专利名称：一种基于组合模具的复杂器官前体的制备方法
一种基于组合模具的复杂器官前体的制备方法技术领域
本发明属于生物组织和器官的人工制造技术领域，特别涉及利用合成高分子材料、细胞基质材料制备组织器官前体的工艺方法，属于生物组织工程技术领域。
背景技术：
组织工程学是由美国国家科学基金委员会于1987年正式提出和确定的，是应用细胞生物学、生物材料和工程学的原理，研究开发用于修复或改善人体病损组织或器官的结构、功能的生物活性替代物的一门科学。Wolter在1984年正式提出“组织工程” 一词， 1987年美国国家科学基金委员会正式确定组织工程学成为一门新学科。
现存的组织工程技术面临许多困难和限制，组织工程应用研究所取得的成功均是在那些结构与生理功能较为简单的组织器官如骨骼、软骨、皮肤。传统组织工程方法一般先制备结构支架，在进行细胞培养过程中由于上层细胞消耗大部分的氧气和营养，限制了这些组分向底层扩散，从而限制了细胞向支架深层的迁移等。这种先制备支架，再培养细胞的方法，耗时又费力，细胞在向支架内迁移的过程中很可能就已经变型、老化，达不到及时治疗临床病人的要求。传统的支架制备技术很难形成具有分支贯通的营养供应通道。同时传统的组织工程技术不能满足将不同的细胞在空间准确定位与定点放置，构建复杂组织器官的功能梯度结构的需求。目前心血管系统疾病已成为世界范围内尤其是发达国家中的第一杀手，临床的巨大需求是促使血管组织工程技术不断进步的动力之一。预计到21世纪末， 60岁以上的老龄人中，动脉硬化的发病率将高达80%左右。据统计在美国，每年接受血管移植的患者已经超过百万之多。血管组织工程制造的人造血管组织植入生物体内后，人造血管组织同受体的活组织可有机地整合，促进受损处血管快速、有效地修复。同时，在构建复杂器官时，构建具有复杂分支结构的复杂器官前体也是必须解决的关键问题，也是多分支血管支架的重要应用方向。发明内容
本发明的目的是提供一种基于组合模具的复杂器官前体的制备方法，旨在前人工作的基础上，利用分步组合模具/萃取法，实现细胞和支架材料在空间的准确定位，成形带有复杂多分支的多层结构。利用模具组合、高分子凝固成形等原理实现复杂组织器官的重建，本发明可成形含不同细胞基质材料与合成高分子支架的复杂多分支三维结构，克服了组织工程存在的在三维支架中诱导培养细胞需要时间长、细胞分布不均勻，细胞很难渗入到多分支结构中等缺点。
本发明的技术方案如下
一种基于组合模具的复杂器官前体的制备方法，其特征在于该方法包括如下步骤进行
1)将不同天然高分子溶液与不同动物体细胞悬浮液按1 9 9 1体积比混合制成多种细胞基质溶液；天然高分子溶液的质量百分浓度为 30% ；
2)预先设计好实心多分支内模具和一组具有不同直径通道的中间模具，将其中一种中间模具套在实心多分支内模具的外部，将其中一种细胞基质溶液灌注到实心多分支内模具和中间模具之间的缝隙中，采用物理或化学交联方法，使细胞基质溶液中的天然高分子交联，去除中间模具，形成稳定的第一层细胞基质层；
3)使用另一种通道直径比第一种大的中间模具套在第一层细胞基质层的外部，将另一种细胞基质溶液灌注到第一层细胞基质层和第二种中间模具之间的缝隙中，采用物理或化学交联方法，使细胞基质溶液中的天然高分子交联，去除中间模具，形成稳定的第二层细胞基质层；
4)重复步骤2)与步骤3)，得到含不同动物体细胞的多层细胞基质层结构；
5)将合成高分子材料溶于有机溶剂中制成质量百分浓度为 30%的合成高分子溶液；
6)将预先设计好的外模具套在多层细胞基质层结构外部，将合成高分子溶液灌入多层细胞基质层结构与外模具的缝隙中，用细胞培养液萃取合成高分子溶液中的溶剂，形成外层合成高分子材料层，然后去除外模具与实心多分支内模具，制成多分支及多层结构的复杂组织器官前体。
