专利名称：一种治疗冻伤的黄酮类药剂的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种治疗冻伤的黄酮类药剂的制备方法。
背景技术：
冻伤的化学药物治疗一般常用留体类抗炎药、非留体类抗炎药、血管活性药、抗血小板药及扩充血容量药物等。冻伤的中药治疗要求祛寒、行血化瘀、软化损伤组织、改进血液循环和防止感染等。传统的治疗冻伤的方法很多，有的以十滴水、复方山莨菪碱溃疡性冻疮膜、山莨菪碱、中草药冻疮膏、冻伤涂膜剂、冻疮灵、风痛灵、辣椒软膏等对冻伤进行治疗；有的用家传桃桂汤(含桃仁、桂枝、生姜等)治疗冻伤；有的用当归、川芎、红花、防风、荆芥、羌活、独活、白芷、芫花、甘草等同煎擦洗患处，治疗冻伤；有的用透骨草、伸筋草、海桐皮、络石藤、艾叶、苏木、红花、鸡血藤、延胡索、五灵脂等置中等火焰上熬煮20min，熏后浸洗，五天为一疗程，治愈；有的用红花、赤芍、白鲜皮水煎去渣浸创面，治疗冻伤；有的用甘草桂枝桔皮汤，即甘草、桂枝、桔皮加水煎煮，待温热时熏洗患处治疗冻伤；有的用桂苏酒，即桂枝、苏木、各100g，细辛、艾叶、当归、生姜、花椒、樟脑、辣椒以酒精浸泡7天。无皮损者，外擦治疗冻疮；有的用红灵酒，即当归、肉桂、红花、花椒、干姜、樟脑、细辛等以酒精浸泡7d治疗冻疮；有的自制冻疮酒，即大黄、黄柏、天冬、麦冬、辣椒、麻黄、干姜、甘草等用白酒渗漉，使用时温水涂于患处，适于未破溃者；有的用松香、腊梅花等中药醇浸物治疗冻伤。有的用云南白药酊治疗冻疮；有的用复方当归软膏治疗冻伤；有的用复方红花软膏治疗冻疮，据记载有效率达93.6% ;有的以细辛、川椒、桂枝、秦究、白芷、三七、生大黄、丹参、生甘草、樟脑等制成乳膏，外涂治疗冻伤；有的由干辣椒、醋酸洗必泰、樟脑、干姜等自制冻疮涂膜剂，治疗冻疮；樱桃泡酒治疗冻伤已被民间广泛应用且效果显著，多种刊物上已有科普记载；有的曾取红色较深的鲜樱桃数枚，视涂搽面积而定，用手搓烂，去核取汁，涂搽于冬日生冻疮之处，同时按揉并晒干，24h后洗去，防治冻疮百余例，疗效显著且不易复发。鲜樱桃浸入80%的酒精中浸泡7天，涂抹冻伤处，对 初起冻伤可根治。中药治疗冻伤的有效经验方很多，但现有的制剂多停留在医院处方制剂水平上，不能广泛推广使用。而且，现有制剂组方复杂，基础研究欠缺，且以传统剂型为主。传统剂型存在着一定缺陷，如汤剂使用不方便，酒剂、酊剂对皮肤有一定刺激性，皮肤有破损、溃疡、创面则不宜涂敷；不宜用于已破溃的冻疮，且容易引起接触性皮炎等缺点。
发明内容
本发明的目的在于提供一种成分单一、疗效确切、使用方便治疗冻伤的中药新药的一种治疗冻伤的黄酮类药剂的制备方法。本发明采用药食同源的植物毛楼桃(Prunus tomentosa Thunb, PTTT),又称山楼桃、野樱桃，属蔷薇科野生或半野生植物，广泛分布于我国的华北、西北及东北各地。单一的植物经科学方法提取有效抗冻伤活性成分，经动物实验疗效确切，组方简单、科学合理、使用方便、有利于推广应用。本发明采用如下技术方案:黄酮类药物的制备:①原材料:毛樱桃提取物中抗冻伤的活性成份是黄酮类化合物(PrunusTomentosa Thunb Total Flavone7PTTTF) 采用紫外波谱分析、盐酸-镁粉反应、三氯化招络合反应、铅盐反应定性为黄酮类。②提取活性成分时，所用试剂为75%乙醇。