人成纤维细胞生长因子21融合蛋白及其突变体的制备与应用的制作方法

专利名称：人成纤维细胞生长因子21融合蛋白及其突变体的制备与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及人糖尿病和肥胖症的预防及治疗药物。具体的，本发明提供一种用于检测和治疗人I型或II型糖尿病，以及肥胖症的融合蛋白及其制备方法和应用。所述融合蛋白含有人FGF21或其突变体和人IgG2-Fc(铰链区-CH2_CH;3)或IgG2_Fc突变体 (T250Q/M428L ；T307Q/N434A)，能有效改善肥胖症患者的生存状况，降低糖尿病患者的血糖水平，增强胰岛素的敏感性，同时增加FGF21体内的半衰期，尤其是FGF21及突变体与 IgG-Fc (T250Q/M428L ；T307Q/N434A)突变体融合蛋白，增强与Fcfoi亲和力，进一步增加 FGF21的体内半衰期。
背景技术：
Testuya Nishimura等在2000年首先报道了人FGF21基因。该基因定位于人 α 1,2-墨角藻糖基转移酶基因的5’侧翼区，编码一个209个氨基酸大小的蛋白多肽，正常情况下特异性表达于肝脏中，蛋白N端前观个氨基酸为引导肽，使FGF21分泌到细胞外。 FGF21属于由FGF19、FGF21和FGF23的成纤维细胞生长因子(FGF)构成的亚家族的分泌多肽(Itoh 等，2004，Trend Genet. 20 :563-69)。FGF21 与 FGF19 的同源性比较高，FGF19 已经证明可以调节内分泌代谢，据此研究人员推测FGF21可能也具有相应的能力。FGF21是非典型的FGF，因为它不依赖于肝素，并且在葡萄糖、脂质和能量代谢的调节中起激素的作用。2005年，来自Lilly公司的研究人员Alexei Kharitonekov等首先在细胞水平和生物水平两方面对FGF21的生物学活性展开研究。他们用FGF21处理脂肪细胞二4小时后发现FGF21刺激后的脂肪细胞表现出明显葡萄糖吸收能力，但与胰岛素的作用现象不同， 在加入胰岛素刺激后，细胞很快出现葡萄糖吸收作用，而FGF21则需要持续作用4小时以上才能达到相似的结果。同样的结果也在动物实验上得到体现。而且FGF21还表现出一些很有意义的特点科研人员对健康鼠、糖尿病鼠及过表达该基因的转基因小鼠的研究发现，任何剂量的FGF21均未引起小鼠体重增加或导致低血糖症现象出现，这再一次提示FGF21可能不依赖于胰岛素途径来调节血糖。从肝cDNA文库中分离出作为肝分泌因子的FGF21。它在肝和胰腺中高表达，并且是主要在肝中表达的FGF家族的唯一成员。过量表达FGF21的转基因小鼠具有生长速率缓慢、血浆葡萄糖和甘油三酯水平低下的代谢表型，并且不存在年龄相关性II型糖尿病、胰岛增大和肥胖症。在啮齿动物和灵长类模型中药物性给予重组FGF21蛋白导致血浆葡萄糖水平正常化、甘油三酯和胆固醇水平降低以及葡萄糖耐量和胰岛素敏感性得到改善。另外， FGF21通过增加能量消耗、体力活动和代谢率而减轻体重和体脂肪。实验研究为药物性给予 FGF21以治疗人的II型糖尿病、肥胖症、脂血症和其它代谢状况或代谢紊乱提供了支持。FGF21除直接调节血糖水平外，还可以激活胞外信号途径并改善胰腺细胞功能。据报道，FGF21可以提高正常小鼠胰岛素mRNA水平和蛋白水平，同时激活细胞外信号调节激酶1/2和Akt信号途径，但无诱导胰岛素分泌功能。FGF21处理的糖尿病啮齿动物，可以提高胰岛素量和葡萄糖诱导胰岛素分泌。正常或糖尿病小鼠进行FGF21治疗后，胰岛素水平， 葡萄糖清除率都得到改善。而且未发现胰岛细胞增殖。由此推测FGF21对胰腺的作用可能得益于其在内环境稳定中起到的有益作用。另外，FGF21对糖脂毒性和细胞因子诱导的胰岛细胞调亡也有局部保护作用。FGF21对血脂也有一定的调控作用。研究表明长期注射FGF21糖尿病恒河猴体内， 除血糖水平得到控制外，脂蛋白代谢也得到改善，尤其是特异性的降低低密度脂蛋白胆固醇及升高高密度脂蛋白胆固醇水平，由此可见FGF21在整个内分泌过程中的重要作用。此夕卜，HajimeYamauchi等通过对斑马鱼FGF21的研究发现，敲除FGF21基因的斑马鱼胚胎红细胞生成能力受到明显抑制，而该现象在向胚胎注入FGF21后得到改善。不仅如此，缺少 FGF21的斑马鱼胚胎在粒细胞的生成也受到干扰，因此FGF21可能在动物体内的骨髓-红系祖细胞的分化中起到决定性作用。由于FGF家族成员大都具有促细胞分裂即促肿瘤生成的作用。而且，研究人员发现与FGF21结构相似的FGF19能使小鼠肝细胞增生，因此FGF21安全性是决定它是否能够成为候选糖尿病药物的关键因素。到目前为止，所有的研究都证明FGF21是非常安全的。研究人员在被FGF21长期处理的3T3-L1细胞、NIH3T3细胞、人脐静脉上皮细胞(HUVECs)等细胞上没有发现增殖现象，而且长期注射FGF21的小鼠、恒河猴及转基因小鼠也没有任何组织增生现象发生。除了在糖尿病领域的研究外，FGF21还在其他几个方面给我们带来了振奋人心的结果。Xinqing Huang等利用二乙基亚硝胺作用于肝细胞大量表达FGF21的转基因小鼠，令人惊奇的是与裸鼠相比，转基因小鼠能明显地延缓腺瘤的发生时间，虽然两者在肝癌发生时间上并无太大区别，但是该结果也证明FGF21并不像FGF家族其他成员那样具有癌症因子的恶名。Alexei Kharitonenkov等对FGF21生物功能进行研究时发现，FGF21能够使 FGFR-I (成纤维细胞生长因子受体1)和FGFR-2 (成纤维细胞生长因子受体2、磷酸化，但是这一过程并不需要肝磷脂的参与，这与以往对FGF家族成员的认识不符。