本发明所述的一种基于组合模具的复杂器官前体的制备方法，其特征在于在细胞基质溶液中还加入体积百分比为 30%的冻存保护剂，所述的冻存保护剂采用甘油、二甲基亚砜、乙二醇和葡聚糖中的一种或两种材料的混合物。
本发明所述的一种基于组合模具的复杂器官前体的制备方法，其特征在于在细胞基质溶液中加入体积百分比为0.001% 0. 细胞生长因子。所述的细胞生长因子采用内皮细胞生长因子、细胞转移因子或肝细胞生长因子。
本发明所述的合成高分子材料采用聚氨酯、乳酸与乙醇酸共聚物、聚乳酸和聚酯中的一种或几种材料的复合物。所述的天然高分子材料采用明胶、纤维蛋白原、胶原、壳聚糖、海藻酸钠、透明质酸和纤粘连蛋白中的至少一种。
上述技术方案中，步骤1)中所述的用于溶解所述天然高分子材料的溶剂采用水、 生理盐水、PBS溶液、pH = 6 8的0. 09M氯化钠、3-羟甲基氨基甲烷盐酸溶液或细胞培养液；步骤幻中用于溶解所述合成高分子材料的有机溶剂采用四乙二醇、乙二醇、异丙醇或 1，4-二氧六环。
本发明所述的实心多分支内模具由软性材料制成的实心管组合而成，内模具各分支的直径相同或不同。所述的中间模具及外模具可根据实心多分支内模具的分支数量分为 2 20个等分体结构，实心多分支内模具分支结构采用有序或交错排列。所述的中间模具及外模具外形截面可以为圆型或多边形，其材料可为金属或是硬质合成高分子材料。
本发明所制备的带有多分支多层结构复杂组织器官前体中合成高分子支架材料具备优异的机械性能，可以与体内的管道系统相连接。其中细胞基质溶液具有优异的生物相容性，多种细胞可以在其中形成多种组织。本发明可以实现不同细胞/天然高分子材料与合成高分子支架材料在空间的准确定位，克服了组织工程目前存在的在三维支架中诱导培养细胞需要时间长，细胞在支架中分布不均勻，细胞很难渗入到多分支结构中等缺点。本发明利用分步模具/萃取法、高分子凝固成形等原理可以达到复杂器官中不同部位不同细胞类型及结构类型的要求，为实现复杂组织器官的重建打下基础。
图1是本发明实心多分支内模具的三维效果图(以四分体为例)。
图2是成形多分支结构第一层细胞基质层时的模具剖面图(以四分体为例)。
图3是成形多分支结构合成高分子材料层时的模具剖面图(以四分体为例)。
图4是多分支结构各分支管的剖面分层图(以双层细胞基质层为例)。
在图1至图4中
1-实心多分支内模具；2-第一层细胞基质层；3-中间模具；
4-第二层细胞基质层；5-外模具；6-合成高分子材料层。
具体实施方式
本发明提供的一种多层结构的复杂组织器官前体的制备方法，其具体工艺步骤如下
1)将不同天然高分子溶液与不同动物体细胞悬浮液按1 9 9 1体积比混合制成多种细胞基质溶液；天然高分子溶液的质量百分浓度为 30% ；
2)预先设计好实心多分支内模具1和一组具有不同直径通道的中间模具3，将其中一种中间模具套在实心多分支内模具1的外部，将其中一种细胞基质溶液灌注到实心多分支内模具和中间模具之间的缝隙中，采用物理或化学交联方法，使细胞基质溶液中的天然高分子交联，去除中间模具，形成稳定的第一层细胞基质层2 ；
3)使用另一种通道直径比第一种大的中间模具套在第一层细胞基质层2的外部， 将另一种细胞基质溶液灌注到第一层细胞基质层2和第二种中间模具之间的缝隙中，采用物理或化学交联方法，使细胞基质溶液中的天然高分子交联，去除中间模具，形成稳定的第二层细胞基质层4 ；
4)重复步骤2)与步骤3)，得到含不同动物体细胞的多层细胞基质层结构；
5)将合成高分子材料溶于有机溶剂中制成质量百分浓度为 30%的合成高分子溶液；
6)将预先设计好的外模具5套在多层细胞基质层结构外部，将合成高分子溶液灌入多层细胞基质层结构与外模具的缝隙中，用细胞培养液萃取合成高分子溶液中的溶剂， 形成外层合成高分子材料层6，然后去除外模具与实心多分支内模具，制成多分支及多层结构的复杂组织器官前体。
