高效、灵敏和快捷的分子生物学检测方法。
图1. EV71检测标准品STOR Green I实时荧光PCR检测特异性扩增曲线。图2. EV71检测标准品STOR Green I实时荧光PCR溶解曲线。三组独立实验中的
线性一致。
图3. EV71检测标准品STOR Green I实时荧光PCR标准曲线。图4. IFN-λ受体在H印G2和RD细胞中的表达。图5. EV71感染RD细胞后诱导IFN-λ ImRNA表达上升。图6. IFN- λ 1对RD细胞生长的影响。纵坐标为不同浓度IFN- λ 1处理后0D490 与正常RD细胞0D490的比值。图7. IFN- λ 1抑制EV71复制。(A)为细胞培养上清中EV71拷贝数；(B)RD细胞内 VPl蛋白表达情况。图8. IFN- λ 1对EV71复制的抑制具有剂量依赖性。㈧IFN- α (阳性对照)剂量梯度抑制EV71在RD细胞内的复制；(B)EV71感染的RD细胞培养物上清中病毒拷贝数变化； (C)EV71感染的RD细胞中VPl表达变化。图9. IFN- λ 1抑制EV71复制的时间梯度。(A)EV71感染的RD细胞培养物在不同时间点的上清中病毒拷贝数变化。(B)IFN-X 1在各时间点对EV71复制的抑制率。
具体实施例方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。下列实施例中未注明具体实验条件的实验方法，通常按照常规实验条件，如Sambrook等编的《分子克隆实验室手册》中所述的实验条件，或按照制造厂商所建议的实验条件。建。
一 :EV71拷贝数快速检测方法(Real-time PCR)的建立 1材料质粒、病毒和细胞
pCMV-Tag2B-VPl 是携带EV71 VPl基因片段的真核表达质粒，由本实验室宋煜构
EV71 由湖北省襄樊市一例EV71感染死亡幼儿脑内分离得到，本实验室保存。 其序列尚未传至NCBI数据库。
横纹肌肉瘤RD细胞由中国典型培养物保藏中心(CCTCC)提供，保存于本实验室c HepG2细胞由中国典型培养物保藏中心(CCTCC)提供，保存于本实验室。 2工具酶及试剂盒
购自普洛麦格公司(Promega) 购自普洛麦格公司(Promega) 购自ABI公司
购自北京庄盟国际生物基因科技有限公司购自Invitrogen公司
M-MLV逆转录酶 RNA 抑制剂(RNasin) SYBR Green PCR Master Mix 高纯度质粒小提试剂盒 Trizol
3相关试剂及其配制卡那霉素(100mg/mL) 称取0. Ig卡那霉素溶于ImL去离子水中，0. 22 μ m滤
器过滤，一20°C保存备用。
LB液体培养基細菌培养用胰化蛋白胨Ig
細菌培养用酵母提取物 0. 5g
NaClIg
溶于80mL去离子水中，定容至lOOmL。121°C高压灭菌 15min, 4°C保存备用。
MEM細胞培养基粉末购自Gibco公司
MEM粉末IOg
NaHC032. 2gHEPES3g
溶于950mL超纯水中，待完全溶解后调pH至7. 1-7. 3， 定容至IOOOmL,过滤后分装，4°C保存备用。
胰蛋白酶胰蛋白酶2.5g
EDTA0.2g
PBS ( pH7.4)IOOmL
PBS需现配现用，加超纯水至900mL，调pH至7. 4后， 4°C搅拌过夜使其彻底溶解。第二天定容至IOOOmL,搅勻后过滤分装，4°C保存备用。
1 X PBS (细胞用) NaCl8g
KCl0. 2g
Na2HPO43.63g
KH2PO40. 24g
溶于850mL去离子水中，待溶解后调pH值7. 4，加水定容至1000mL。121°C高压灭菌15min，4°C保存备用。
胎牛血清购自GIBCO公司
青霉素、链霉素武汉大学校医院提供4实验仪器高速离心机(Thermo Scientific Heraeus Pico 17)台式高速冷冻离心机(Heal Force Neofuge 13R)紫外可见分光光度计(Shimadzu，BioSpec-nano)台式恒温振荡器(THZ-D)pH 计PCR扩增仪(东胜)冷冻、冷藏冰箱(Haier)超低温冰箱(SANYOMDF-U4086S)全自动灭菌锅(SANYO)
