专利名称：一种长效人血管内皮生长因子165的制备的制作方法
技术领域：
人血管内皮生长因子165与人血清白蛋白的融合蛋白及其制备属于长效重组融合蛋白药物技术领域涉及DNA重组技术，药物蛋白与HSA的融合使得药物成为长效药物。
背景技术：
血管内皮生长因子由!^errara等于1989年首次在牛垂体星状滤泡細胞体外培养液中纯化获得，可刺激细胞迁移、増殖和内皮細胞表达各种基因，特异地作用于血管内皮細胞诱导体内血管的形成并增加血管通透性的細胞因子，是ー种最主要的血管生成因子。在改变心肌缺血、抗动脉粥样硬化、防治动静脉血管损伤和防治血管再狭窄，以及促进心血管、胰岛移植等方面均有重要作用，并为肿瘤治疗的研究开辟了新的途径。VEGF 根据VEGFmRNA剪接方式不同分为多个变构体，有VEGF121、VEGF145, VEGF165、VEGF183、 VEGF189, VEGF206。VEGF165是体内最多的亚型，其生物活性最强且cDNA扩增丰度最高， 故在临床和实验中应用最广，由于其能加速血管内皮細胞(vascular endothelial cell, VEC)损伤的修复，使血管内血栓形成及血栓性闭塞減少，并抑制内膜增生，倍受国内外研究人员的关注。然而，由于hVEGF165分子量非常小，体内代谢速度相当快，因此为了达到治疗效果，需要频繁大剂量用药。昂贵的价格和频频用药造成的不便将严重限制了此种药物的应用。人血清白蛋白(Human serum albumin, HSA)是血浆中的主要蛋白成分，它除了具有維持血浆渗透压功能以外，还能担当许多内源因子和外源药物的载体，从而调节激素活性，所载物质的毒性，以及药物的利用度。成熟的HSA有585个氨基酸残基組成，含有17对 ニ硫键，分子量约为66. 5KDa，如此大的分子量减小了它在内循环时经肾排泄的量，再正常情况下，不易被肾小球虑过，血浆半衰期在20天左右。同吋，HSA在人体内没有酶学和免疫学活性，是ー种理想的生物活性蛋白载体。
发明内容
本发明的ー个内容是提供hVEGF165与HSA生理特性于一体的人血清白蛋白与人血管内皮生长因子165的融合蛋白，该融合蛋白在保持了人血管内皮生长因子165生理特性的基础上，増加了作用位点，延长了体内半衰期，具有优良的药学特性。该融合蛋白的基因序列及氨基酸序列如前所述。本发明的技术方案在前期的研究中本实验室保藏了重组质粒PIC9K_hVEGF165 以及pBluescript-HSA质粒。pBluescript-HSA质粒上只有ー个Bsu361I酶切位点在HSA 末端，设计含有HSA Bsu361I酶切位点及下游表达区序列的hVEGF165上游引物和含有NotI 酶切位点下游引物，扩增得到hVEGF165基因，然后通过限制性双酶切置入HSA下游，获得 HSA-hVEGF165融合基因，中间不含任何连接肽序列。将该融合基因插入到克隆载体，转化到宿主系统，融合基因就会整合到宿主的染色体中进行表达。
如此ー来，我们制备的人血清白蛋白的融合蛋白与人血管内皮生长因子165，包括与人血清白蛋白至少90%序列同源的第一区和与人血管内皮生长因子165至少90%序列同源的第二区；所述的与人血清白蛋白至少90%序列同源的的第一区位于融合蛋白的N末端，与人血管内皮生长因子165至少90%序列同源第二区位于融合蛋白的C末端，中间不加任何连接肽；或所述的与人血清白蛋白至少90%序列同源的的第一区位于融合蛋白的C末端，与人血管内皮生长因子165至少90%序列同源第二区位于融合蛋白的N末端，中间不加任何连接肽。优选的是所述的融合蛋白包括与人血清白蛋白至少95%序列同源的第一区和与人血管内皮生长因子165至少95%序列同源的第二区。所述的融合蛋白包括与人血清白蛋白氨基酸残基序列相同的第一区和与人血管内皮生长因子165氨基酸残基序列相同的第二区，或上述两区的功能等同物。所述的功能等同物是在不改变所述的融合蛋白特性的前提下，对融合蛋白的个别氨基酸的残基的取代、缺失或加入得到的多肽。本发明hVEGF165和HSA之间不加任何连接肽，可以避免因连接肽的加入而带来的融合蛋白稳定性和免疫源性方面的问题。