专利名称：用甲硫氨酸-γ-裂合酶加工的酶和其药理学制备物的制作方法
用甲硫氨酸-Y -裂合酶加工的酶和其药理学制备物发明背景本申请要求2010年2月4日提交的美国申请No. 61/301,368的优先权，其整个公开通过弓I用毫无遗漏地整体并入本文。本发明得到由美国健康学会资助的NIH CA 139059的政府支持。政府在本发明中具有特定权利。1.发明领域本发明通常涉及用耗竭L-甲硫氨酸的酶治疗癌的组合物和方法。更具体而言，其关心用甲硫氨酸降解活性加工新人甲硫氨酸-Y-裂合酶和对于人治疗适合的大大增强的稳定性。
2.背景技术在癌性组织中对必要的氨基酸，甲硫氨酸的需求格外地高。甲硫氨酸的耗尽已显示在杀不利地影响非-癌性组织的广泛的肿瘤类型中有效。甲硫氨酸耗尽可经水解氨基酸的酶的作用实现。虽然人甲硫氨酸耗竭酶不存在，自铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)的细菌酶，甲硫氨酸_ Y _裂合酶，已显示在临床中治疗有效，且已在临床试验中评价。但是，甲硫氨酸-Y-裂合酶，作为细菌蛋白，是高度免疫原性的，且引发特异性抗体的形成，导致不利的反应及减少的活性。甲硫氨酸-Y-裂合酶也具有在体外和体内仅小时的非常短的半衰期，从而需要非常频繁的和不切实际地高施剂，以达到系统性耗尽。系统性甲硫氨酸耗尽是许多研究的焦点，且具有势治疗癌诸如尤其转移性乳腺癌，前列腺，成神经细胞瘤和胰腺癌的潜力。尽管对于此治疗剂方法有许多兴奋，细菌来源的甲硫氨酸-Y -裂合酶具有严重的缺点，其大大缩减了其作为化学治疗剂的热情。由此，仍有对于开发用于解决这些缺点的L-甲硫氨酸耗尽治疗的治疗性成功的方法和组合物的需求。发明概述本发明的特定方面通过提供包含具有甲硫氨酸-Y-裂合酶(MGL)活性的人多肽序列的新酶来克服本领域中的主要缺陷，其可适合于癌治疗，及具有低免疫原性及改善的血清稳定性。因此，在第I实施方式中提供了修饰的多肽，特别是具有甲硫氨酸降解活性的源于与MGL相关的灵长类动物酶的新酶变体。例如，新酶变体可具有选自SEQ IDN0:10 17的氨基酸序列。尤其是，变体可源于人酶，诸如人胱硫醚-Y-裂合酶(CGL)。在特定方面，可有包含能降解甲硫氨酸的修饰的人胱硫醚Y-裂合酶的多肽。在一些实施方式中，多肽能在生理条件下降解甲硫氨酸。例如，多肽可具有对于甲硫氨酸的催化性效率(kMt/KM)，其为至少或约 0. 01，0. 05，0. 1,0. 2,0. 3,0. 4,0. 5,0. 6,0. 7,0. 8,0. 9，1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，20，30，40，50，60，70，80，90，100，200，300，400，500，600，700，800，900，1000，2000，3000，4000，5000,6000, 7000，8000，9000，IO4, IO5, IO6M-1S-1 或源于这些的任何范围。在再一方面，多肽可显示向L-高胱氨酸的催化性活性，其kcat/KM达100，95，90，85，80，75，70，65，60，55，50，45，40，35，30，25，20，15，10，9，8，7，6，5，4，3，2，I，0. 9，0. 8，0. 7，0. 6，0. 5，0. 4，0. 3，0. 2，0. 1,0. 05，0. 01，0. 005,0. OOlM-1S-1 或源于这些的任何范围。
以上讨论的修饰的多肽可特征在于相比未修饰的多肽(例如，天然多肽)或相比本文公开的任何多肽序列具有特定同一性百分率。例如，未修饰的多肽可包含天然灵长类动物胱硫醚酶(即，胱硫醚Y裂合酶)的至少或至多约10，20，30，40，50，60，70，80，90，100，150，200，250，300，350,400个残基(或源自其中的任何范围)。修饰的及未修饰的多肽之间，或比较的任何2个序列之间的百分率同一性可为约，至多或至少50%，55%，60%，65%，70%，75%，80%，85%，90%，95%，96%，97%，98%，99%或100% (或源自其中的任何范围)。也涵盖，以上讨论的同一性百分率可涉及相比多肽的未修饰的区的多肽的特定修饰的区。例如，多肽可含有胱硫醚酶的修饰的或突变的底物识别位点，其可基于胱硫醚酶的修饰的或突变的底物识别位点的氨基酸序列与自相同的物种或跨物种的未修饰的或突变的胱硫醚酶的氨基酸序列的同一性表征。表征为，例如，与未修饰的胱硫醚酶具有至少90%同一性的修饰的或突变的人多肽表示该修饰的或突变的人多肽中90%的氨基酸与未修饰的多肽中的氨基酸相同。该未修饰的多肽可为天然胱硫醚酶，特别是人同种型或其他灵长类动物同种型。例如，天然人胱硫醚酶可具有SEQ ID NO: I的序列。其他天然灵长类动物胱硫醚酶的非限制性例包括苏门答腊猩猩(Pongo abelii)胱硫醚酶(Genbank ID NP 001124635. I; SEQID NO: 18)，食蟹猴(Macaca fascicularis)胱硫醚酶(Genbank ID AAW71993. I; SEQID N0:19)，及黑猩猩(Pan troglodytes)胱硫醚酶(Genbank ID XP 513486. 2; SEQ IDNO: 20)。例示天然多肽包括与SEQ ID NO: I或18 20具有约，至多或至少50%，55%，60%，65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 或 100% 同一1性(或源自其中的任何范围)的序列或其片段。例如，天然多肽可包含SEQ ID NO: I或18 20的序列的至少或至多约 10，20，30，40，50，60，70，80，90，100，150，200，250，300，350，400，415 个残基(或源自其中的任何范围)。