而且FGF21只能对脂肪细胞起作用而不能促进前脂肪细胞产生葡萄糖吸收作用，Yasushi Ogawa等通过对不同分化时期的脂肪细胞研究发现beta-klotho在脂肪细胞分化过程中表达量从无到有，因此推测beta-klotho的存在与否可能决定了 FGF21信号传递过程是否通畅，随后的试验也证明了这一推断，免疫沉淀检测到FGF21受体复合物中包含了 beta-klotho，而且抑制 beta-klotho表达的脂肪细胞不能对FGF21的刺激起反应，因此beta-klotho取代肝磷脂参与FGF21的信号传递过程。人FGF21具有短的体内半衰期。在小鼠中，人FGF21的半衰期为1_2小时，在猕猴体内半衰期为2. 5-3小时。在开发在II型糖尿病的治疗中用作药物的FGF21蛋白时， 可能需要延长半衰期。具有半衰期延长的FGF21蛋白，可允许较低频率的给药。因此，如何在不影响FGF21生物活性的同时增加在体内的半衰期，是众多科学家研究的焦点。如US patent757619或US patent20040558862中描述的FGF21白蛋白融合蛋白或FGF21融合 IgG，能明显的增强其在体内的半衰期。半衰期延长是由于Fc与Fcfoi的结合，使IgG获得了保护，同时增力口在体内的循环时间(Derry C. Roopenian等人，Nature Reviews Immunology 7,715-725)。
IgG-Fc是被广泛使用的延长肽类、细胞因子和可溶性受体类体内半衰期的融合蛋白。在IgG中，位于Fc上CH2和CH3域之间的位点(图1B)介导与新生受体Fcfoi的相互作用，其中结合可以让来自内体的内吞抗体再循环到血流中(Raghavan et al. ,1996,Annu Rev Cell Dev Biol 12 :181-220 ；Ghetie et al,2000, Annu Rev Immunol 18:739-766)。 上述过程结合大分子减少肾脏滤过作用，产生1-3周的体内血清半衰期。Fc与Fcfoi的结合在抗体转运中也起关键作用。Fc上结合Fcfoi的位点也是细菌蛋白A和G结合的位点。与这些蛋白的紧密结合通常可以用作蛋白纯化，使用蛋白A或蛋白G亲和色谱法纯化抗体Fc 的方式。因此，Fcfoi受体也负责将与其结合的Fc融合蛋白转移到新生儿的肠道和成年人的肠上皮月空中(Ghetie and Ward, Annu. Rev. Immunol.，2000，18 :739-766 ；Yoshida et al.， Immunity,2004,20(6) :769-783)。人Fc γ的突变研究过程中，已经对结合Fcfoi重要的一些残基进行了研究，结果表明他们能明显的增加血清半衰期。Hinton等在人Fc Yl中逐一地将三个残基突变成了另外19种常见的氨基酸。他们发现一些双重点突变体增加了 Fcfoi结合亲和力，其中T250Q/ M428L位点的双突变能显著提高Fc与Fcfoi的亲和力效果，进而明显提高在体内的半衰期。 另外，HenryB. Lowman等通过突变IgG-Fc的T307Q/N434A位点，同样能明显的增强体内血清半衰期。这些实验都通过猴的体内药物代谢实验得到了证实。另外，还可以增加融合蛋白或抗体的跨细胞作用(Transcytosis)和组织的通透性，增加体内组织系统对药物的暴露，最大程度的发挥药效(Hinton et al.，2004，J. Biol. Chem. 279 (8) :6213-6216 ；Henry B. Lowman et al. , Cancer Research. 70 (8) :3269-3277)。

发明内容
本发明涉及预防和治疗I型和II型糖尿病的融合蛋白和生产方法。本发明的组合物包含新的FGF21融合蛋白及其突变体。该融合蛋白含有与IgG重链恒定(Fe)区融合的 FGF21分子或者其类似物或片段。该IgG为人源的，可以选自IgGl、IgG2或IgG4。本发明的融合蛋白在本发明中被称为 FGF21/IgG-Fc 或 FGF21/IgG-Fc(T250Q/M^8L ；QL)或 FGF21/ IgG-Fc突变体。在本发明的其他方面，该融合蛋白的突变体为FGF21/IgG-Fc(QL)或FGF21/ IgG-Fc (QA)等，含有IgG-Fc T250Q, M428L, T307Q和N434A突变位点中的任意一个或者多个突变组合以及FGF21的突变体。本发明的融合蛋白及其突变体在受试者中对I型和II型糖尿病的治疗有效。同样地，本发明提供了用于治疗受试者的I型和II型糖尿病的方法，其中如果需要给受试者使用所述的融合蛋白及其突变体。本发明还提供了使用哺乳动物表达和细菌培养系统，制备本发明的FGF21/IgG_Fc 及突变体融合蛋白的新方法。在这两种系统中，培养细胞克隆以制备包括FGF21/IgG-Fc及突变体融合蛋白以及有效延长体内半衰期的突变体型，例如但不限于FGF21/IgG-Fc (QL)， FGF21(P171A)/IgG-Fc (QL)和FGF21/IgG_Fc (QA)。增强Fcfoi受体的结合，延长体内血清滞留时间。本发明的二价FGF21/IgG_Fc及其突变体融合蛋白具有独特的特点1.增加了 FGF21的体内循环半衰期tl/2，尤其是FGF21/1 gG_Fc (QL)，FGF21 (P 171 A) /1 gG-Fc ^L)或 FGF21 /1 gG-Fc (QA)能明显的进一步增加了 FGF21 在体内的半衰期；2.增强FGF21的体内稳定性，有效减少蛋白的降解和聚集；3.提高与Fcfoi的亲和力，增强FGF21体内组织系统的穿透性和跨细胞作用，提高药物的效果，减少药物的注射频次，减轻患者的疼痛和降低治疗成本；4.