本发明的优选方案是在所述的细胞基质溶液中还加入体积百分比为 30% 的冻存保护剂，所述的冻存保护剂采用甘油、二甲基亚砜、乙二醇和葡聚糖中的一种或两种材料的混合物。在所述的细胞基质溶液中加入体积百分比为0.001% 0. 细胞生长因子。所述的细胞生长因子采用内皮细胞生长因子、细胞转移因子或肝细胞生长因子。所述的合成高分子材料采用聚氨酯、乳酸与乙醇酸共聚物、聚乳酸和聚酯中的一种或几种材料的复合物。所述的天然高分子材料采用明胶、纤维蛋白原、胶原、壳聚糖、海藻酸钠、透明质酸和纤粘连蛋白中的至少一种。步骤1)中用于溶解所述天然高分子材料的溶剂采用水、 生理盐水、PBS溶液、pH = 6 8的0. 09M氯化钠、3-羟甲基氨基甲烷盐酸溶液或细胞培养液；步骤幻中用于溶解所述合成高分子材料的有机溶剂采用四乙二醇、乙二醇、异丙醇或1，4-二氧六环。
所述的实心多分支内模具1由软性材料制成的实心管组合而成，内模具各分支直径可变也可为一固定值。所述的软性材料采用塑料、橡胶、纤维、硅胶等材料的一种或几种。
所述的中间模具3及外模具根据实心多分支内模具1的分支数量分为2 20个等分体结构，实心多分支内模具1分支结构采用有序或交错排列。
所述的中间模具3及外模具5外形截面为圆型或多边形，其材料为金属或是硬质合成高分子材料，如黄铜、聚四氟乙烯、硅橡胶等。
实施例1 :1)制备一系列口径不等的黄铜材质多分支组合模具；幻配制纤维蛋白原溶液，将第一中间模具套在内模具外部，在内模具与第一中间模具间注入明胶/纤维蛋白原与内皮细胞的混合物，细胞密度为IXlO7个/mL，用凝血酶溶液(20IU/mL)浸泡成形物 2分钟交联形成稳定结构；3)将第二中间模具套在上述多分支结构外部。在第二中间模具与PLGA支架中注入纤维蛋白原/脂肪干细胞混合物(细胞密度为1乂105个/!^)，加入肝细胞生长因子(HGFO. 5ng/mL)、人血小板衍化生长因子(BB或PDGF_BB50ng/mL)、转化生长因子β 1 (TGF β 110ng/mL)和碱性成纤维细胞生长因子(b_FGF2. 5ng/mL)，注入凝血酶溶液(20IU/mL)使细胞/天然高分子材料层交联形成稳定结构；(4)配备浓度为10% (W/V) 的PLGA/四乙二醇(Tetraglycol)溶液，加入(W/W)的肝素，将外模具套在上述双层结构外部，在外模具与上述双层结构之间注入复合肝素的PLGA/四乙二醇溶液，然后在细胞培养液中萃取溶剂形成PLGA外支架，完成多分支人工血管前体的制备。
实施例2 1)用硅橡胶制备多分支管道的实心多分支内模具、中间模具及外模具； 2)将第一中间模具套在实心多分支内模具外部，在实心多分支内模具与第一中间模具中注入含紫杉醇的纤维蛋白原/内皮细胞混合物(细胞密度为IX IO7个/mL)，用凝血酶溶液(10IU/mL)浸泡成形物1分钟，交联形成内层结构材料；幻将第二中间模具套在上述内层结构外部，在第二中间模具与内层结构材料中注入明胶/纤维蛋白原与脂肪干细胞的混合物，细胞密度为IX IO6个/mL，用凝血酶溶液(10IU/mL)浸泡成形物1分钟，交联形成双层结构材料；4)将第三中间模具套在上述双层结构外部，在第三中间模具与双层结构材料中注入纤维蛋白原/肝细胞混合物(细胞密度为IX IO7个/mL)，用凝血酶溶液(10IU/mL) 浸泡成形物1分钟，交联形成三层结构材料力)将外模具套在上述三层结构外部，在外模具与三层结构间注入5%的聚氨酯/乙二醇溶液，加入5%的紫杉醇，搅拌均勻，然后经过PBS 萃取成形外层聚氨酯层，去除模具，完成可植入型人工肝脏前体的制备。