在一些实施方式中，天然胱硫醚Y-裂合酶可由一种或更多其他修饰诸如化学修饰，取代，插入，缺失和/或截短来修饰。例如，修饰可在天然酶的底物识别位点。在特定实施方式中，天然胱硫醚可由取代修饰。例如，取代数可为1，2，3，4或更多。在进一步实施方式中，天然胱硫醚Y-裂合酶可在底物识别位点或可影响底物特异性的任何位置修饰。特别是，可修饰的氨基酸是带电残基，诸如带负电的(例如，Asp, Asn)或带正电的残基(例如，Arg，Lys)。例如，修饰的多肽可在对应于SEQ ID NO: I的E59，E119和/或R339的氨基酸位置或灵长类动物胱硫醚Y -裂合酶的59，119和/或339的氨基酸位置具有至少一个氨基酸取代。例如，灵长类动物可为人，苏门答腊猩猩(Pongo abelii)，食蟹猴(Macacafascicularis),黑猩猩(Pan troglodytes)。在特定实施方式中，修饰可为用中性残基(例如，Ala，Asn，Gln，Gly，Ile1Leu或Val)取代一个或更多带电残基(包括带正电的残基诸如Arg或R，Lys或K，His或H和带负电的残基诸如Asp或D和Glu或E)。例如，在氨基酸第59，119和/或339位的取代是天冬氨酸(N)，缬氨酸(V)，或亮氨酸(L)。在特定实施方式中，修饰是一种或更多选自下列的取代E59N，E59V, R119L和E339V。在进一步实施方式中，取代可包含R119L和E339V取代。在仍进一步实施方式中，取代可包含另外的E59N或E59V的取代。
在一些实施方式中，天然胱硫醚-Y-裂合酶可为人胱硫醚-Y-裂合酶。在特定实施方式中，取代是人胱硫醚Y-裂合酶的E59N，R119L和E339V的组合(例如，具有SEQID NO: 10的氨基酸序列的修饰的多肽，其片段或同源物)或人胱硫醚Y-裂合酶的E59V，R119L和E339V的组合(例如，具有SEQ ID NO: 11的氨基酸序列的修饰的多肽，其片段或同源物)。在进一步实施方式中，修饰的多肽可为苏门答腊猩猩(Pongo abelii)苏门答腊猩猩(Pongo abelii)CGL-NLV突变体(SEQ ID NO: 12)，苏门答腊猩猩(Pongo abelii)CGL_VLV突变体(SEQ ID NO: 13);食蟹猴(Macaca fascicularis) CGL-NLV 突变体(SEQ ID NO: 14)，食蟹猴(Macaca fascicularis) CGL-VLV 突变体(SEQ ID NO: 15);黑猩猩(Pan troglodytes)CGL-NLV 突变体(SEQ ID NO: 16)，及黑猩猩(Pan troglodytes) CGL-VLV 突变体(SEQ IDNO:17)。在一些方面，本发明也涵盖包含与异源氨基酸序列连接的修饰的胱硫醚Y-裂合酶的多肽。例如，修饰的胱硫醚Y-裂合酶可连接到异源氨基酸序列作为融合蛋白。在特定实施方式中，修饰的胱硫醚Y -裂合酶可连接到用于增加体内半衰期的XTEN多肽。
为了增加血清稳定性，修饰的胱硫醚Y -裂合酶可连接到I个或更多聚醚分子。在特定实施方式中，聚醚可为聚乙二醇(PEG)。修饰的多肽可经其特定氨基酸残基，诸如赖氨酸或半胱氨酸连接到PEG。为治疗施用，该包含修饰的胱硫醚Y-裂合酶的多肽可分散在药学可接受的载体中。在一些方面，涵盖编码该修饰的胱硫醚Y-裂合酶的核酸。在一些实施方式中，核酸已经为在细菌中表达而密码子优化。在特定实施方式中，细菌是大肠埃希氏菌(E. coli)。在其他方面，本发明还涵盖载体诸如含有该核酸的表达载体。在特定实施方式中，编码修饰的胱硫醚Y-裂合酶的核酸可操作地连接到启动子，包括但不限于异源启动子。在仍再一方面，本发明还涵盖包含该载体的宿主细胞。宿主细胞可为细菌，诸如大肠埃希氏菌(E. coli)。为从天然胱硫醚Y-裂合酶进一步区分具有甲硫氨酸降解活性的期望的CGL突变体，可制备具有ilvA和metA的缺失的宿主细胞(例如，大肠埃希氏菌(E. coli) ilvA-metA-)及用来鉴定期望的突变体。在进一步实施方式中，也可提供鉴定具有L-甲硫氨酸降解活性的灵长类动物胱硫醚Y -裂合酶变体的方法，包括Ca)在具有基因ilvA和metA缺失的大肠埃希氏菌(E. coli)株细胞中表达一群灵长类动物胱硫醚Y -裂合酶变体，其中变体相比天然灵长类动物胱硫醚Y-裂合酶包含至少一个氨基酸取代；及6)鉴定具有L-甲硫氨酸降解活性的灵长类动物胱硫醚Y-裂合酶变体，其中表达鉴定的变体的细胞在补充了 L-甲硫氨酸的最小培养基中相比在另外同一条件中的表达天然灵长类动物胱硫醚Y-裂合酶的细胞具有更高生长速率。在一些实施方式中，将载体导入用于表达修饰的胱硫醚Y裂合酶的宿主细胞。蛋白可以任何适合的方式表达。在一实施方式中，在宿主细胞中表达蛋白，使得蛋白糖基化。在另一实施方式中，在宿主细胞中表达蛋白，使得蛋白非糖基化。本发明的特定方面也涵盖通过施用本发明的修饰的胱硫醚Y-裂合酶肽，核酸，或制剂的治疗方法，且尤其是治疗肿瘤细胞或患癌受试者的方法。受试者可为任何动物诸如小鼠。例如，受试者可为哺乳动物，特别灵长类动物，且更特别是人患者。在一些实施方式中，方法可包含选择患癌患者。在特定方面，受试者或患者可维持于甲硫氨酸-限制的膳食或正常膳食。在一些实施方式中，癌是敏感于甲硫氨酸耗尽的任何癌。在一实施方式中，本发明涵盖治疗肿瘤细胞或癌患者的方法，包括施用包含该多肽的制剂。在一些实施方式中，施用发生在使得杀至少部分癌细胞的条件下。在另一实施方式中，制剂包含该在生理条件具有甲硫氨酸降解活性的修饰的胱硫醚Y-裂合酶及还包含附接的聚乙二醇链。在一些实施方式中，制剂是包含以上讨论的任何胱硫醚Y-裂合酶变体和药学可接受的赋形剂的药学制齐U。该药学可接受的赋形剂是本领域技术人员熟知的。可涵盖全部以上胱硫醚Y-裂合酶变体用于人治疗。在进一步实施方式中，也可提供治疗肿瘤细胞的方法，包括施用包含具有甲硫氨酸降解活性的非-细菌(哺乳动物，例如，灵长类动物或小鼠)修饰的胱硫醚Y-裂合酶或编码其的核酸的制剂。