通过生物工程方法生产，有利于获得生物活性更高的蛋白。用于大规模制备的简便的一步ftx)tein A提纯。可以将本发明的融合蛋白按需要以多种形式提供给受试者。本发明的一方面提供了一种用于受试者控制血糖平衡的FGF21融合蛋白。本发明的一方面提供了一种用于控制受试者血糖浓度的FGF21融合蛋白。本发明的一方面提供了一种异源性融合蛋白，该融合蛋白含有与IgG多肽融合的 FGF21多肽或其变异体，其中所述的IgG。根据本发明的一方面，所述IgG-Fc是人IgGl、IgG2或IgG4，及上述的突变体。根据本发明的一方面，所述IgG-Fc是人源IgGl-Fc、IgG2_Fc或IgG4_Fc的杂合体。根据本发明的一方面，所述FGF21多肽选自由FGF21 (SEQ ID No. 1)及其片段和突变体组成的组。根据本发明的一方面，所述FGF21突变体选自如下任意一个突变或多突变的任意组合，突变位点选自(a) 45位点丙氨酸突变为精氨酸，谷氨酸，谷氨酰胺，赖氨酸或苏氨酸；(b)98位点亮氨酸突变为精氨酸，谷氨酸，谷氨酰胺，赖氨酸或苏氨酸；(c) 111位点丙氨酸突变为苏氨酸或赖氨酸；(d) 129位点丙氨酸突变为精氨酸，天冬酰胺，天冬氨酸，谷氨酸；(e) 170位点甘氨酸突变为丙氨酸，天冬酰胺，半胱氨酸或脯氨酸；或(f) 171位点脯氨酸突变为谷氨酸，组氨酸，谷氨酰胺，苏氨酸或酪氨酸。根据本发明的一方面，所述FGF21为SEQ ID No. 1。根据本发明的一方面，所述药用组合物用于受治疗者的I型和II型糖尿病的治疗，所述组合物含有包含与IgG多肽融合的FGF21多肽或者其衍生物或活性片段的异源性融合蛋白。本发明一方面提供了所述异源性融合蛋白用于治疗或预防I型和/或II型糖尿病的药物中的用途。根据本发明的一方面，所述IgG选自由人IgGl、IgG2和IgG4组成的组。本发明的其他特点和优越性可通过以下详细的描述体现。但是，应该理解的是，仅以示例的方式给出详细描述和具体实施例以表明本发明的实施方案，这是因为对于本领域熟练技术人员从所述的详细描述中在本发明的实质和范围内多种改变和改良是显而易见的。


图1 构建编码FGF21/IgG_Fc及其突变体的表达质粒。图IA显示运用PCR技术， 分别将FGF21和IgG-Fc的序列从各自的模板中扩增，接下来以上述的PCR产物为模板，用引物1和4扩增出FGF21/IgG-Fc序列。然后，将编码FGF21/IgG_Fc融合蛋白的cDNA 连接到表达载体pcDNA3. 1的BmHI和EcoRV位点之间。利用核苷酸位点定向突变方法， 产生编码FGF21/IgG-Fc融合蛋白的cDNA，使用与上述相同的方法将FGF21/IgG_Fc (QL)， FGF21(P171A)/IgG-Fc (QL)或 FGF21/IgG_Fc (QA)克隆入 pcDNA3. 1 表达载体。IB 中显示由活性FGF21分子和包含人IgG2重链恒定区(铰链、CH2和CH3部分)的IgG-Fc组成的 FGF21/IgG-Fc融合蛋白的图示。这些蛋白质表达时均以同型二聚体的形式分泌，形成如图所示的空间结构。图IC显示FGF21/IgG-Fc(QL)的空间结构。图2 :FGF21/IgG-Fc融合蛋白及其突变体在CHO-S细胞中的表达和检测。用编码 I gG-Fc、FGF21 /1 gG-Fc、FGF21 (P 17 ΙΑ) /1 gG-Fc (QL)、FGF21 /1 gG-Fc (QL)或 FGF21 / IgG-Fc (QA)等蛋白的质粒载体融合转染CHO-S细胞，转染4 后吸取上清液，用A蛋白琼脂糖凝股纯化融合蛋白。分别进行还原(reduced)和非还原(Non-reduced)的SDS-PAGE分析，用考马斯亮蓝(Comasie Blue)染色。然后，将SDS-PAGE胶转移到醋酸纤维素膜上，进行Western blot分析。上述膜用抗小鼠抗体(1 5000)探测，并用ECL显影。结果显示 FGF21/IgG-Fc及其突变体约为IOOKDa的同源二聚体，与理论分子量一致。其中，泳道1、2、3 分别是 FGF21/IgG-Fc、FGF21/IgG-Fc (QL)或 FGF21/IgG_Fc (QA)还原状态的 SDS-PAGE。泳道 5、6、7 为 FGF21/IgG-Fc、FGF21/1 gG-Fc (QL)或 FGF21/1 gG_Fc (QA)融合蛋白的非还原状态SDS-PAGE分析。图3:融合蛋白Western blot检测结果。取小规模提取的溶于SDS上样缓冲液的融合蛋白30μ 1经10% SDS-PAGE凝胶电泳分离后转移至醋酸纤维素膜，并用抗鼠抗体 (1 5000, Amersham-Pharmacia)探测，用 ECL显影。泳道 1-5 依次为 FGF21/IgG_Fc、FGF21/ IgG-Fc (QL)、FGF21/1 gG-Fc (QA)、FGF21 (P 171A) /IgG-Fc (QL)、FGF21 (L98R) /IgG-Fc (QA)， 蛋白的分子量约为lOOkDa。图4 显示通过将FGF21/IgG_Fc及其突变体注射到db\db小鼠腹膜内，在注射后0、0. 25、1、3、5和7天从注射小鼠中抽取血样，然后测定样品中的血糖水平，来测定特定抗蛋白酶解FGF21/IgG-Fc突变体体内活性。其表示在注射PBS对照、FGF21/IgG_Fc对照或者 FGF21(L98R/A45R/AlllK/G170A/P171A)/IgG-Fc、FGF21 (L98R/A111T/G170N/P171A) / IgG-Fc (QL)、FGF21 (A45T/A111K/P171A) /IgG-Fc (QA)或 FGF21 (A129E) /IgG-Fc 的小鼠中测定的血糖水平。