实施例3 1)制备一系列口径不等的多分支聚四氟乙烯模具；2)将第一中间模具套在多分支内模具外部，在多分支内模具与第一模具间注入柠檬酸钠的胶原/内皮细胞混合物(细胞密度为1 X IO7个/mL)，采用物理交联法在37°C下放置10分钟，使胶原/内皮细胞混合物结构稳定，去掉模具；3)将第二中间模具套在上述内层结构外部，在内层结构与第二中间模具间注入胶原/内皮细胞混合物，采用物理交联法在37°C下放置10分钟， 使胶原/平滑肌细胞混合物结构稳定，去掉模具；4)将第三中间模具套在上述在胶原/内皮细胞混合物双层结构外部，在第三中间模具与双层结构间中注入胶原/平滑肌细胞混合物(细胞密度为IX IO7个/mL)；采用物理交联法在37°C下放置10分钟，使胶原/平滑肌细胞混合物结构稳定，去掉模具；5)将第四中间模具套在上述胶原/内皮细胞混合物、胶原/平滑肌细胞混合物三层结构外部，并在胶原/内皮细胞混合物、胶原/平滑肌细胞混合物与第四中间模具间中注入胶原与脂肪干细胞/乳鼠心肌细胞(1 1)的混合物，细胞密度为1 X IO6个/mL，采用物理交联法在37°C孵箱中放置10分钟，使其四层材料结构稳定，去掉模具；6)将外模具套在上述胶原/内皮细胞混合物、胶原/平滑肌细胞混合及胶原与脂肪干细胞/乳鼠心肌细胞混合物外部，在四层材料与外模具间注入浓度为30%的聚乳酸/异丙醇溶液，加入30 %的柠檬酸钠，搅拌均勻，然后经过PBS萃取后完成可植入型人工心脏前体的制备。
实施例4 :1)用聚四氟乙烯制备带分支管道的内模具、中间模具及外模具；2)将第一中间模具套在实心多分支内模具外部，在实心多分支内模具及第一中间模具间注入下列溶液纤维蛋白原和明胶两种天然生物材料分别溶于磷酸缓冲液(PBQ溶液中制成10%和 30%的高分子溶液，再按1 l(v/v)比例混合均勻。然后按体积比加入10%的二甲基亚砜、5%葡聚糖；将脂肪干细胞与肾小球细胞按1 1比例混合均勻，加入高分子溶液中，得到脂肪干细胞-肾小球细胞-明胶-纤维蛋白原-二甲基亚砜-葡聚糖混合物(细胞密度为IXlO4个/mL)；在实心多分支内模具与第一中间模具间注入上述混合物并用凝血酶溶液(30IU/mL)交联2分钟；3)将外模具套在上述内层结构外部，在内层结构与外模具间注入30% PU/四乙二醇溶液，经过PBS萃取溶剂，形成双层结构；4)将上述三维结构体在4°C 下放置半小时，然后-20°C冰箱中办小时，最后放入-70°C低温冰箱液氮中低温保存，使用时快速复温，培养以备使用。
实施例5 1)制备一系列口径不等的黄铜椭圆形带分支管道的内模具、中间模具及外模具；幻将第一中间模具套在实心多分支内模具外部，在实心多分支内模具及第一中间模具间注入下列混合物将纤维蛋白原溶于磷酸缓冲液(PBQ溶液中制成10%高分子溶液。然后按体积比加入20%的甘油、5%葡聚糖；将脂肪干细胞与胰岛细胞按2 1比例混合均勻，加入高分子混合溶液中(细胞密度为IX IO7个/mL)，得到脂肪干细胞-胰岛细胞、 明胶-纤维蛋白原-二甲基亚砜-葡聚糖混合物；将上述混合物注入到实心多分支内模具与第一中间模具中，用凝血酶溶液(10IU/mL)交联2分钟，形成内层结构；3)将外模具套在上述内层结构外，注入含3%紫杉醇的30%聚酯/四异二醇溶液，经过蒸溜水萃取溶剂，形成双层结构材料；4)将双层结构材料在4°C下放置半小时，然后-20°C冰箱中办小时，最后放入-196°C液氮中低温保存，使用时快速复温，加入培养液于37°C、5% CO2条件下培养备用。
权利要求
1.一种基于组合模具的复杂器官前体的制备方法，其特征在于该方法包括如下步骤进行1)将不同天然高分子溶液与不同动物体细胞悬浮液按1 9 9 1体积比混合制成多种细胞基质溶液；天然高分子溶液的质量百分浓度为 30% ；2)预先设计好实心多分支内模具(1)和一组具有不同直径通道的中间模具(3)，将其中一种中间模具C3)套在实心多分支内模具(1)的外部，将其中一种细胞基质溶液灌注到实心多分支内模具(1)和中间模具C3)之间的缝隙中，采用物理或化学交联方法，使细胞基质溶液中的天然高分子交联，去除中间模具(3)，形成稳定的第一层细胞基质层O)；3)使用另一种通道直径比第一种大的中间模具C3)套在第一层细胞基质层O)的外部，将另一种细胞基质溶液灌注到第一层细胞基质层( 