因为肿瘤细胞依赖于它们的对于甲硫氨酸的营养培养基，施用或治疗可针对细胞的营养来源，且不必然是细胞本身。因此，在体内应用中，治疗肿瘤细胞包括使一群肿瘤细胞的营养培养基与加工的甲硫氨酸酶接触。在此实施方式中，培养基可为期望甲硫氨酸耗尽的血，淋巴液，脊髓液等体液。根据本发明的特定方面，该含有修饰的胱硫醚Y-裂合酶的制剂可通过吸入，输注，连续输注，局限性灌注，经导管，经灌洗，在脂质组合物中(例如，脂质体)或通过本领域普通技术人员已知的其他方法或上述的任何组合静脉内，真皮内，动脉内，腹膜内，病灶内，颅内，关节内，前列腺内，胸膜内，滑膜内，气管内，鼻内，玻璃体内，阴道内，直肠内，局部，肿瘤内，肌内，腹膜内，皮下，结膜下，囊泡内，经粘膜，心包内，脐内，眼内，经口，局部施用。本发明的方法和/或组合物的情景中讨论的实施方式可关于本文所述的任何其他方法或组合物采用。由此，也可将属于一种方法或组合物的一实施方式应用于本发明的其他方法和组合物。如本文所用术语“编码(encode)”或“编码(encoding)”在关于核酸使用时，使本领域技术人员容易可理解本发明；但是，这些术语可分别与“包含(comprise)”或“包含(comprising)” 互换使用。如在本说明书中所用，〃a"或〃an〃可表示I个或更多。如在本权利要求中所用，当与词汇〃包含〃联合使用时，词汇〃a〃或"an"可表示I个或多于I个。权利要求中使用术语“或”表示“和/或”，除非明确地指示表示仅替代性的或替代性的是相互排他的，尽管公开支持指称仅替代性的和“和/或”的定义。如本文所用，“另一”可表示至少第2个或更多。贯穿本申请，术语“约”用于指示，值包括装置，测定值所采用的方法的误差的固有变化，或研究对象之中存在的变化。本发明的其他目的，特征和优势会从下列详述显而易见。但是，应明白，详述和特定例，只能指示本发明的优选的实施方式，仅以例证方式提供，由于本发明的精神和范围之内的各种变化和修饰会由本领域技术人员由此详述显而易见。
下列图形成本说明书的部分，且被包括以进一步展示本发明的特定方面。可通过引用一个或更多这些图组合本文呈现的特定实施方式的详述而更佳明白本发明。图I :CGL和MGL催化L-胱硫醚或L-甲硫氨酸(L-Met)类似PLP依赖性降解为分别氨，a-丁酮酸和半胱氨酸或甲烷-氢硫基。
图2 :于37°C温育的合并的人血清中经时％活性的标绘图。自恶臭假单胞菌(P.putida)的MGL (〇)具有2±0. I小时的表观Ta5，人CGL (▲)具有16±0. 8小时的表观T0.5，变体hCGL-NLV ( )具有95±3小时的表观Ta5，及变体hCGL-VLV ( )具有260±18小时的表观Ta5。图3 :人CGL (▲)和变体hCGL-NLV ( )具有 68°C的表观Tm值，且变体hCGL_VLV( )具有 71°C的表观Tm。图4 :聚乙二醇化大大增加hCGL变体的表观分子量。MW阶梯(泳道1)，纯化的hCGL变体(泳道2)，及用改变量的PEG NHS-酯MW 5000 (10，20，40&80倍摩尔过量)修饰的纯化的hCGL变体(分别泳道3 6)的SDS-PAGE。图5 :聚乙二醇化大大增加hCGL变体的表观分子量。SEC (大小排阻层析)层析对于聚乙二醇化的hCGL变体显示 1，340kDa的表观MW(A),及对于未聚乙二醇化的hCGL变体显示 220kDa的表观MW (B)。图6 =L-Met耗竭酶对成神经细胞瘤细胞系Lan-I的效应。重组pMGL (O)具有0. 6uM的表观IC50,而重组hCGL-NLV ( )具有0. 3 u M的表观IC500图7 PEG-hCGL-NLV的药效学分析。标绘相对t=0的血清样品中的酶活性百分率。( )经时具有28±4小时的表观活性T1/2。图8 :在施用 200U PEG-hCGL-NLV 之前，给无胸腺小鼠补给 Met (-) Hcyss (-) Chl (-)膳食(N=5)。血清甲硫氨酸浓度表示为平均值土SD。血甲硫氨酸水平在8小时时降低到
3.9±0. 7iimol/L 的最低值。图9 :聚乙二醇化的hCGL-NLV与pMGL体外抑制各种成神经细胞瘤细胞系增殖的比较。图10 :带有LAN-I异种移植物的无胸腺小鼠。(□)用正常膳食的对照(N=IO); ( )Met (-) Hcyss (-) Chl (-)小鼠饲料(N=IO) ;(〇) 100U PEG-hCGL-NLV 组合 Met (-) Hcyss (-)Chl (-)小鼠饲料(N=IO) (▲治疗日)。肿瘤生长速率表示为对于各组的平均值土SEM (平均值的标准误差)。*P〈0. 01，当处理PEG-hCGL-NLV组合Met (-) Hcyss (-) Chl (-)小鼠饲料与其他2组比较时。图11 :显示双基因ilvA和metA缺失的大肠埃希氏菌(E. coli) L-甲硫氨酸和L-异亮氨酸合成通路的示意图。此致使大肠埃希氏菌(E. coli)对于L-Met和L-Ile营养缺陷型。如果大肠埃希氏菌(E. cili)在补充了 L-Met的培养基上生长，及包含编码有活性的甲硫氨酸-Y-裂合酶的基因，则得到的a - 丁酮酸产生会补偿L-Ile营养缺陷。图12 :将大肠埃希氏菌(E. coli)BL21(DE3) ( A ilvA A metA)平铺在补充了 0. 5mML-甲硫氨酸的M9最小琼脂培养基上，及含有编码甲硫氨酸-Y-裂合酶的基因(左)或编码胱硫醚-Y-裂合酶的基因(右)的质粒。仅MGL活性能拯救L-异亮氨酸营养缺陷。实施方式本公开，根据特定实施方式，总的针对制备加工为具有甲硫氨酸降解活性的新人酶的组合物和方法和其相关的治疗性应用。