③提取工艺步骤:称取鲜毛樱桃洗净捣烂，去核得原液约，以1: 4体积比加入含I %盐酸的75 %乙醇，超声频率为40KHZ，提取10-60min，回流提取l_6h，减压浓缩使含醇量达75 %，然后避光静置6-18h (蛋白质、多糖等沉淀除去)，滤去沉淀，滤液置于旋转蒸发仪减压浓缩至近干。将浓缩物混悬分散于水中，过滤去除不溶物，滤液装聚酰胺柱，加聚酰胺30倍量的水洗脱，弃去洗脱液，再加90%乙醇洗脱，至洗脱液无色，收集洗脱液并减压浓缩，将浓缩物真空冷冻干燥，即得黄酮类药物。所述药物可以制成软膏剂，软膏剂的制备:①主药成分为毛樱桃活性提取物总黄酮；②处方中其它物料，单硬脂酸甘油酯，硬脂酸，白凡士林，液体石蜡，甘油，三乙醇胺，尼泊金乙酯，十二烷基硫酸钠，蒸馏水；③制备工艺，将单硬脂酸甘油酯，硬脂酸，甘油，黄酮类药物(油相)置于蒸发皿中，于80°C水浴上熔化，再将白凡士林，液体石蜡，`十二烷基硫酸钠，三乙醇胺，尼泊金乙酯(水相)于水浴上加热至80°C，将水相加入油相溶液中，边加边向同一方向搅拌至均匀。保持于80°C搅拌I 2分钟，然后转移至冷水浴中搅拌至室温即得。④工艺条件，温度80°C、洁净环境条件下制备；本发明的药物及其制剂主要用途是对冻伤具有明确的治疗作用。毛樱桃醇提取物的主要成分为黄酮类物质，经紫外-可见光扫描图谱显示很有可能为异黄酮、二氢黄酮及二氢黄酮醇类。醇提取工艺简单，无环境污染。聚酰胺柱色谱分离纯化黄酮特异性高，产量较大，可以用来大量制备。使用时配制成IOmg πιΓ1，并调节pH至近中性，外用。配制的软膏呈乳白色偏黄色，润滑，易于涂布，细腻，无粗糙感，性质稳定。放置一段时间后，不发生油水分离(破乳)。使用方便，易于清洗，不污染衣物。根据动物实验观察:①毛樱桃提取物黄酮类对兔耳局部冻伤的影响；以右耳做自身对照，造模后2h可见每组家兔左右耳均红肿，且左右耳肿胀程度无明显差异，毛樱桃提取物组局部给药第四天，可明显抑制治疗耳(左耳)炎症局部毛细血管舒张、充血和水肿，而冻伤模型对照耳(右耳)炎症局部毛细血管舒张、充血、水肿及青紫比较明显，治疗耳与对照耳比较，肿胀程度具有极显著差异(P <0.001)，肿胀抑制率为26.84%，较阳性对照组(肿胀抑制率为21.87%)治疗作用明显；给药第七天，毛樱桃提取物组治疗耳充血水肿基本消退，治疗耳与对照耳比较，肿胀程度具有极显著差异(P
<0.001)，肿胀抑制率为32.52%，较阳性对照组(肿胀抑制率29.68% )治疗作用更明显，对兔耳轻、中度冻伤有显著的治疗作用。组织病理学可见:毛樱桃提取物组，Control耳光镜下可见大量中性粒细胞渗出，红细胞浸润，组织疏松水肿，而治疗耳镜下中性粒细胞少量渗出，无组织水肿；阳性对照组对照耳，光镜下可见大量中性粒细胞渗出，红细胞浸润，组织疏松水肿，治疗耳镜下中性粒细胞少量渗出，组织水肿较轻。②毛樱桃提取物黄酮类对小鼠巴豆油耳肿胀、角叉菜胶足肿胀、毛细血管通透性等影响；结果表明:与阴性对照组比较，毛樱桃提取物50mg.kg-1能明显减轻巴豆油所致的小鼠耳肿胀(P < 0.05)，肿胀抑制率为16.91%，毛樱桃提取物IOOmg *kg-l显著抑制巴豆油所致的小鼠耳肿胀(P < 0.01)，抑制率达25.23%，并有剂量依赖趋势(见图1)。结果表明:与Control组比较,毛楼桃提取物的IOOmg *kg-l剂量组均能明显减轻角叉菜胶所致的小鼠左腿炎症反应，红、肿等症状，显著抑制角叉菜胶所致的小鼠足肿胀(P< 0.001)，抑制率达 57.82%。