和第二种中间模具C3)之间的缝隙中，采用物理或化学交联方法，使细胞基质溶液中的天然高分子交联，去除中间模具(3)， 形成稳定的第二层细胞基质层；4)重复步骤2)与步骤3)，得到含不同动物体细胞的多层细胞基质层结构；5)将合成高分子材料溶于有机溶剂中制成质量百分浓度为 30%的合成高分子溶液；6)将预先设计好的外模具( 套在多层细胞基质层结构外部，将合成高分子溶液灌入多层细胞基质层结构与外模具的缝隙中，用细胞培养液萃取合成高分子溶液中的溶剂，形成外层合成高分子材料层(6)，然后去除外模具(5)与实心多分支内模具(1)，制成多分支及多层结构的复杂组织器官前体。
2.按照权利要求1所述的一种基于组合模具的复杂器官前体的制备方法，其特征在于在细胞基质溶液中还加入体积百分比为 30%的冻存保护剂，所述的冻存保护剂采用甘油、二甲基亚砜、乙二醇和葡聚糖中的一种或两种材料的混合物。
3.按照权利要求1或2所述的一种基于组合模具的复杂器官前体的制备方法，其特征在于在细胞基质溶液中加入体积百分比为0.001% 0. 细胞生长因子。
4.按照权利要求3所述的一种基于组合模具的复杂器官前体的制备方法，其特征在于所述的细胞生长因子采用内皮细胞生长因子、细胞转移因子或肝细胞生长因子。
5.按照权利要求1所述的一种基于组合模具的复杂器官前体的制备方法，其特征在于所述的合成高分子材料采用聚氨酯、乳酸与乙醇酸共聚物、聚乳酸和聚酯中的一种或几种材料的复合物。
6.按照权利要求1所述的一种基于组合模具的复杂器官前体的制备方法，其特征在于所述的天然高分子材料采用明胶、纤维蛋白原、胶原、壳聚糖、海藻酸钠、透明质酸和纤粘连蛋白中的至少一种。
7.按照权利要求1所述的一种基于组合模具的复杂器官前体的制备方法，其特征在于步骤1)中用于溶解所述天然高分子材料的溶剂采用水、生理盐水、PBS溶液、pH = 6 8的0. 09M氯化钠、3-羟甲基氨基甲烷盐酸溶液或细胞培养液；步骤5)中用于溶解所述合成高分子材料的有机溶剂采用四乙二醇、乙二醇、异丙醇或1，4-二氧六环。
8.按照权利要求1所述的一种基于组合模具的复杂器官前体的制备方法，其特征在于所述的实心多分支内模具(1)是由软性材料制成的实心管组合而成，内模具各分支的直径相同或不同。
9.按照权利要求1所述的一种基于组合模具的复杂器官前体的制备方法，其特征在于所述的中间模具C3)及外模具根据实心多分支内模具(1)的分支数量分为2 20个等分体结构，实心多分支内模具(1)分支结构采用有序或交错排列。
10.按照权利要求1所述的一种基于组合模具的复杂器官前体的制备方法，其特征在于所述的中间模具C3)及外模具( 外形截面为圆型或多边形，其材料为金属或是硬质合成高分子材料。
全文摘要
一种基于组合模具的复杂器官前体的制备方法，该方法首先制备细胞基质溶液和合成高分子溶液，一组具有不同通道直径的中间模具分别套在实心多分支内模具外部，将细胞基质溶液灌注到实心多分支内模具与中间模具之间经物理或化学交联形成多层细胞基质层；将外模具套在多层细胞基质层外部，将合成高分子溶液灌注到细胞基质层和外模具之间，用细胞培养液或PBS萃取后形成外支架，去除组合模具即可。本发明可成形含不同细胞基质材料与合成高分子支架的复杂多分支三维结构，克服了组织工程存在的在三维支架中诱导培养细胞需要时间长、细胞分布不均匀，细胞很难渗入到多分支结构中等缺点。
文档编号A61L27/18GK102512261SQ20111044815
公开日2012年6月27日 申请日期2011年12月28日 优先权日2011年12月28日
发明者王小红, 黄源文 申请人:清华大学