本发明的第二个内容是提供表达该融合蛋白编码区的宿主和携带该融合蛋白编码区的重组表达载体。表达融合蛋白的宿主可以是細菌、酵母、动物細胞或植物細胞。表达出来的融合蛋白可以存在于宿主細胞内，也可以从宿主細胞中分泌出来；分泌所用的信号肽可以是天然的人血清白蛋白的信号肽，也可以是酿酒酵母阿尔法交配因子的信号肽，或者这两种信号肽的类似物；目的基因可以被整合到宿主的染色体中，也可以插入到质粒中。本发明优选的宿主系统是酵母表达系统，优选的酵母表达系统是毕赤酵母表达系统，优选的毕赤酵母表达系统是GS115和X33。这种表达系统除了具备原核表达系统的易操作、生长迅速、营养要求简单、易エ业放大的特点外，还具有真核細胞的蛋白后修饰系统，有利于大量生产高质量的重组蛋白。与宿主对应的表达载体大多可以购买商品化的，如毕赤酵母表达系统对应的载体，分泌型的有 PPIC9K、pHIL-Sl、pPICZa、pYAM75P6，胞内型有 pPIC3K、pPICZ、pHWOlO、 pGAPZ.pGAPZa等。优选的是毕赤酵母分泌型表达载体pPIC9K，它是酵母整合载体，带有组氨酸缺陷型的选择性标记基因HIS4、AOXl启动子、MFa分泌信号肽和G418抗性基因等元件。AOXl (醇氧化酶操纵子)5’序列、3’序列用于方便编码基因整合至酵母基因组和控制编码基因的表达。转化带有融合cDNA的表达载体到宿主細胞中，可以用锂盐法、PEG法、原生质体法、电穿孔法或化学转化等方法。转化之后，可以用多种方法鉴定是否成功，如提取基因组 DNA进行PCR鉴定，或者对细胞培养上清中的蛋白进行rhHSA抗体和rhVEGF165多抗检測。生产本发明的融合蛋白可以通过培养带有本发明构件的DNA的宿主系统来进行， 具体的培养方法可以用摇瓶或生物反应器。培养分为两个阶段宿主系统生长阶段和融合蛋白合成阶段。之后可以用各种蛋白分离的方法自含有本发明DNA构建体的細胞培养物中分离纯化融合蛋白，包括盐析、沉淀、超滤、层析、制备电泳等技术及这些技术的組合。
图1 图1 重组质粒pPIC9K-rhHSA/VEGF165物理图谱
图2 重组质粒pPIC9K-rhHSA/VEGF165的酶切鉴定M =DNA Ladder Marker ；1 pPIC9K-rhHSA/VEGF 165 经 EcoRI/NotI 双酶切；图3 融合蛋白的SDS-PAGE分析M 为低分子量蛋白质标准；1 :pPIC9K空质粒重组菌表达结果；2_9为 GSl 15 (pPIC9K-rhHSA/VEGF165 的发酵液上清)图4 =Blue-Sepharose层析纯化产物的SDS-PAGE分析M 低分子量蛋白质标准；1-3 :1M精氨酸洗脱收集液图5 重组蛋白对HUVEC細胞増殖的影响。增值率为加入重组蛋白与未加(100% ) 的百分比。图 6:重组蛋白的半衰期。A)rhVEGF165B)rhHSA/VEGF165。具体实施方法一、实验材料JM109 空菌、DH5a/pPIC9K、毕赤酵母 GS115 (his4Mut+)、PIC9K_rhVEGF165 以及pBluescript-HSA质粒为本实验室保藏；质粒抽提试剂盒、琼脂糖凝胶回收试剂盒购自上海生エ生物工程技术服务有限公司；PyrobestDNA聚合酶、限制性内切酶、 DNALadderMarker等购自宝生物工程(大连)有限公司；所有引物由上海生エ生物工程技术服务有限公司代为合成；所有测序服务由上海生エ生物工程技术服务有限公司完成。ニ、实验方法实施例1 :pPIC9K-HAS/VEGF165毕赤酵母表达质粒的构建。以PIC9K-rhVEGF165为模板，通过PCR扩增出rhVEGF165基因，引物如下上游引物5‘ -GCCCTTAGGCTTAGCACCCATGGCAGAAGGAGG-3 ‘(划线为Bsu361I酶切位点)下游引物5‘ -GTAGCGGCCGCTTACCGCCTCGGCTTGTCACAT-3 ‘(划线为NotI酶切位点)用2. 0%的琼脂糖凝胶电泳分析扩增結果，回收500bp左右的片断，用Bsu361I、 NotI对回收片断和pBluescript-HSA质粒进行双酶切，连接再转化到新鲜制作的JM109感受态細胞。