毛樱桃提取物对醋酸所致小鼠腹腔毛细血管通透性增高的影响结果表明:与阴性对照组比较，毛樱桃提取物IOmg.kg-Ι对小鼠腹腔毛细血管通透性抑制率为12.2% (P > 0.05)，毛樱桃提取物50mg.kg-1对小鼠腹腔毛细血管通透性抑制率为20.67% (P < 0.05)，毛樱桃提取物IOOmg.kg-Ι对小鼠腹腔毛细血管通透性抑制率为37.6% (P < 0.01)，具有剂量依赖性(见图2)。③毛樱桃提取物黄酮类对冻伤小鼠血清PGE2、MDA、NO、TNF- a、IL-6含量及SOD活性的干预；通过对小鼠足部冻伤组织匀浆检测结果表明，与模型对照组比较，毛樱桃提取物可明显抑制小鼠足部冻伤组织中PGE2生成，毛樱桃提取物IOOmg.kg-Ι对PGE2生成的抑制率为 52.36% (P < 0.001)。实验结果表明:与模型对照组比较，毛樱桃提取物可明显抑制冻伤小鼠血中MDA生成，毛樱桃提取物IOOmg.kg-Ι对MDA生成的抑制率为71.92% (P < 0.001)。结果表明:与模型对照组比较，毛樱桃提取物可明显提高冻伤小鼠血清SOD活性，毛樱桃提取物IOOmg.kg-Ι对SOD活性的提高百分率为12.31% (P < 0.01)。结果表明:与模型对照组比较，毛樱桃提取物可明显减少冻伤小鼠血清中NO含量，毛樱桃提取物IOOmg.kg-Ι对NO生成的抑制率为47.56% (P < 0.001)。④毛樱桃提取物黄酮类对冻伤小鼠白细胞中IL-6及小鼠冻伤组织中MMP-9表达的干预。实验通过免疫组织化学手段对动物冻伤组织进行分析，以出现棕黄色物质为表达阳性，结果可见:小鼠足部冻伤组织MMP-9的蛋白表达主要分布于皮下胶原细胞及血管内皮中。空白对照组小鼠足组织MMP-9表达不明显(如图3)。未见棕黄色、颗粒状染色区。模型对照组小鼠足组织浸润的炎性细胞、新生血管的内皮细胞胞浆及胶原纤维中MMP-9表达显著增强，尤以溃疡坏死区及新生血管内皮区域为甚，呈棕黄色颗粒状，染色浓密(如图
4);阳性对照组和PTTTF组的MMP-9表达明显弱于模型对照组，且炎性细胞少见(如图5、6)。结论: 毛樱桃提取物黄酮类对冻伤具有明确的治疗作用，并有明确的抗炎作用、镇痛作用和免疫调节作用。其主要作用可能是由于抑制TNF-a、IL-1 β、IL-6、PGE2、N0、MDA的生成及抑制MMP-9和提高SOD活性而实现的。临床案例:(病例观察:由北华大学附属医院提供。)78例门诊患者，均为局部非冻结性冻伤，其中男38例，女40例；年龄最小6岁，最大者64岁。I度冻伤(冻伤局部红肿、发痒、轻微刺痛或麻木)36例；II度冻伤(局部剧烈烧灼感，但感觉迟钝，有明显红肿，并出现水泡)32例。冻伤部位分别为耳部、面部、手部、足部。治疗方法:处方:单硬脂酸甘油酯4.5g硬脂酸IOg白凡士林5g液体石蜡15ml甘油IOg三乙醇胺0.22ml尼泊金乙酯0.5g 十二烧基硫酸钠0.22g蒸馏水50m l药物Ig取制备的毛樱桃提取物软膏剂，I度冻伤直接涂抹患处，然后用灭菌纱布包裹，每日2次；II度冻伤先在无菌的条件下操作，抽出水泡内的水，然后涂抹药物于患处，并用无菌纱布包裹，每日2-3次。7天为一个疗程。治疗结果:—疗程治愈48例,两疗程治愈26例,三疗程治愈4例。
图.1毛樱桃提取物对小鼠巴豆油耳肿胀的影响其中:i±s,η = 10，* P < 0.05，* * P < 0.01，* * * P < 0.001图2毛樱桃提取物对醋酸所致小鼠腹腔毛细血管通透性增高的影响其中士s ,η = 10，**Ρ < 0.01，***Ρ < 0.001 图3为空白对照组毛樱桃提取物对小鼠冻伤组织中ΜΜΡ-9表达的影响(X400)