图5 显示抗聚集突变蛋白的检测。将预先设计的突变体按照实施例1的方法进行蛋白的表达和纯化。将65mg/ml蛋白质在4°C下温育1天、6天和10天后，FGF21对照 (WT)以及卩6卩21/186呼^6卩21仏981 /^11117^1四0/617(^/卩17比)/186-卩(；或？6卩21仏980/ L98R/A111K/A129R/A129N/P171E)/IgG-Fc(QL)，FGF21(L98Q/L98R/A111T/A129N/G170A/ P171Q)/IgG-Fc (QA)的聚集变化百分比。数据表明，与野生型蛋白质相比，FGF21 (P171E)/ I gG-Fc，FGF21 (L98Q/P171Q)/I gG-Fc (QL)，FGF21 (A111T/P171Q)/I gG-Fc (QA)导致蛋白质的聚集减少。图6 显示FGF21/IgG_Fc及其突变体融合蛋白的3T3-L1脂肪细胞糖代谢实验，细胞分别用 FGF21/IgG-Fc，FGF21/1 gG-Fc (QA), FGF21 (P 171A) /IgG-Fc (QL), FGF21 (Α129Ν) / IgG-Fc (QA)及 FGF21(AlllT)/IgG-Fc 各 1000nmol/L。表中显示的值(χ士 s)都是至少三次试验后的平均值。
图 7:显示的是 FGF21/IgG-Fc，FGF21(P171A)/IgG-Fc^QL)，FGF21(L98R)/ IgG-Fc (QA)，FGF21/IgG-Fc (QL)或FGF21 (A129E) /IgG-Fc (QA)融合蛋白对患有 II 型糖尿病的db/db模型鼠的作用。4周和/或6周龄的db/db小鼠通过肌肉注射上述FGF21/IgG-Fc 融合蛋白及其突变体。收集注射前的和注射后2、4、10天的血清。活性FGF21水平通过 FGF21Elisa试剂盒检测(数据未显示)。首次注射后2天检测两组小鼠的空腹血糖水平(η =5 6，ρ < 0. 001)。图8 显示STZ糖尿病鼠模型实验。首先构建实验模型，将FGF21/IgG_Fc及其突变体融合蛋白注射模型鼠进行检测，图中显示的值(X士S)都是至少三次试验后的平均值， 其中η = 10。
具体实施例方式在一个实施方案中，本发明的组合物和方法延长了 FGF21/IgG_Fc的循环半衰期， 增强了其功效。这是通过IgG-Fc突变体增强与Fcfoi的亲和力进一步增加体内半衰期。本发明的IgG是人源的，可以选自IgGl、IgG2和IgG4。FGF21多肽可以是本身序列或衍生物的片段。FGF21多肽可以是SEQ ID No. 1的氨基酸序列。在另一个实施方案中，本发明的融合蛋白含有FGF21多肽、FGF21片段或和 IgG-Fc, IgG-Fc (T250Q/M428L)和 / 或 IgG-Fc (T307Q/N434A)突变体片段。本发明还提供了编码本发明的可分泌的融合蛋白的载体，所述融合蛋白包括但不局限于活性FGF21和人IgGl/IgG2/IgG4-Fc氨基酸序列，用于哺乳动物表达二价的FGF21 多肽；以及活性的 FGF21/IgG-Fc (QL)，FGF21 (P171A) /IgG-Fc (QL)和 reF21/IgG_Fc (QA)氨基酸序列。本领域技术人员可以在如同在本文实施例中描述的载体中或是以相同的方法容易地制备任何所需的FGF21序列。体外细胞系研究结合I型和II型糖尿病模型鼠体内肌肉注射融合蛋白进行治疗，证明重组的人类FGF21融合蛋白FGF21/IgG-Fc，FGF21(P171A)/ IgG-Fc (QL)，FGF21/1 gG-Fc (QL)和FGF21/IgG_Fc (QA)的生物学特性以及有效性。这种治疗方法在严重的I型和II型糖尿病模型中证明有效。总之，本发明为用蛋白质预防和治疗 I型和II型糖尿病提供了一种新的方法。融合蛋白的构建是融合FGF21和IgG-Fc突变体组成一种新的分子，该分子能促进 FGF21的功效并结合有IgG-Fc的优点，即增加FGF21的体内半衰期和减少促进细胞分裂的风险，避免胰岛素抵抗。同样，FGF21及其突变体与IgG-Fc (T250Q/M^8L)或IgG-Fc (T307Q/ N434A)形成的新分子，其具有所述的促进FGF21功效和IgG-Fc (T250Q/M428L ；T307Q/ N434A)分子的优点，增强Fc与Fcfoi的亲和力，进一步增加体内的半衰期。本发明的融合蛋白作为药物应用于人类或动物可以通过多种途径，并不局限于局部施用，如口服、喷雾、气管内灌输、腹膜内注射、静脉注射、肌肉注射和基因疗法。施用剂量取决于患者需要、期望取得的效果和施用途径。例如人类的施用量可以为2nmol/kg体重或是 0. 02 IOOnmol/kg 体重。本发明适用于任何需要此类治疗的个体。这些个体有可能发展成糖尿病、或新近诊断为糖尿病的患者或是已经诊断为糖尿病的患者。本发明与预防和治疗如本文所述的I 型和II型糖尿病相关。例如，这样的个体可以为肥胖的人或有糖尿病遗传史但尚未发病的人、或新近诊断为或已经诊断为糖尿病的人。世界卫生组织(WHO)根据身体质量指数(BMI)定义肥胖。BMI是用Kg体重除以身高米数的平方得来。为18. 5 25则体重正常。个体的 BMI为25 30则为超重，等于或超过30则为肥胖。这些个体也可以是血糖高于相同年龄与体重的正常值(正常血糖可以是根据医学参考资料常规测定的)的人，尽管还不至于诊断为糖尿病。这些个体也可以是有糖尿病遗传史但是还没有发展成为糖尿病的人。当血糖值高于普遍认可的正常范围时即可诊断为糖尿病。