挑选阳性转化子进行酶切验证。阳性重组子提取质粒再通过EcoRI/NotI双酶切获得片断插入到PPIC9K对应的酶切位点，获得正确的pPIC9K-rhHSA/VEGF165毕赤酵母表达质粒(图1)，并通过EcoRI/NotI双酶切(图2、及测序进行验证。实施例2 重组酵母表达系统构建及融合蛋白的表达；活化并过夜培养JM109 (pPIC9K-rhHSA/VEGF165)，提取的质粒，经SalI线性化，电击转化毕赤酵母65115，转化物涂布与含0.2511^/1111 G418的MD平板上，30°C培养72小吋， 挑取所有的长出的菌落到含0.5mg/ml G418的YPD平板上，30°C培养2_3天。挑取长势好的菌落到20ml液体YPD培养基中，30°C过夜培养，提取GSl 15全基因组DNA，PCR鉴定出阳性重组子，并把它保存在含20%甘油的YPD中，冻存于-80°C，命名为GSl 15 (pPIC9K_rhHSA/ VEGF165)。将GS115(pPIC9K-rhHSA/VEGF165)接种到装有 30ml BMGY (IOOmM 磷酸钾，PH 6.0; 1. 34% YNB ；4 X Kr5 %生物素；3%甘油)的250ml三角瓶中，215rpm，30°C培养24-36小时， 冷冻沉降菌体，弃去上清，加入25ml BMMY(100mM磷酸钾，PH 6. 0 ；1. 34% YNB ；4Χ1(Γ5%生物素；2.5%甲醇)。每对小时补加一次甲醇，诱导3天。SDS-PAGE检测重组融合蛋白的表达情况采用5%浓缩胶及12%分离胶的不连续垂直平板电泳，考马斯亮蓝R-250染色(图 3)。挑选表达量较高的菌株扩大培养，收集离心得上清，上清液经IOkDa分子截留量的膜超滤浓縮，再经Blue-Sepharose层析分离，IM精氨酸洗脱获得较纯的rhHSA/VEGF165融合蛋白(图4)实施例3 重组融合蛋白的活性评价；将人脐静脉内皮細胞HUVEC消化后用无生长因子培养基调整浓度至4X 104/ml， 每孔100 μ 1接至96孔培养板，于37°C培养Mh。将不同浓度的重组融合蛋白rhHSA/ hVEGF165、rhVEGF165加入至HUVEC继续培养Mh，MTT法观察重组蛋白对HUVEC增殖活性的影响。由结果可以看出rhHSA/hVEGF165基本保留了 rhVEGF165的活性(图5)。实施例4 重组融合蛋白的半衰期评价；将Iyg 的 rhVEGF165 或 4yg 的 rhHSA/VEGF165 分另丨」于 lmin，5min，15min， 30min, 60min, 2h，4h，8h，16h，32h进行小鼠尾静脉注射(每组三个平行)。眼球采血，用 VEGF165ELISA试剂盒进行VEGF165含量測定。发现融合蛋白(rhHSA/VEGF165)的半衰期为 4. 27h 约为 rhVEGF165 的 18. 6 倍(图 6)。
权利要求
1.人血清白蛋白与rhVEGF165的融合蛋白的基因序列和蛋白质序列，如下 (1)基因序列GATGCACACAAGAGTGAGGTTGCTCATCGATTTAAAGATTTGGGAGAAGAAAATTTCAAAGCCTTGGTGTTGA TTGCCTTTGCTCAGTATCTTCAGCAGTGTCCATTTGAAGATCATGTAAAATTAGTGAATGAAGTAACTGAATTTGCAAAAACATGTGTTGCT GATGAGTCAGCTGAAAATTGTGACAAATCACTTCATACCCTTTTTGGAGACAAATTATGCACAGTTGCAACTCTTCGTGAAACCTATGGTGAAATG GCTGACTGCTGTGCAAAACAAGAACCTGAGAGAAATGAATGCTTCTTGCAACACAAAGATGACAACCCAAACCTCCCCCGATTGGTGAGACCAGAG GTTGATGTGATGTGCACTGCTTTTCATGACAATGAAGAGACATTTTTGAAAAAATACTTATATGAAATTGCCAGAAGACATCCTTACTTTTATGCC