图4为模型对照组毛樱桃提取物对小鼠冻伤组织中ΜΜΡ-9表达的影响(Χ400)图5为毛樱桃总黄酮组毛樱桃提取物对小鼠冻伤组织中ΜΜΡ-9表达的影响(Χ400)图6为阳性对照组毛樱桃提取物对小鼠冻伤组织中ΜΜΡ-9表达的影响(Χ400)
具体实施例方式下面通过具体实施例来进一步阐释本发明，但本发明的内容不限于此。实施例1称取鲜毛樱桃500g洗净捣烂，去核得原液约400ml，以1: 4体积比加入含I %盐酸的75%乙醇，超声频率为40KHz，提取40min，回流提取2h，减压浓缩使含醇量达75%，然后避光4°C静置12h(蛋白质、多糖等沉淀除去)，滤去沉淀，滤液置于旋转蒸发仪减压浓缩至近干。将浓缩物混悬分散于水中，过滤去除不溶物，滤液装聚酰胺柱，加聚酰胺30倍量的水洗脱，弃去洗脱液，再加90%乙醇洗脱，至洗脱液无色，收集洗脱液并减压浓缩，将浓缩物真空冷冻干燥，即得黄酮类药剂。采用HPLC法，以芦丁为对照品，测得冷冻干燥物中总黄酮含量为68.3%，折合生药含总黄酮量0.61%。实施例2软膏剂黄酮类药剂的制备:
将实施例1制得的黄酮类药物与单硬脂酸甘油酯，硬脂酸，甘油(油相)置于蒸发皿中，于80°C水浴上熔化，再将白凡士林，液体石蜡，十二烷基硫酸钠，三乙醇胺，尼泊金乙酯(水相)于水浴上加热至80°C，将水相加入油相溶液中，边加边向同一方向搅拌至均匀。保持于80°C搅拌I 2分钟，然后转移至冷水浴中搅拌至室温即得。
权利要求
1.一种治疗冻伤的黄酮类药剂的制备方法，包括以下步骤: 称取鲜毛樱桃洗净捣烂，去核得原液约，以1: 4体积比加入含1%盐酸的75%乙醇，超声频率为40KHz，提取10-60min，回流提取l_6h，减压浓缩使含醇量达75%，然后避光静置6-18h滤去沉淀，滤液置于旋转蒸发仪减压浓缩至近干；将浓缩物混悬分散于水中，过滤去除不溶物，滤液装聚酰胺柱，加聚酰胺30倍量的水洗脱，弃去洗脱液，再加90 %乙醇洗脱，至洗脱液无色，收集洗脱液并减压浓缩，将浓缩物真空冷冻干燥，即得黄酮类药物。
2.权利要求1所述的一种治疗冻伤的黄酮类药剂的制备方法，其特征在于，所述黄酮类药剂可以为软膏剂。
3.权利要求2所述的一种治疗冻伤的黄酮类药剂的制备方法，其特征在于，所述软膏剂采用如下工艺制取: 将单硬脂酸甘油酯，硬脂酸，甘油，黄酮类药物置于蒸发皿中，于80°C水浴上熔化，再将白凡士林，液体石蜡，十二烷基硫酸钠，三乙醇胺，尼泊金乙酯于水浴上加热至80°C，将水相加入油相溶液中，边加边向同一方向搅拌至均匀；保持于80°C搅拌I 2分钟，然后转移至冷水浴中搅拌至室 温即得软膏剂。
全文摘要
本发明涉及一种治疗冻伤的黄酮类药剂的制备方法，称取鲜毛樱桃洗净捣烂，去核得原液约，以1∶4体积比加入含1％盐酸的75％乙醇，超声频率为40KHz，提取10-60min，回流提取1-6h，减压浓缩使含醇量达75％，然后避光静置6-18h滤去沉淀，滤液置于旋转蒸发仪减压浓缩至近干。将浓缩物混悬分散于水中，过滤去除不溶物，滤液装聚酰胺柱，加聚酰胺30倍量的水洗脱，弃去洗脱液，再加90％乙醇洗脱，至洗脱液无色，收集洗脱液并减压浓缩，将浓缩物真空冷冻干燥，即得。本发明提供了一种成分单一、疗效确切、使用方便的治疗冻伤的黄酮类药剂。
文档编号A61K9/06GK103181961SQ201110455480
公开日2013年7月3日 申请日期2011年12月30日 优先权日2011年12月30日
发明者张成义, 王喜斌, 陈曦 申请人:北华大学