本发明提供了一种基于FGF21突变体与IgG-Fc突变体的优化组合的融合蛋白， 通过这种优化的突变组合获得明显改善蛋白聚集和降解，显著提高体内的半衰期的融合蛋白，这些融合蛋白能够增强药物的体内组织和细胞穿透能力，增强药效。本发明还提供了新的编码融合蛋白的质粒，该融合蛋白编码含有通过应用重叠 PCR(聚合酶链反应)得到的人FGF21和人IgG-Fc (图1)。图例显示IgG-Fc区域含有IgG2 恒定重链(包括饺链、CH2和CH3)。本发明还提供了可产生先导序列并导入载体使融合蛋白可以表达后分泌到细胞外培养液环境中去的方法。如图显示，一段ERBITUX重链信号肽(IGH)先导肽序列与FGF21 序列融合引导合成的多肽分泌到培养液中。在本发明的实施例中，一段ERBITUX重链信号肽(IGH)先导肽序列(MAVLGLLFCLVTFPSCVLS)与FGF21及IgG-Fc序列融合引导合成的多肽分泌到培养液中。每一个实施例中，这一战略保证了在分泌过程中在切除分泌先导肽之后将使产生的FGF21与IgG-Fc融合蛋白N端的活性组氨酸残基融合。有代表性的FGF21/ IgG-Fc见图2。这种方法能达到1.由于Fc融合蛋白以均一的二聚体的形式分泌，FGF21-FC融合蛋白半衰期长并且，其较高的配体亲和性从而使融合蛋白具有更高的效价。2.由于大量的胰岛素受体在细胞表面以二聚体的前体形式存在，因而增强了多肽的药效。3.简化了纯化过程。利用ftOtein A凝胶可以一步完成提纯，利于融合蛋白的分
离纯化。本专利还公开了使用哺乳动物表达系统证明了上述融合蛋白的新载体的表达。为评估载体表达和分泌FGF21/IgG-Fc融合蛋白的能力，将质粒载体转染至CHO-S细胞中。转染4 后，从表达的转染细胞中提取总RNA，用RT-PCR评估融合蛋白的表达情况。用Western免疫印迹法和抗鼠抗体还分析了转染的中国仓鼠卵巢细胞CHO-S细胞裂解物和细胞培养液以确定融合蛋白在翻译水平上的表达。如图3中所示，在培养液和细胞裂解物检测Fc融合蛋白。可以通过Western免疫印迹法来检测融合蛋白。在条件培养液和细胞裂解物中同时检测融合蛋白表明融合蛋白已经在哺乳动物细胞中合成并分泌。 CHO-S细胞系分别瞬时转染了递增量的FGF21/IgG-Fc质粒和FGF21-FC-only质粒，转染后 4 收集细胞培养液。从50ml培养液(接种浓度约1. 25X IO5个细胞/ml，2天静止培养)利用 Protein A 凝胶一步纯化融合蛋白(Jungbauer 等人，J Chromatogr. 1989 ；46 :257-268) 得到约300 μ g融合蛋白。样品再分别经还原和非还原的2种凝胶电泳分离并经考马斯亮兰染色分别检测到了一个约50KDa或约IOOKDa的条带(图2)，表明二聚体FGF21/IgG_Fc 融合蛋白以天然状态存在。在一个实施方案中，显示的是FGF21/IgG-Fc，FGF21 (P171A)/IgG-Fc (QL)，FGF21/ IgG-Fc (QL)和FGF21/IgG-Fc(QA)在预防和治疗I型和II型糖尿病中有效，用于实施例中，1.前期糖尿病db/db鼠作为II型糖尿病的模型；2. STZ诱导的I型糖尿病的模型；3. 3T3细胞系检测。Db/db小鼠缺乏功能性的瘦素受体，因此形成肥胖、高胰岛素症 (hyperinsulincmia)并在4到6周龄时出现葡萄糖不耐受，在8周龄时出现明显的糖尿病。 因此这些小鼠被广泛应用并被认为是II型糖尿病的模型。目前可以获得并能应用于本发明的其他小鼠糖尿病模型还有高脂饮食诱导的胰岛素抵抗的小鼠模型；这种小鼠因过度摄入脂肪导致体内脂肪过量沉积，因而形成肥胖，具胰岛素抗性，和葡萄糖的不耐受性。另一种动物模型是非肥胖糖尿病(NOD)小鼠。STZ诱导的I型糖尿病的模型是很好的自体免疫型糖尿病(I型糖尿病)模型，其中胰岛抗原活性了 T-细胞浸润胰岛并杀死胰岛细胞，弓丨起炎症过程使胰岛细胞死亡(Anderson和Bluestone，2005)。本发明对人的FGF21/IgG_Fc 进行改造，与IgG2-Fc通过一段柔性短肽连接，构建融合蛋白FGF21/IgG-Fc及其突变体，使其具有FGF21的疗效又有Fc的特性，获得一种具有稳定、持续降糖作用的新型蛋白药物。 更重要的是增强了与Fcfoi的亲和力，进一步提高了其在体内的半衰期。通过葡萄糖氧化酶-过氧化物酶(POD-GOD)法，在3T3-L1脂肪细胞模型中，对经纯化后的重组蛋白进行了生物活性鉴定；并在I型和II型糖尿病模型中对融合蛋白进行了药效分析。通过体外注射治疗途径施用FGF21/IgG_Fc及其突变体的在预防和治疗I型和II型糖尿病中有效。编码本发明的任意融合蛋白例如FGF21/IgG-FC，FGF21 (P171A)/ IgG-Fc (QL)，FGF21/1 gG-Fc (QL)和FGF21/IgG_Fc (QA)分子用于治疗是有效的。通过融合蛋白注射和对4周龄db/db受试鼠注射施用上述的融合蛋白。所有的受试鼠中，在第一次注射后1周进行第二次注射，并监控受试鼠糖尿病的进展情况。遗传性缺乏瘦素受体的db/ db鼠是啮齿类的II型糖尿病模型(Leiter,FASEB J. 1989 ；3(11) =2231-2241)。如上所示， 同时通过融合蛋白治疗途径用FGF21/IgG-Fc处理的年龄匹配的鼠在16周龄时(注射后1 周)显示出血糖量正常，而对照组小鼠空腹血糖(FBG)水平则高出了正常范围(图4)。这些结果表明用FGF21/IgG-Fc的治疗可以防止db/db鼠发生糖尿病。在表达FGF21/IgG_Fc 的db/db受试鼠中没有糖尿病的发生。基于IgG-Fc的药物有许多优点。