不被理论或机理束缚，本公开基于以下研究。首次开发高通量测定用于通过监控在96孔板中产物a - 丁酮酸的形成来检测甲硫氨酸-Y-裂合酶，以及也开发第2测定来在甲烷氢硫基形成后快速测定酶动力学。基于由酶a-丁酮酸的形成来作出对于L-甲硫氨酸降解活性的遗传选择，其进而拯救大肠埃希氏菌(E. coli) ilvA突变体细胞生长。此夕卜，进行饱和诱变和随机诱变之后是对于甲硫氨酸降解的高通量筛选，以分离具有高甲硫氨酸-Y -裂合酶活性的胱硫醚-Y-裂合酶变体。如本文所用，术语“蛋白”和“多肽”指称包含经肽键接合的氨基酸的化合物，且互
换使用。如本文所用，术语“融合蛋白”指称含有以非-天然方式可操作地连接的蛋白或蛋白片段的嵌合蛋白。
如本文所用，术语“半衰期”(1/2-寿命)指称例如，在哺乳动物中注射之后，其多肽浓度体外或体内下降一半会需要的时间。术语“以可操作的组合”，“以可操作的顺序”和“可操作地连接的”指称如此描述的组分处在允许它们以它们的旨在的方式发挥功能的关系中的连接，例如，以核酸分子能指导给定基因的转录和/或期望的蛋白分子的合成的方式的核酸序列的连接，或以融合蛋白产生的方式的氨基酸序列的连接。术语“接头”是指发挥可操作地连接2个不同分子的分子桥的作用的化合物或部分，其中接头的一个部分可操作地连接于第I分子，及其中接头的另一部分可操作地连接于第2分子。术语“聚乙二醇化的”指称与由于其高程度的生物相容性和修饰容易度而已作为药物载体广泛使用的聚乙二醇(PEG)缀合。PEG可经化学方法通过PEG链端的羟基偶联(例如，共价连接)于活性剂；但是，PEG本身限于每分子至多2个活性剂。在不同方法中，已探索PEG和氨基酸的共聚物作为会保留PEG的生物相容性，但会具有每分子多个附接点的添加的优势(由此提供更大药物装载)，且可合成设计以适合各种应用的新生物材料。术语“基因”指称包含产生多肽或其前体必需的控制和编码序列的DNA序列。多肽可由全长编码序列或由保留期望的酶促活性的编码序列的任何部分编码。术语“天然”指称基因，基因产物的典型形式，或自天然存在的来源分离时的基因或基因产物的特征。天然形式是天然群中最常观察的，且由此是任意指定的正常或野生型形式。相反，术语“修饰的”，“变体”或“突变体”指称相比天然基因或基因产物显示序列中的修饰和功能性质(即，改变的特征)的基因或基因产物。术语“载体”用于指称用于导入其可复制的细胞的可插入核酸序列的载体核酸分子。核酸序列可为”外源的”，其表示其对于导入载体的细胞是外源的，或表示序列与在细胞中但在通常不发现序列的宿主细胞核酸之内的位置中的序列是同源的。载体包括质粒，粘粒，病毒(噬菌体，动物病毒及植物病毒)，及人工染色体(例如，YAC)。本领域技术人员会能够通过标准重组技术熟练构建载体(见，例如，Maniatis等人，1988和Ausubel等人，1994,二者均通过引用并入本文)。术语“表达载体”指称包含编码能被转录的RNA的核酸的任何类型的遗传构建体。在一些情况中，RNA分子然后翻译成蛋白，多肽或肽。在其他情况中，这些序列例如，在反义分子或核酶的产生中未翻译。表达载体可含有各种“控制序列”，其指称在特定宿主细胞中可操作地连接的编码序列的转录和可能翻译必需的核酸序列。除了管理转录和翻译的控制序列之外，载体和表达载体可含有也发挥其他功能的核酸序列，且如下描述。本文所用的术语“治疗有效”指称在方法中采用一定量的细胞和/或治疗组合物(诸如治疗性多核苷酸和/或治疗性多肽)，以达到治疗效果，诸如其中所治疗的病情的至少一种症状至少改善，和/或以分析联合这些细胞使用的过程或材料。本文所用的术语“K/指称用于酶的Michaelis-Menten常数，且定义为在酶催化的反应中给定酶产生1/2其最大速度的特定底物的浓度。本文所用的术语“kMt”指称每单位时间各酶位点转变为产物，及酶以最大效率工作的周转数或底物分子数。本文所用的术语“kMt/KM”是特异性常数，其是酶将底物转变为产物如何有效的量度。术语“胱硫醚-Y-裂合酶”(CGL或胱硫醚酶)指称催化胱硫醚 水解为半胱氨酸的任何酶。例如，其包括灵长类动物形式的胱硫醚-Y-裂合酶，或特别，人形式的胱硫醚-Y-裂合酶。I.甲硫氨酸-Y-裂合酶和胱硫醚-Y-裂合酶裂合酶是催化各种化学键断裂，常常形成新双键或新环结构的酶。例如，催化此反应的酶会是裂合酶=ATP — cAMP+PPi。裂合酶不同于其他酶在于，它们对于一方向的反应仅需要一种底物，但对于逆反应仅需要2种底物。许多吡哆醛-5’ -磷酸(PLP)-依赖性酶涉及半胱氨酸，高半胱氨酸和甲硫氨酸的代谢，及这些酶形成进化相关的家族，被称为Cys/Met代谢PLP-依赖性酶。这些酶是约400个氨基酸的蛋白，且PLP基团附接于位于多肽的中心位置的赖氨酸残基。此家族的成员包括胱硫醚-Y-裂合酶(CGL)，胱硫醚-Y -合酶(CGS)，胱硫醚-P -裂合酶(CBL)，甲硫氨酸-Y-裂合酶(MGL)，0_乙酰高丝氨酸(OAH)/0-乙酰-丝氨酸(OAS)硫化氢解酶(OSHS)。对于全部它们共同的是形成Michaelis复合物，产生外部底物醛亚胺。反应的进一步过程通过特定酶的底物特异性测定。例如，发明人将特定突变导入PLP-依赖性裂合酶家族成员诸如人胱硫醚-Y -裂合酶，以改变其底物特异性。以此方式，发明人产生了具有降解L-Met作为底物的新能力的新变体。在其他实施方式中，也可涵盖用于产生新甲硫氨酸降解活性的其他PLP-依赖性酶的修饰。作为PLP-依赖性酶，甲硫氨酸Y-裂合酶(EC 4. 4. I. 11)是催化化学反应L-甲硫氨酸+H2O 0甲硫醇+NH3+2-氧代丁酸的酶。由此，此酶的2种底物是L-甲硫氨酸和H2O,然而其3种产物是甲硫醇，NH3和2-氧代丁酸。此酶属于裂合酶家族，特别是碳-硫裂合酶类。此酶类的系统性名称是L-甲硫氨酸甲硫醇-裂合酶(脱胺基化2-氧代丁酸-形成)。常见使用的其他名称包括L-甲硫氨酸酶，甲硫氨酸裂合酶，甲硫氨酸酶，甲硫氨酸脱硫代甲基酶，L-甲硫氨酸Y-裂合酶和L-甲硫氨酸甲硫醇-裂合酶(脱胺基化)。此酶参与硒代氨基酸代谢。其采用一种辅因子，吡哆醛-5'-磷酸。甲硫氨酸酶通常由389 441个氨基酸组成，且形成同源四聚体。