Real-time PCRft (Roche, LightCycle 480II)RD细胞复苏1)准备600mL 37_42°C去离子水，用镊子将细胞冻存管从液氮中取出，放入其中， 待其融化。2) 1500rpm离心5min，取出放进细胞操作台。3)用75% (液体体积比)酒精将冻存管擦拭一遍，尤其是盖口处。4)吸去上层液体，加入ImL含10% (体积比)Gibco胎牛血清和2%青霉素-链霉素的MEM培养基重悬，转移到25cm2细胞培养瓶中，补足培养基至5mL。5) 37°C ,5% (气体体积比)(X)2细胞培养箱中培养。RD细胞冻存1)吸去培养瓶中的培养基，用ImL胰蛋白酶或细胞用PBS清洗一遍，加入0. 5-lmL 胰蛋白酶，37°C，5% (气体体积比)(X)2条件消化2-5min。2)加入2-3mL培养基终止消化反应，转移至15mL离心管中，1500rpm离心5min，弃上清。3)将胎牛血清与二甲亚砜(DMSO)以9 1的体积比混合，加入细胞沉淀中，吹勻，
转移至冻存管。4)逐步降温冰箱放置半个小时，-20°C冰箱放置2小时，-70°C冰箱放置过夜)，随后转移至液氮内。病毒扩增1)使用含10% Gibco胎牛血清和2%青霉素-链霉素的MEM培养基在75cm2 培养瓶中培养RD细胞，37°C，5% (气体体积比)CO2培养箱培养，待细胞长成单层细胞(约 6 X IO6个细胞)，铺满底面积90 %。2)将50 μ L EV71病毒保存液加入4mL无血清MEN培养基中，混勻。吸去培养瓶中的培养基，加入病毒稀释液，轻摇铺勻。37°C，5% (气体体积比)C02培养箱中吸附lhr。每隔15-20min轻摇一下细胞培养瓶，使病毒均勻吸附。3)吸附后，吸去上清，用IXPBS洗两遍后，加入含2% (液体体积比)Gibco胎牛血清和2% (单位体积比)青霉素-链霉素的MEM培养基，37°C，5% (气体体积比)(X)2培
养才苜培养。4)每天观察细胞致病作用现象，待90%细胞出现细胞致病作用效应时，收集上清，4000rpm 离心 5min。5)使用0. 22 μ m滤器过滤病毒上清，每个离心管500 μ L分装，_70°C冰箱保存，避免反复冻融。EV71 RNA 提取1)取病毒上清200 μ L于1. 5mL离心管中，加入ImL Trizol，剧烈振荡混勻15s，室温放置15-30min。2)每管加入五分之一体积的三氯甲烷Ο40μ L)，剧烈摇勻15s，静置2_;3min。在 4°C条件下，12000rpm离心15min (离心后分为三层)。3)将最上层液体转移到新的离心管中，避免吸取到蛋白部分。加入等体积的异丙醇，混勻后室温静置lOmin。4°C条件下，12000rpm离心15min，倒去上清。
4)在4°C条件下，12000rpm离心30s，吸弃上清。5)每管加入750μ L无水乙醇和250μ L 0. 1 % DEPC水，摇勻。4°C条件下， 12000rpm离心5min，倒去上清。6)4°C条件下，12000rpm离心2min，吸弃上清。7)无RNA酶污染的空气中干燥5min。8)每管加入16. 5 μ L 0. 1 % (体积比)DEPC水溶解沉淀，待用。注RNA提取过程中的枪头、离心管以及试剂尽量用DEPC水处理或配制。操作时应戴手套、口罩。RT-PCR 反应1)取上述处理后的RNA样品16. 5 μ L于PCR管中，每管依次加入RNA酶抑制剂 0. 5 μ L，引物 Oligo dT lyL，混勻。2)在PCR扩增仪上，65°C处理15min，取出立即置于冰上。3)每管再依次加入5 XM-MLV逆转录酶缓冲液5 μ L，IOmM dNTP 1 μ L，M-MLV逆转
录酶1 μ L。充分混勻。反应总体系如下
RNA1. OPg
RNase 抑制剂0. 5μ
Oligo dT primerIM-L
5XRT-PCR buffer5μ
10 mmol/L dNTP mix μ
Reverse TranscriptaseIM-L