CCGGAACTCCTTTTCTTTGCTAAAAGGTATAAAGCTGCTTTTACAGAATGTTGCCAAGCTGCTGATAAAGCTGCCTGCCTGTTGCCAAAGCTCGAT GAACTTCGGGATGAAGGGAAGGCTTCGTCTGCCAAACAGAGACTCAAGTGTGCCAGTCTCCAAAAATTTGGAGAAAGAGCTTTCAAAGCATGGGCA GTAGCTCGCCTGAGCCAGAGATTTCCCAAAGCTGAGTTTGCAGAAGTTTCCAAGTTAGTGACAGATCTTACCAAAGTCCACACGGAATGCTGCCAT GGAGATCTGCTTGAATGTGCTGATGACAGGGCGGACCTTGCCAAGTATATCTGTGAAAATCAAGATTCGATCTCCAGTAAACTGAAGGAATGCTGT GAAAAACCTCTGTTGGAAAAATCCCACTGCATTGCCGAAGTGGAAAATGATGAGATGCCTGCTGACTTGCCTTCATTAGCTGCTGATTTTGTTGAA AGTAAGGATGTTTGCAAAAACTATGCTGAGGCAAAGGATGTCTTCCTGGGCATGTTTTTGTATGAATATGCAAGAAGGCATCCTGATTACTCTGTC GTGCTGCTGCTGAGACTTGCCAAGACATATGAAACCACTCTAGAGAAGTGCTGTGCCGCTGCAGATCCTCATGAATGCTATGCCAAAGTGTTCGAT GAATTTAAACCTCTTGTGGAAGAGCCTCAGAATTTAATCAAACAAAATTGTGAGCTTTTTGAGCAGCTTGGAGAGTACAAATTCCAGAATGCGCTA TTAGTTCGTTACACCAAGAAAGTACCCCAAGTGTCAACTCCAACTCTTGTAGAGGTCTCAAGAAACCTAGGAAAAGTGGGCAGCAAATGTTGTAAA CATCCTGAAGCAAAAAGAATGCCCTGTGCAGAAGACTATCTATCCGTGGTCCTGAACCAGTTATGTGTGTTGCATGAGAAAACGCCAGTAAGTGAC AGAGTCACCAAATGCTGCACAGAATCCTTGGTGAACAGGCGACCATGCTTTTCAGCTCTGGAAGTCGATGAAACATACGTTCCCAAAGAGTTTAAT GCTGAAACATTCACCTTCCATGCAGATATATGCACACTTTCTGAGAAGGAGAGACAAATCAAGAAACAAACTGCACTTGTTGAGCTCGTGAAACAC AAGCCCAAGGCAACAAAAGAGCAACTGAAAGCTGTTATGGATGATTTCGCAGCTTTTGTAGAGAAGTGCTGCAAGGCTGACGATAAGGAGACCTGC TTTGCCGAGGAGGGTAAAAAACTTGTTGCTGCAAGTCAAGCTGCCTTAGGCTTAAAAAGAGCACCCATGGCAGAAGGAGGAGGGCAGAATCATCACGAAGTGGTGAAGTTCATGGATGTCTATCAGCGCAGCTACTGCCATCCAATCGAGACCCTGGTGGACATCTTCCAGGAGTACCCTGATGAGATCGAG TACATCTTCAAGCCATCCTGTGTGCCCCTGATGCGATGCGGGGGCTGCTGCAATGACGAGGGCCTGGAGTGTGTGCCCACTGAGGAGTCCAACATC ACCATGCAGATTATGCGGATCAAACCTCACCAAGGCCAGCACATAGGAGAGATGAGCTTCCTACAGCACAACAAATGTGAATGCAGACCAAAGAAA