甲硫氨酸酶通常由4个 45kDa的分子量的同一亚基组成(Sridhar等人，2000;Nakamura等人，1984)。酶的结构通过结晶阐明(Kudou等人，2007)。四聚体的各段由3个区组成延伸的N-端结构域(残基I 63)，其包括2个螺旋及3个P -链，大PLP结合结构域(残基64 262)，其由夹入8个a-螺旋之间的通常并行的7个链化的￠-折叠片构成，及C-端结构域(残基263 398)。辅因子PLP对于催化功能是需要的。已基于结构鉴定对于催化重要的氨基酸。也在其他C-家族酶中强烈保守的相邻亚基的Tyr59和Arg61接触PLP的磷酸基团。这些残基作为在活性位点之内的主要锚是重要的。一个单体的Lys240，Asp241和Arg61和相邻单体的Tyrll4和Cysll6在赋予酶特异性的甲硫氨酸酶活性位点中形成氢-键网络。胱硫醚Y -裂合酶(CGL或胱硫醚酶)是将胱硫醚断裂为半胱氨酸和a - 丁酮酸的酶。磷酸吡哆醛是此酶的辅基。尽管哺乳动物不具有甲硫氨酸酶(MGL)，它们具有胱硫醚酶，其在序列，结构和化学同源于细菌MGL酶。如在实施例中显示，使用蛋白加工来将无用于L-甲硫氨酸降解的活性的胱硫醚酶转变为可以高速降解此氨基酸的酶。II.甲硫氨酸酶加工由于人不产生甲硫氨酸-Y-裂合酶(MGL或甲硫氨酸酶)，必需加工用于人治疗的甲硫氨酸酶，其对于在生理条件下降解甲硫氨酸具有高活性和特异性，以及在生理学流体诸如血清中具有高稳定性，且也非-免疫原性，因为它们是正常引发免疫学耐受性的天然 蛋白。由于见于用pMGL的动物研究的不期望的免疫原性效应，期望在人酶中加工L-甲硫氨酸降解活性。人蛋白的免疫学耐受性使该酶会是非-免疫原性或最低限度免疫原性，由此良好耐受成为可能。作为加工的甲硫氨酸酶的具有MGL活性的新酶的特定方面解决这些需求。尽管哺乳动物不具有MGL，它们具有与细菌MGL酶具有序列，结构和化学同源性的胱硫醚-Y -裂合酶(CGL)。CGL是在哺乳动物转硫通路中催化最后步骤的四聚体(Rao等人，1990)。CGL催化L-胱硫醚转变为L-半胱氨酸，a - 丁酮酸和氨(图I)。人CGL (hCGL) cDNA已之前克隆及表达，但具有相对低产率( 5mg/L培养)(Lu等人，1992; Steegborn等人，1999)。例如，已提供与经诱变修饰的灵长类动物(特别人)胱硫醚-Y-裂合酶(CGL或胱硫醚酶)相关的方法和组合物，以高效率水解甲硫氨酸，而胱硫醚-Y -裂合酶不以其天然形式呈现甲硫氨酸酶活性。一些实施方式关心修饰的蛋白和多肽。特定实施方式关心呈现至少一种与未修饰的形式可比较的功能活性，优选，甲硫氨酸酶活性的修饰的蛋白或多肽。在再一方面，可进一步修饰蛋白或多肽，以增加血清稳定性。由此，当本申请说到“修饰的蛋白”或“修饰的多肽”的功能或活性，本领域普通技术人员会明白，此包括，例如，具有超过未修饰的蛋白或多肽，诸如甲硫氨酸酶活性的另外的优势的蛋白或多肽。在特定实施方式中，未修饰的蛋白或多肽是天然胱硫醚-Y-裂合酶，特别人胱硫醚-Y-裂合酶。特别涵盖，关乎“修饰的蛋白”的实施方式可对照“修饰的多肽”实施，且反之亦然。活性测定可使用本领域技术人员熟悉的测定实现，特别关于蛋白的活性，及可包括为比较目的，例如，使用天然和/或重组形式的修饰的或未修饰的蛋白或多肽。例如，甲硫氨酸酶活性可通过任何测定来测定，以检测自甲硫氨酸转变得到的任何底物，诸如a - 丁酮酸，甲硫醇和/或氨的产生。在特定实施方式中，修饰的多肽，诸如修饰的胱硫醚-Y-裂合酶，可基于其甲硫氨酸降解活性的增加鉴定。例如，可鉴定未修饰的多肽的底物识别位点。此鉴定可基于结构分析或同源性分析。可产生涉及该底物识别位点的修饰的一群突变体。在进一步实施方式中，具有增加的甲硫氨酸降解活性的突变体可选自突变体群。期望的突变体的选择可包括方法诸如检测来自甲硫氨酸降解的副产物或产物。
在特定实施方式中，可提供使用包含基因ilvA和metA染色体缺失，使得存在L-异亮氨酸和L-甲硫氨酸的营养缺陷型的需求的加工的大肠埃希氏菌(E. coli)株的方法。当在编码甲硫氨酸Y裂合酶或具有甲硫氨酸降解活性(但不是天然胱硫醚Y裂合酶)的加工的胱硫醚Y-裂合酶的质粒存在下提供补充L-甲硫氨酸的培养基时，其可允许通过产生a-丁酮酸拯救L-异亮氨酸营养缺陷。方法可通过最小化来自也可产生a-丁酮酸的其他通路的效应来辅助鉴定具有甲硫氨酸降解活性的突变体。修饰的蛋白可具有氨基酸的缺失和/或取代；由此，具有缺失的蛋白，具有取代的蛋白，及具有缺失和取代的蛋白是修饰的蛋白。在一些实施方式中，这些修饰的蛋白可还包括插入或诸如用融合蛋白添加的氨基酸，或具有接头的蛋白，例如。“修饰的删除的蛋白”缺乏天然蛋白的一个或更多残基，但可具有天然蛋白的特异性和/或活性。“修饰的删除的蛋白”也可具有减小的免疫原性或抗原性。修饰的删除的蛋白的一例是具有从至少一个抗原性区删除的氨基酸残基的蛋白，所述抗原性区是测定为在特定生物，诸如可施用修饰的蛋 白的生物类型中具有抗原性的蛋白区。取代或取代变体一般含有在蛋白之内的一个或更多位点用一个氨基酸交换另一氨基酸，且可设计为调节多肽的一种或更多性质，特别是其效应子功能和/或生物利用度。取代可或可不是保守性，即，一个氨基酸用类似形状和电荷的氨基酸取代。保守性取代由本领域熟知，且包括，例如，下列变化丙氨酸变为丝氨酸；精氨酸变为赖氨酸；天冬酰胺变为谷氨酰胺或组氨酸；天冬氨酸变为谷氨酸；半胱氨酸变为丝氨酸；谷氨酰胺变为天冬酰胺；谷氨酸变为天冬氨酸；甘氨酸变为脯氨酸；组氨酸变为天冬酰胺或谷氨酰胺；异亮氨酸变为亮氨酸或缬氨酸；亮氨酸变为缬氨酸或异亮氨酸；赖氨酸变为精氨酸；甲硫氨酸变为亮氨酸或异亮氨酸；苯丙氨酸变为酪氨酸，亮氨酸或甲硫氨酸；丝氨酸变为苏氨酸；苏氨酸变为丝氨酸；色氨酸变为酪氨酸；酪氨酸变为色氨酸或苯丙氨酸；及缬氨酸变为异亮氨酸或亮氨酸。除了缺失或取代之外，修饰的蛋白可具有残基的插入，其一般涉及在多肽中添加至少一个残基。此可包括插入靶向肽或多肽或简单地单残基。