补足DEPC水至25μ 反应条件42°C，lh,72°C，IOmin,终止反应。标准品制备A :pCMV-Tag2B-VPl 质粒的提取1)柱平衡步骤向吸附柱内(吸附柱放在收集管中)加入500 μ L平衡液， 12000rpm离心lmin，倒掉收集管内的废液，将吸附柱放回收集管。2)取l-5mL过夜培养的菌液加到离心管中，12000rpm离心lmin，尽量吸去上清。3)向有菌体沉淀的离心管中加入200 μ L溶液1(先检查是否加入了 RNase Α)，使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮沉淀。4)向离心管中加入200 μ L溶液2，温和上下翻转6_8次让菌体充分裂解。5)向离心管中加入250 μ L溶液4，立即温和地上下翻转6-8次，充分混勻，此时会
9出现白色絮状沉淀物。12000rpm离心lOmin。6)小心地吸取上清溶液至新离心管中，向其中加入200 μ L异丙醇颠倒混勻，将混合液转移至吸附柱中，12000rpm离心30-60s，倒掉收集管里的废液，吸附柱放回收集管中。7)往吸附柱中加入500 μ L去内毒素缓冲液，12000rpm离心30_60s，倒掉收集管里的废液，吸附柱放回收集管中。8)往吸附柱中加入600yL漂洗液W2(先检查是否已加入无水乙醇)，12000rpm离心30-60s，倒掉收集管里的废液，吸附柱放回收集管中。重复此步骤1次。9)吸附柱放入收集管中，12000rpm离心2min，除去吸附柱里残余的漂洗液，10)将吸附柱置于干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50-100 μ L的灭菌去离子水，室温放置2min，12000rpm离心2min，将质粒溶液收集到离心管中。B 质粒浓度与拷贝数换算1)在分光光度计上，取2 μ L质粒溶液测定其浓度，重复几次，要求测得浓度值稳定，初步估计质粒纯度以及是否有蛋白质污染的状况。2)配制琼脂糖凝胶，检测质粒纯度及条带亮度。3)根据以下公式将浓度换算为质粒拷贝数amount :0D 值(ng/ μ L)；length 质粒DNA碱基对数目(bp)。C:标准品制备将上述已知拷贝数的质粒用灭菌去离子水进行稀释，如稀释到IXlOltlc0Pies/ μ L，然后再进行倍比稀释，浓度依次为 IO9, IO8, IO7, IO6, IO6, IO5, IO4, IO3, IO2, IO1Copies/ UL0以此作为测定EV71拷贝数的标准品。Real-time PCR1)反应体系
SYBR Green PCR Master MixΙΟμ
VPl TestPrimer (Forward + μ Reverse)
TemplateIM-L
H2O8μ
总体积20μ 2) VPl检测片段及引物
VPl检测片段序列CCCTTTAGTGGTTAGGATTTACATGAGGATGAAGCACGTCAGGGCGTGGATACCTCGCCCAATGCGCAACCAAAACTACCTATTCAAAGCCAACCCAAATTATGCTGGCAACTCCATTAAGCCAACTGGTG (SEQ IDNO 1)引物=Forward :5，-CCCTTTAGTGGTTAGGATTT-3，(SEQ ID NO 2)Reverse :5，-CACCAGTTGGTTTAATGGAG-3，(SEQ ID NO 3)幻反应程序
权利要求
1.干扰素λ1在制备抗肠道病毒71型药物中的应用。
2.抗肠道病毒71型的药物，其中含有干扰素λ1。
全文摘要
本发明公开了一种干扰素λ1在制备抗肠道病毒71型药物中的应用，证实IFN-λ1在体外对EV71感染的RD细胞具有良好的抑制病毒复制作用。同时，IFN-λ1不会抑制RD细胞生长，证实IFN-λ1对细胞是没有毒性的。IFN-λ1抑制EV71复制的作用效果与阳性对照Ⅰ型干扰素IFN-α比较近似甚至还要好些。IFN-λs(包括IFN-λ1、IFN-λ2和IFN-λ3)具有和Ⅰ型干扰素相似的抗病毒、抗肿瘤和免疫调节等生物活性，并且能降低Ⅰ型干扰素引起的负作用，揭示IFN-λ1具有开发成抗EV71药物的前景。
文档编号A61P31/14GK102512666SQ20111042170
公开日2012年6月27日 申请日期2011年12月15日 优先权日2011年12月15日
发明者吴建国, 徐秀鹏, 朱应, 蔡艳艳 申请人:武汉大学