GATAGAGCAAGACAAGAAAATCCCTGTGGGCCTTGCTCAGAGCGGAGAAAGCATTTGTTTGTACAAGATCCGCAGACGTGTAAATGTTCCTGCAAA AACACAGACTCGCGTTGCAAGGCGAGGCAGCTTGAGTTAAACGAACGTACTTGCA gatgtgacaagccgaggcgg (2)氨基酸序列DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLF⑶K LCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAF TECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLA KYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTL EKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYL SVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMD DFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGLKRAPMAEGGGQNHHEVVKFMDVYQRSYCHPIETLVDIFQEYPDEIEYIFKPSCVPLMRCG GCCNDEGLECVPTEESNITMQIMRIKPHQGQHIGEMSFLQHNKCECRPKKDRARQENPCGPCSERRKHLFVQDPQTCKCSCKNTDSRCKARQLELN ERTCRCDKPRR。
2.人血清白蛋白与人血管内皮生长因子165的融合蛋白的制备方法，其特征是人血清白蛋白融合与rhVEGF165基因，中间不加任何连接肽对应的核苷酸序列；得到的rhHSA/ VEGF165融合基因插入到克隆载体，转化到宿主系统中进行表达，融合基因被整合到宿主的染色体中。
3.权利要求1和2所述的人血清白蛋白与人血管内皮生长因子165的融合蛋白，其特征是包括与人血清白蛋白至少90%序列同源的第一区和与人血管内皮生长因子至少 90%序列同源的第二区；所述的第一区位于融合蛋白的N或C末端，第二区位于另外一端， 中间不加任何连接肽。
4.权利要求1、2和3所述的人血清白蛋白与人血管内皮生长因子165的融合蛋白，其特征是所述的融合蛋白包括与人血清白蛋白氨基酸残基序列相同的第一区和与人血管内皮生长因子165氨基酸残基序列相同的第二区，或上述两区的功能等同物。
5.权利要求4所述的人血清白蛋白与人血管内皮生长因子165的融合蛋白，其特征是所述的功能等同物是在不改变所述的融合蛋白特性的前提下，对融合蛋白的个别氨基酸的残基的取代、缺失或加入得到的多肽。
6.权利要求1、2或3所述的人血清白蛋白与人血管内皮生长因子165的融合蛋白，其特征是提供携帯编码融合蛋白的基因序列的重组表达载体，pPIC9K-rhHSA/VEGF165。
7.权利要求1、2或3所述的人血清白蛋白与人血管内皮生长因子165的融合蛋白，其特征是表达融合蛋白的宿主优选是酵母，酵母中优选毕赤酵母，毕赤酵母中优选是GS115， X-33。
8.权利要求1、2或3所述的人血清白蛋白与人血管内皮生长因子165的融合蛋白在替代rhVEGF165中的应用。
全文摘要
人血管内皮生长因子165与人血清白蛋白的融合蛋白及其制备属于长效重组融合蛋白药物技术领域，药物蛋白与HSA的融合使得药物成为长效药物。本发明提供了hVEGF165与HSA生理特性于一体的人血清白蛋白与人血管内皮生长因子165的融合蛋白及其表达载体，表达的重组融合蛋白在保持了人血管内皮生长因子165生理特性的基础上，增加了作用位点，延长了体内半衰期，具有优良的生理学特性。
文档编号A61P7/02GK102586298SQ20111045520
公开日2012年7月18日 申请日期2011年12月31日 优先权日2011年12月31日
发明者戴慧云, 朱瑞宇, 李琪, 金坚 申请人:无锡瑞融生物医药有限公司