以下讨论末端添加，称之为融合蛋白。术语“以生物学方式功能相当体”为本领域熟知，且在本文进一步详细定义。因此，包括具有约70%和约80%之间，或约81%和约90%之间，或甚至约91%和约99%之间的与对照多肽的氨基酸同一或功能性地相当的氨基酸的序列，只要维持蛋白的生物学活性。修饰的蛋白可在特定方面与其天然对应物以生物学方式功能性地相当。也明白，氨基酸和核酸序列可包括另外的残基，诸如另外的N-或C-端氨基酸或5’或3’序列,及仍是基本上如本文公开的序列之一所示,只要序列符合以上所示标准,包括涉及蛋白表达时维持生物学蛋白活性。末端序列的添加特别应用于可，例如，包括侧接编码区的5’或3’部分的各种非-编码序列，或可包括各种内部序列，即，已知在基因之内存在的内含子的核酸序列。III.用于治疗的酶促L-甲硫氨酸耗尽在特定方面，多肽可用于用新的耗竭L-甲硫氨酸的酶治疗疾病，包括敏感于甲硫氨酸耗尽的癌，诸如肝细胞癌，黑色素瘤和肾细胞癌。本发明特别公开使用具有甲硫氨酸降解活性的修饰的胱硫醚-Y-裂合酶的治疗方法。如下所述，由于目前可利用的甲硫氨酸-Y-裂合酶一般是源于细菌的蛋白，仍有用于它们在人治疗中使用的几个问题。本发明的特定实施方式提供用于增加的治疗性功效的具有甲硫氨酸-Y-裂合酶活性的新酶。作为癌的潜在治疗已长时间研究甲硫氨酸(L-Met)耗尽。而L-Met是必要的氨基酸，许多恶性人细胞系和肿瘤已显示具有相对更大的对甲硫氨酸的需求(Halpern等人，1974; Kreis 和 Goodenow, 1978; Breillout 等人，1990; Kreis 等人，1980; Kreis, 1979)。甲硫氨酸-依赖性肿瘤细胞系呈现无或低水平的甲硫氨酸合酶，将高半胱氨酸正常再环化回L-Met的酶(Halpern等人，1974;Ashe等人，1974)。多数正常细胞可在前体如高半胱氨酸和高胱氨酸上生长，然而许多恶性细胞必需自它们的细胞外环境直接清除L-Met。而且，任何快速生长的肿瘤可被对于生长必需的必要的构件的缺乏不利地影响。甲硫氨酸特别重要，由于其耗尽不仅导致减小的蛋白合成，而且失调S-腺苷基甲硫氨酸(SAM)依赖性甲基化通路，其对于基因调节特别重要。正常和癌细胞之间的甲硫氨酸需求的差异提供治疗性机会。已在许 多动物模型研究以及I期临床试验中探索酶促甲硫氨酸耗尽(Tan等人，1997a; Tan等人，1996a; Lishko等人，1993; Tan 等人，1996b; Yoshioka 等人，1998; Yang 等人，2004a; Yang 等人，2004b; Tan等人，1997b)。因为人缺乏甲硫氨酸水解酶，已评价用于癌治疗的自各种来源的细菌L-甲硫氨酸-Y-裂合酶，MGL。甲硫氨酸-Y-裂合酶催化甲硫氨酸转变为甲硫醇，a-丁酮酸和氨。已纯化自各种来源的细菌酶，及测试为针对癌细胞系的甲硫氨酸耗竭剂。由于其相比其他来源的高催化性活性，低Km和相对高keat值，选择恶臭假单胞菌(P. putida) (pMGL)来源用于治疗性应用(Esaki and Soda, 1987; Ito et al.，1976)。此外，用于pMGL的基因已克隆进大肠埃希氏菌(E. coli)，且蛋白以高蛋白产率表达(Tan等人，1997a;Hori等人，1996)。已在动物模型，以及人上进行体内研究。Tan等人用在裸鼠中异种移植的人肿瘤进行了研究，且发现，肺，结肠，肾，脑，前列腺和黑色素瘤癌全部敏感于PMGL (Tan等人，1997a)。此外，以有效剂量未检测到毒性(如通过无动物中体重减轻测定)。测定在这些实验中的半衰期为仅2小时，如自收集的血样品测量。此外，需要PLP的输注，以便维持MGL活性。尽管非常短半衰期，Tan等人报道了相比盐水对照，肿瘤生长的抑制。Yang等人在灵长类动物模型中研究了关于甲硫氨酸耗尽的药代动力学，药效学，MGL的抗原性和毒性(Yang等人，2004b)。以静脉内施用的1000 4000U/kg进行剂量-范围研究。注射之后30分钟最高剂量能减少血浆甲硫氨酸至不可检测的水平(小于0. 5 PM)，甲硫氨酸水平保持不可检测8小时。药代动力学分析显示，pMGL以2. 5小时的半衰期消除。每8小时/天的该剂量施用2周导致血浆甲硫氨酸的稳定-状态耗尽至小于2 u M0通过降低的食品摄入和轻微体重减轻观察到弱毒性。不幸的是，在第28天再攻击在一个动物中导致过敏性休克和死亡，指示PMGL是高度免疫原性，其对于人治疗是显著缺点。随后用氢化可的松预处理防止过敏性反应，尽管常观察到呕吐。在第66，86和116天进行另外的再攻击。第I攻击之后检测到抗-rMGL抗体，及在治疗的持续时间浓度增加。应对这些观察到的MGL的治疗性实施的障碍，Yang等人研究了酶的聚乙二醇化和其对半衰期和免疫原性的效应。将酶偶联于甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺基戊二酸盐(MEGC-PEG-5000)。再次进行剂量范围研究，且4，000U/kg(90mg/kg)足以经12小时减少血浆甲硫氨酸至〈5 ymol/L。药代动力学分析显示相比未聚乙二醇化的酶，聚乙二醇化的酶的血清清除半衰期的36倍改善。聚乙二醇化也衰减多少免疫原性，由于观察到降低的食品摄入的仅轻微毒性和少数体重减轻。但是，与未聚乙二醇化的酶8小时相反，活性半衰期未随着L-Met水平改善，仅保持检测水平以下12小时。这些结果，尽管许诺L-Met作为抗-肿瘤形成剂耗竭酶的能力，被免疫原性和药代动力学的显著缺点挑战。本发明的特定方面提供用于治疗疾病，诸如肿瘤的具有甲硫氨酸降解活性的修饰的胱硫醚-Y-裂合酶。特别是，修饰的多肽可具有人多肽序列，由此可在人患者中预防过敏性反应，允许重复的施剂，及增加治疗性功效。可应用本治疗方法的肿瘤包括任何恶性细胞类型诸如见于实体瘤或血液肿瘤的那些。例示实体瘤可包括，但不限于选自下列的器官肿瘤胰腺，结肠，盲肠，胃，脑，头，颈，卵巢，肾，喉，肉瘤，肺，膀胱，黑色素瘤，前列腺和乳腺。