因为融合蛋白能够形成IOOKDa的二聚体的形式，并不会被肾脏在短时间内清除，因此具有实质上更长的半衰期(Larrick and Fry, Hum Antibodies Hybridomas. 1991 ；2 (4) :172-189 ；Weir ^A, Biochem Soc Trans. 2002 ； 30(4) :512-516)。因此，大的FGF21/IgG_Fc同型二聚体融合蛋白较天然FGF21半衰期增长。由于一些酶更容易降解较小的多肽(Hupe-Sodmann等人，Regul Pept. 1995 ； 58 (3). 149-156)，而分子量较大的FGF21/IgG_Fc不容易被降解。而且FGF21/IgG_Fc 二聚体可以增加配体的亲和性，通过预先形成的胰岛素受体二聚体及多聚体(George等人，Nat Rev Drug Discov. 2002 ； (10) :808-820 ；Dupuis ^A, Brain Res Mol Brain Res. 1999 ； 67(1) :107-123)增强细胞内信号传导，因此以同型二聚体形式存在的FGF21-融合蛋白有更多潜力，结合更多的FGF21受体。总之，本发明是FGF21及突变体与IgG-Fc及其突变体(QA/QL)融合形成FGF21/ IgG-Fc突变体以增加半衰期、增强在体内活性并减少免疫原性FGF21/IgG-Fc融合蛋白以天然二价的形式存在。在本发明的一个实施方案中，FGF21/IgG-Fc融合蛋白可以直接通过注射施用。用鼠糖尿病模型体内试验表明，可以通过融合蛋白的注射施用，这种方法可以有效控制体内的血糖水平，避免胰岛素抵抗的发生；在II型糖尿病db/db鼠模型证明可以治疗糖尿病。同时，通过恒河猴的药物代谢实验进一步证实FGF21/IgG-Fc (QL),FGF21 (P171A/ L98R)/IgG-Fc (QL)和 FGF21/1 gG_Fc (QA)比 FGF21/IgG_Fc 具有更长的体内半衰期。上述公开的内容对本发明进行了大体的描述。通过参考下列具体实施例对本发明做更全面的理解。这些实施例仅仅是为了进一步的说明，而不是为了限定本发明的范围。换言之，一些形式上的变异或替换是用作达意的考量。因此，在下文例引用的一些特殊的术语旨在达意，而非限制其意的目的。实施例实施例1 载体的构建使用重叠PCR(overlap PCR)构建了含有TOF21及突变体和IgG2_Fc及突变体的编码融合蛋白的载体。IgG2-Fc区含有IgG2恒定重链(铰链-CH2-CH3部分)。将鼠 IgK分泌先导肽序列与FGF21序列融合以便引导合成的融合蛋白分泌到培养液中。编码 FGF21/hIgG-Fc融合蛋白的cDNA是化学合成的，并将其连接到编码人IgG2_Fc (铰链、CH2 和CH3)的PCR扩增的产物上，然后插入pcDNA3. 1载体的EcoRV和BamHI位点间构建FGF21/ hIgG-Fc-pcDNA3. 1载体。可分泌的FGF21/hIgG_Fc及其突变体融合蛋白含有IgG2恒定重链(铰链-CH2-CH3)。ERBITUX重链分泌引导肽序列(IGH)与FGF21序列融合引导合成的蛋白分泌到细胞培养液中。图1显示分泌的FGF21/IgG-Fc融合蛋白的图示。其特点是1.解决了 FGF21半衰期短的问题，因为融合蛋白是以同型二聚体的形式分泌的，在体内具有长的半衰期并由于配体的高度亲和性而达到了高效价(Ozmen等人， J Immunol. 1993,150(7) :2698-2705 ；Kurschner 等人，J Immunol. 1992 ；149(12) 4096-4100 ；Kurschner 等，J Biol Chem. 1992 ；267 (13) :9354-9360)。2.基于Fcfoi亲和力的突变改造，能够进一步的增加FGF21在体内的半衰期，同时增强药物在体内组织和细胞的穿透能力，增强药物的效果；3.由于大多数FGF21受体是在细胞表面预先形成二聚体(Kharitonenkov A等人， J Cell Physiol. 2008 Apr ；215(1) 1-7)因而多肽与其受体的结合将更为有效；4.有效减少FGF21蛋白的聚集与降解问题；使用基因特异性引物和重叠PCR从FGF21 (化学合成，Shenggong company， Shanghai) cDNA和IgG质粒扩增全长FGF21和IgG-Fc cDNA。对于第一轮重叠PCR，使用 5 ‘ -GGATCCCACCCCATCCCTGACTCCAGTCCTCTCCTGCAATTCGG-3'和 5 ‘ -CCGCCTCCGGAGCCGCCG CCTCCGGAGCCGCCGCCTCCGGAAGCGTAGATTTGCGCTCGGAGCCG-3‘；5' -CTACGCTTCCGGAGGCGGCGGC TCCGGAGGCGGCGGCTCCGGAGGCGGCGGCTCCGAGCGCAAAT-3，和 5' -TGATGTGCGTCTTCTCGGAGAGGG ACAGAGGCCCATTTCTAIAG-3‘。在第二轮重叠PCR中使用PCR及产物制备备用FGF21/IgG_Fc cDNA。将扩增的产物亚克隆到载体Bam HI和Eco RV位点，使用5 ‘ -GGATCCCACCCCATCCCT GACTCCAGTCCTCTCCTGCAATTCGG-3'和 5‘ -TGATGTGCGTCTTCTCGGAGAGGGACAGAGGCCCATTTCTA TAG-3’ 引物。