例示血液肿瘤包括骨髓肿瘤，T或B细胞恶性肿瘤，白血病,淋巴瘤,母细胞瘤,骨髓瘤,等。 源于胱硫醚酶的加工的人甲硫氨酸酶可在本文中以自患癌哺乳动物的肿瘤细胞，肿瘤组织或循环耗竭甲硫氨酸，或耗尽被认为是期望的甲硫氨酸耗尽的各种模式作为抗肿瘤剂使用。耗尽可在哺乳动物循环中体内进行，在期望组织培养或其他生物学培养基中甲硫氨酸耗尽的情况中体外进行，及在生物学流体，细胞或组织在身体之外操作和随后返回患者哺乳动物身体时离体进行。进行甲硫氨酸自循环，培养基，生物学流体或细胞的耗尽，以减少可接近被处理物质的甲硫氨酸的量，由此包括使待耗竭的物质与甲硫氨酸-耗竭量的加工的人甲硫氨酸酶在甲硫氨酸-耗竭条件下接触，以降解被接触物质中的环境甲硫氨酸。因为肿瘤细胞依赖于它们的甲硫氨酸营养培养基，耗尽可针对细胞的营养来源，且不必然细胞本身。因此，在体内应用中，治疗肿瘤细胞包括使一群肿瘤细胞的营养培养基与加工的甲硫氨酸酶接触。在此实施方式中，培养基可为期望甲硫氨酸耗尽的血，淋巴液，脊髓液等体液。甲硫氨酸-耗竭效率可依赖于应用广泛改变，及一般依赖于物质中存在的甲硫氨酸的量，期望的耗尽速度，及物质暴露于甲硫氨酸酶的耐受性。物质中的甲硫氨酸水平，由此甲硫氨酸自物质耗尽的速度，可通过本领域熟知的各种化学和生物化学方法容易监控。例示甲硫氨酸-耗竭量在本文中进一步描述，及可跨0.001 100U (U)的加工的甲硫氨酸酶，优选约0.01 10U，及更优选约0. I 5U加工的甲硫氨酸酶/ml (ml)的待处理的物质。甲硫氨酸-耗竭条件是与甲硫氨酸酶的生物学活性相容的缓冲剂和温度条件，且包括与酶相容的中等温度，盐和PH条件，例如，生理条件。例示条件包括约4 40°C，相当于约0. 05 0. 2M NaCl的离子强度，及约5 9的pH，同时包括生理条件。在特定实施方式中，本发明涵盖使用加工的甲硫氨酸酶作为抗肿瘤剂的方法，由此包括，使一群肿瘤细胞与治疗有效量的加工的甲硫氨酸酶接触足以抑制肿瘤细胞生长的时期。在一实施方式中，通过静脉内或腹膜内注射来给患者施用治疗有效量的含有本发明的加工的甲硫氨酸酶的生理学容许的组合物来实施体内接触，由此耗竭存在于患者中的肿瘤细胞的循环甲硫氨酸来源。加工的甲硫氨酸酶的接触也可通过向含有肿瘤细胞的组织施用加工的甲硫氨酸酶来实施。加工的甲硫氨酸酶的治疗有效量是计算为达到期望效果的预定的量，S卩，耗竭肿瘤组织或患者的循环中的甲硫氨酸，由此导致肿瘤细胞停止分裂的量。由此，施用本发明的加工的甲硫氨酸酶的剂量范围是大到足够产生减少肿瘤细胞分裂症状和细胞周期的期望效果的范围。剂量不应大到造成不利的副作用，诸如超粘滞性综合征，肺部水肿，充血性心力衰竭，等。一般而言,剂量会随着患者的龄,病情,性别和疾病程度而改变,且可由本领域技术人员测定。如有有任何并发症，剂量可由个体医师调整。例如，加工的甲硫氨酸酶的治疗有效量可为使得当在生理学容许的组合物中施用时足以达到约0. 001 约100U (U)/ml，优选约0. IU以上，及更优选IU以上的加工的甲硫氨酸酶/ml的血管内(血浆)或局部浓度的量。典型剂量可基于体重施用，且在约5 1000U/kg (kg) /天，优选约5 100U/kg/天，更优选约10 50U/kg/天，及更优选约20 40U/kg/天的范围。加工的甲硫氨酸酶可通过注射或通过经时逐渐输注而肠胃外施用。加工的甲硫氨
酸酶可静脉内，腹膜内，经口，肌内，皮下，腔内，透皮，经皮施用，可通过蠕动手段递送，或可直接注射进含有肿瘤细胞的组织或可由连接于可含有潜在生物传感器或甲硫氨酸的导管的泵施用。含有加工的甲硫氨酸酶的治疗组合物例如作为单元剂量的注射常规静脉内施用。术语"单元剂量"当参照治疗组合物使用时指称作为用于受试者的单元剂型适合的物理学独立单元，各单元含有计算为结合需要的稀释剂(即，载体或媒质)而产生期望的治疗效果的预定量的活性物质。组合物以与剂量制剂相容的方式，及以治疗有效量施用。待施用的量依赖于待治疗的受试者，受试者的系统利用活性成分的能力，及期望的治疗效果的程度。施用需要的活性成分的精确的量依赖于医师的判断，且对于各个体是特有的。但是，本文公开了系统性应用的适合的剂量范围，且依赖于施用途径。也涵盖用于初始施用和追加施用的适合的方案，且以初始施用之后是以I或更多小时间隔由随后注射或其他施用的重复的剂量为典型。本文描述了例示多施用，且特别优选维持连续高血清和组织水平的加工的甲硫氨酸酶及逆地低血清和组织水平的甲硫氨酸。或者，涵盖足够维持以对于体内治疗特定的范围的血中浓度的连续静脉内输注。IV.缀合物本发明的组合物和方法涉及为改善而加工的甲硫氨酸酶的进一步修饰，诸如通过与异源肽段或聚合物诸如聚乙二醇形成缀合物。在再一方面，可将加工的甲硫氨酸酶连接到PEG，以增加酶的水动力半径，因此增加血清存留。在特定方面，可将公开的多肽缀合于任何靶向剂诸如具有特异性和稳定地结合肿瘤细胞上的外部受体或结合位点的能力的配体(美国专利公开No. 2009/0304666)oA.融合蛋白本发明的特定实施方式关乎融合蛋白。这些分子可具有在N-或C-端连接到异源结构域的修饰的胱硫醚酶。例如，融合也可采用来自其他物种的前导序列，以允许异源宿主中蛋白的重组表达。另一有用的融合包括添加蛋白亲和性标签如6组氨酸残基或免疫学有活性的结构域，诸如抗体表位，优选可切割的，以辅助融合蛋白的纯化。非限制性亲和性标签包括聚组氨酸，壳多糖结合蛋白(CBP)，麦芽糖结合蛋白(MBP)，及谷胱甘肽-S-转移酶(GST)0在特定实施方式中，可将修饰的胱硫醚Y-裂合酶连接到增加体内半衰期的肽，诸如 XTEN 多妝(Schellenberger 等人，2009)。本领域技术人员熟知产生融合蛋白的方法。该蛋白可，例如，通过新合成完全融合蛋白，或通过附接编码异源结构域的DNA序列，之后是表达完整融合蛋白来产生。恢复亲本蛋白的功能活性的融合蛋白的产生可由基因与编码在串联连接的多肽之间剪接的肽接头的桥接DNA段的连接所辅助。接头会是足够的长度，以允许得到的融合蛋白的适当的折叠。B.接头