为构建编码FGF21-IgG-Fc 的对照载体，使用 5 ‘ -GGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCG GCAG-3，和 5 ‘ -TGATGTGGGTCTTCTCGGACTCGGACTCGGACCCGTTC-3，，通过 PCR 单独扩增 I gG cDNA并克隆到载体Bam HI和Eco RV位点。用于编码人IgG2_Fc (铰链-CH2-CH3)的cDNA 片段的PCR扩增的引物为5' -GGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAG-3，和5' -TGATGTGGGTCT TCTCGGACTCGGACTCGGACCCGTTCCCTAAG-3，。载体含有 CMV 直接-早期(immediate-early)增强子和启动子、单一真核生物转录单元。嘌呤尾和转录终止序列。为使FGF21序列分泌，通过PCR于其5’端引入鼠IgK-链信号肽序列。为在细菌中表达FGF21/IgG-Fc融合蛋白，融合 cDNA序列通过 PCR扩增并亚克隆至 pET32a 载体(Novagen，EMD Bioscience, San Diego, CA)。IgG-Fc (QL)和 FGF21/IgG-Fc(QA)表达质粒的构建方法同上，T250Q/M^8L 和 T307Q/ N434A突变位点另外设计两对PCR引物，进行重叠PCR反应，最后获得FGF21/IgG_Fc (QL)、 FGF21(P171A)/IgG-Fc (QL)和 FGF21/IgG_Fc (QA)表达质粒(图 1)。实施例2 :FGF21/IgG-Fc及其突变体融合蛋白的CHO表达将FGF21/IgG_Fc 或 IgG-Fc 的 cDNA 通过 月旨质体 (Lipofectamine) 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA)转染到 CH0-S 细胞中。其过程是先将密度为每孔2. 5X IO5个的CHO-S细胞生长在6孔细胞培养板。添加含有4yg FGF21/ IgG-Fc cDNA和10 μ 1转染脂质体的无血清无抗菌素的DMEM(Invitrogen)进行培养。转染他后，转换为全培养液。转染后4 分别收集培养液和细胞。为了大规模地表达FGF21/ IgG-Fc融合蛋白，将生长在150mm培养皿内的CHO-S细胞用阳离子转染试剂、聚乙酰亚胺 (Poly-ethyleneimine ；PEI,25kDa)禾P80yg 相关。cDNA 转染。用 150mM Nacl 分别稀释 DNA和PEI，混合后培养20min。然后将DNA/PEI复合物加到细胞中，并在无血清无抗菌素的培养液中培养他。以加有10% FBS和P/S的DMEM替换培养液。为建立稳定表达FGF21/IgG_Fc的CH0-S细胞，将在6孔细胞培养板(2. 5 X IO5个细胞/孔)上生长的细胞用4 μ g线性化的FGF21/IgG-Fc或IgG-Fc转染。转染24h后，细胞在含有G418(500y g/ml)的DMEM培养液分裂和培养，以筛选那些已经将重组质粒稳定整合到其基因组内的细胞。培养过程中，每3天换培养液一次直至细胞克隆形成。分离单克隆细胞并扩展成稳定的细胞系并将这些细胞系在M孔板上生长的组织培养的上清液用人 FGF21试剂盒检测融合蛋白，选择能分泌融合蛋白的细胞用作以后的特性分析。实施例3 从哺乳动物细胞培养液中纯化融合蛋白应用A蛋白葡聚糖凝胶柱可以进行中规模的蛋白纯化。50ml的柱体积可以纯化 15cm培养皿中生长的转染FGF21/lgG-Fc及其突变体融合载体的CHO-S细胞的条件培养液。 收集细胞转染后48h的50ml DMEM培养液，或是收集稳定表达融合蛋白的细胞，将其加入 A蛋白葡聚糖凝胶ImL满体积(Amersham-Pharmacia)。加入TritonX-100在4°C下培养过夜。然后用含TritonX-100的PBS缓冲液洗涤，然后用150mM Nacl洗涤，最后用 ImM Nacl氨基乙酸(pH2. 7)将蛋白从树脂上洗脱。洗脱液立即用Tris缓冲液(pH9. 0)中和并且纯化的蛋白用PD-10凝胶柱除盐(Amersham-Pharmacia)并用PBS洗脱。如图中所见(图2)，两步洗脱方法可以将大部分融合蛋白由葡聚糖凝胶柱上洗脱下来。样品的组分经SDS-PAGE溶解并经考马斯亮兰染色显影以评估产率和纯化率，结果显示每ml培养液接种1. 25 X IO5细胞培养2d后，融合蛋白得率约为6 μ g/ml。实施例4 融合蛋白的细菌表达在大肠杆菌细胞中表达FGF21/IgG_Fc及其突变体融合蛋白。为了补偿大肠杆菌 BL21细胞的密码子偏倚(Codon bias)，使用了可以促进二硫键形成并可额外搭载质粒以表达 7 个罕见的 tRNAs 的 Rosetta garni2 细胞(Merck, Germany)用 FGF21/IgG_Fc/pET32a， FGF21(P171A)/IgG-Fc, FGF21/IgG-Fc(QL)pET32a, FGF21/IgG-Fc(QA)pET32a 或 IgG-Fc/ pET3h载体(Novagen)转化细菌后，选择并筛选出其中几个克隆以最佳表达融合蛋白。蛋白质的表达是将单一克隆培养在有卡那霉素的50ml的2XYT培养液中于37°C过夜培养。 而后将培养液稀释成(1 50)新培养液，直至细胞密度达到0D_读数值0.6后，再在培养液中添加ImM的IPTG(EMD)3h以诱导表达。收集细菌并将菌球(Pallet)保存以进行其他步骤。蛋白质的提取是将离心后的细菌重新悬浮在冰浴的含有蛋白酶抑制剂鸡尾酒 (Sigma, St. Louis, MO)的PBS缓冲液后用超声波裂解细胞。添加TritonX-IOO以溶解蛋白，30min后离心(12000g，IOmin)收集含有融合蛋白的上清液。表达的融合蛋白通过A 蛋白葡聚糖凝胶纯化并通过SDS-PAGE和考马斯亮兰染色分析验证。从4L的细菌培养液中可以提纯约120 μ g的FGF21/IgG-Fc和Fc_only融合蛋白。实施例5 =SDS-PAGE和/或免疫印迹法检测融合蛋白对表达的融合蛋白进行翻译水平上的检测。用Western免疫印记法和抗鼠抗体检测了转染的CHO-S细胞裂解物和细胞培养液以确定融合蛋白在翻译水平上的表达。如图3 中所示，同时在培养液和细胞裂解物中检测到Fc融合蛋白。融合蛋白在电泳迁移位置大约在50kDa，是在还原的SDS-PAGE条件下融合蛋白单体的分子量。取小规模提取的溶于SDS 上样缓冲液的融合蛋白30 μ 1经10% SDS-PAGE凝胶电泳分离后转移至醋酸纤维素膜，并用
(1 5000, Amersham-Pharmacia) ^llJ, M ECL Mfi (Amersham-Pharmacia) ( B 图3)。中等规模提取的融合蛋白则经10% SDS-PAGE凝胶电泳分离后用考马斯亮兰染色检测。实施例6 抗蛋白酶降解的FGF21/IgG_Fc及其突变体的设计通过数据库(ProteinData Bank, PDB ；SWISS-PORT)分析了野生型 FGF21 主要的蛋白水解活性位点的序列位置，从而对原有的氨基酸进行替换，通过设计引入特定的氨基酸，来减少蛋白酶对FGF21/IgG-Fc的降解作用。氨基酸替换以具有其它物种的FGF21序列保守性和具有氨基酸残基的生化保守性为基础。已引入或可引入野生型FGF21蛋白的氨基酸取代表见表1，然而表1只是示例性的，并且可进行其它取代。表1中给定的位置数对应由181氨基酸残基组成的成熟FGF21蛋白中的残基位置。表1. FGF21/1 RG-Fc 残基突变
权利要求
1.一种融合蛋白，由人成纤维细胞生长因子21(FGF21)及突变体通过连接肽 (Linker)与IgG-Fc或IgG-Fc突变体形成，其通式为reF21-Linker-IgG_Fc或者 IgG-Fc-Linker-FGF21。
2.权利要求1所述FGF21为人成纤维细胞生长因子21(SEQ ID NO=D或其突变体，根据本发明的一方面，所述FGF21突变体选自如下任意一个突变或者多突变的任意组合，其中突变位点选自(a)45位丙氨酸突变为精氨酸，谷氨酸，谷氨酰胺，赖氨酸或苏氨酸；(b)98位亮氨酸突变为精氨酸，谷氨酸，谷氨酰胺，赖氨酸或苏氨酸；(c)111位丙氨酸突变为苏氨酸或赖氨酸；(d)129位丙氨酸突变为精氨酸，天冬酰胺，天冬氨酸，谷氨酸；(e)170位甘氨酸突变为丙氨酸，天冬酰胺，半胱氨酸或脯氨酸；或(f)171位脯氨酸突变为谷氨酸，组氨酸，谷氨酰胺，苏氨酸或酪氨酸。
3.权利要求1 所述 Linker 选自序列 SEQ ID NO :2，SEQ ID NO :3，SEQ ID NO :4，SEQ ID NO 5, SEQ ID NO :6 或 SEQ ID NO :7，也可以选自(GGGGS) n，其中 η 可以是 1，2，3，4，5 或 6。
4.权利要求1所述Linker可以选自SEQID NO :8，其中η可以是1，2，3，4，5或6，另夕卜，也可以直接连接，或者为其它甘氨酸富集的连接肽。
5.权利要求1所述IgG-Fc(铰链区-CH2-CH3)序列为人IgGl、IgG2、IgG3或IgG4的 Fc及其突变或缺失体，上述序列选自SEQ ID NO :9,SEQ ID NO 10, SEQ ID N0:11或SEQ ID NO :12，或者选自上述IgG-Fc序列的杂合体，其中IgG-Fc序列参照EU(Kakit)指数进行编号，重要的是上述IgG-Fc突变体选自序列SEQ ID NO 13, SEQ ID NO :14，SEQ ID NO 15, SEQ ID NO :16，上述突变位点可以是单个位点突变或是选自如下多位点突变组合，其中Xaa1 = Gln 或 ThrXaa2 = Gln 或 ThrXaa3 = Leu, Met 或 HisXaa4 = Ala 或 Asn0
6.根据权利要求1所述，更进一步，与FGF21相连的融合蛋白可以选自人血白蛋白或转铁蛋白，也可以选自人血白蛋白或转铁蛋白部分片段、突变体和缺失体。
7.权利要求1 5所述融合蛋白应用于人I型和II型糖尿病及肥胖症的预防与治疗， 或者其DNA序列应用于基因治疗。
8.权利要求5所述融合蛋白突变体，是基于增加与Fcfoi的亲和力来进一步增加FGF21 在体内的半衰期。
9.权利要求1 5所述融合蛋白使用酵母，CHO,SP2/0, BHK和/或HEK293细胞进行表达，蛋白纯化过程中使用A或G蛋白葡聚糖凝胶层析柱。
10.权利要求1 5所述融合蛋白使用大肠杆菌进行表达。
全文摘要
本发明提供一种用于检测和治疗人I型和II型糖尿病、肥胖症的融合蛋白及其制备方法和应用。所述融合蛋白含有人FGF21或其突变体和人IgG2-Fc(铰链区-CH2-CH3)或IgG2-Fc突变体(T250Q/M428L；T307Q/N434A)，能有效改善肥胖症患者的生存状况，降低糖尿病患者的血糖水平，有效减少FGF21蛋白的聚集和降解，同时增加FGF21体内的半衰期，尤其是FGF21及突变体与IgG-Fc(T250Q/M428L；T307Q/N434A)突变体融合，增强与FcRn亲和力，进一步增加FGF21的体内半衰期。
文档编号A61P3/10GK102558358SQ20111046300
公开日2012年7月11日 申请日期2011年12月30日 优先权日2011年12月30日
发明者张海涛 申请人:张海涛