在特定实施方式中，加工的甲硫氨酸酶可使用双功能交联试剂化学缀合或在蛋白水平与妝接头融合。已广泛地用于各种目的的双功能交联试剂包括亲和性基质的制备，多样的结构的修饰和稳定，配体和受体结合位点的鉴定，及结构研究。适合的肽接头也可用于连接加工的甲硫氨酸酶，诸如Gly-Ser接头。携带2个相同官能团的同双官能试剂被证明在诱导相同和不同大分子或大分子亚基之间的交联，及多肽配体与它们的特异性结合位点的连接中高度有效。异双官能试剂含有2个不同官能团。通过取2个不同官能团的差异反应性的优势，交联可选择性地和依次控制。双功能交联试剂可根据它们的官能团，例如，氨基，巯基，胍基，吲哚，羧基特定基团的特异性分。在这些中，针对游离的氨基的试剂尤其受欢迎，因为它们的商业利用度，合成的容易和它们可应用的弱反应条件。大部分异双官能交联试剂含有伯胺-反应性基团和氢硫基-反应性基团。在另一例中，描述了使用交联试剂的异双官能交联试剂和方法(美国专利No. 5，889，155，特别通过引用整体并入本文)。交联试剂组合亲核酰肼残基与亲电子马来酰亚胺残基，允许在一例中，醛与游离的氢硫基偶联。可将交联试剂修饰为交叉-连接各种官能团。此外，本领域技术人员知道的任何其他连接/偶联剂和/或机理可用于组合人加工的甲硫氨酸酶，诸如，例如，抗体-抗原相互作用，亲和素生物素连接，酰胺连接，酯连接，硫酯连接，醚连接，硫醚连接，磷酸酯连接，磷酰胺连接，酐连接，二硫键，离子和疏水相互作用，双特异性抗体和抗体片段，或其组合。优选的是，采用在血中具有合理的稳定性的交联接头。已知多种类型的含有二硫键的接头，其可被成功地用于缀合靶向及治疗剂/预防剂。含有立体地阻碍的二硫键的接头可证明提供更大体内稳定性。这些接头由此是一组连接剂。除了阻碍的交联接头之外，也可根据本文采用非-阻碍的接头。其他有用的交联接头，不被认为含有或产生保护的二硫化物，包括SATA，SPDP和2-亚氨基硫杂环戊烷(ffawrzynczak&Thorpe, 1987)0本领域熟知该交联接头的使用。另一实施方式涉及柔性的接头的使用。一旦化学缀合，通常会纯化肽，以自未缀合的剂及自其他混杂物分离缀合物。大量的纯化技术在提供足够的程度的纯度的缀合物，以致使它们临床有用中可利用。通常最常使用的纯化方法基于尺寸分离，诸如凝胶过滤，凝胶渗透或高效液相层析。也可使用其他层析技术，诸如蓝-琼脂糖分离。自包含体纯化融合蛋白的常规方法可为有用的，诸如使用弱去污剂如N-月桂酰-肌氨酸钠(SLS)。C.聚乙二醇化在本发明中的特定方面，公开了与加工的甲硫氨酸酶的聚乙二醇化相关的方法和组合物。例如，加工的甲硫氨酸酶可根据本文公开的方法聚乙二醇化。聚乙二醇化是聚(乙二醇)聚合物链与另一分子，通常是药物或治疗性蛋白共价连接的方法。聚乙二醇化通过PEG的反应性衍生物与靶大分子的温育来常规实现。PEG与药物或治疗性蛋白的共价连接可"掩罩"自宿主的免疫系统的剂(降低的免疫原性和抗原性)，增加通过减少肾清除延长其循环时间的剂的水动力尺寸(溶液中的尺寸)。聚乙二醇化也可提供对疏水药物和蛋白的水溶解性。聚乙二醇化的第I步骤是PEG聚合物在一个或两个末端的适合的官能化。在具有相同的反应性部分的各末端活化的PEG已知为“同双官能”，然而如果存在的官能团不同，·则PEG衍生物称之为“异双官能”或“异功能”。制备PEG聚合物的化学活性的或活化的衍生物，以将PEG附接于期望的分子。用于PEG衍生物的适合的官能团的选择基于会偶联于PEG的分子上的可利用的反应性基团的类型。对于蛋白，典型反应性氨基酸包括赖氨酸，半胱氨酸，组氨酸，精氨酸，天冬氨酸，谷氨酸，丝氨酸，苏氨酸，酪氨酸。也可使用N-端氨基和C-端羧酸。用来形成第I代PEG衍生物的技术是通常PEG聚合物和与羟基反应性的基团，一般酐，酰氯，氯仿和碳酸基的反应。在第2代聚乙二醇化化学中，更有效的官能团诸如醛，酯，酰胺等用于缀合。聚乙二醇化的应用变得更加进展及复杂，对于用于缀合的异双官能PEG的需求已增加。这些异双官能PEG在连接2个实体中非常有用，其中需要亲水，柔性的和生物相容性间隔物。用于异双官能PEG的优选的端基是马来酰亚胺，乙烯基砜，吡啶基二硫化物，胺，羧酸和NHS酯。最常见的修饰剂，或接头，基于甲氧基PEG (mPEG)分子。它们的活性依赖于向醇端添加蛋白-修饰基团。在一些实例中，将聚乙二醇(PEG 二元醇)用作前体分子。二元醇随后在两端修饰，以便制造异源二聚体或同源二聚体PEG-连接的分子(如在用PEG双-乙烯基砜的例中显示)。蛋白通常在亲核位点诸如未质子化的氢硫基(半胱氨酰残基)或氨基聚乙二醇化。半胱氨酰-特异性修饰试剂的例包括PEG马来酰亚胺，PEG碘代乙酸酯，PEG氢硫基和PEG乙烯基砜。全部4种在弱条件和中性至稍微碱性pH下是强烈半胱氨酰-特异性的，但各具有一些缺点。用马来酰亚胺形成的酰胺可在碱性条件下多少不稳定，由此对具有此接头的制剂选项可有一些限制。用碘PEG形成的酰胺连接是更稳定的，但游离碘可在一些条件下修饰酪氨酸残基。PEG氢硫基与蛋白氢硫基形成二硫键，但此连接在碱性条件下也可不是稳定的。PEG-乙烯基砜反应性相比马来酰亚胺和碘PEG是相对慢；但是，形成的硫醚连接是相当地稳定的。其更慢反应速度也可使PEG-乙烯基砜反应更容易控制。在天然半胱氨酰残基的定点聚乙二醇化稀少进行，由于这些残基通常在二硫键的形式或对于生物学活性需要。另一方面，定点诱变可用于合并用于氢硫基-特异性接头的半胱氨酰聚乙二醇化位点。必需设计半胱氨酸突变，使得其可接近聚乙二醇化试剂，且在聚乙二醇化之后仍以生物学方式有活性。胺-特异性修饰剂包括PEG NHS酯，PEG三氟乙基磺酸酯，PEG醛，PEG异硫氰酸酯和几种其他酯。全部在弱条件下反应，且对于氨基非常特异性。PEG NHS酯很可能是更反应性的剂之一；但是，其高反应性可使聚乙二醇化反应在大规模难控制。PEG醛与氨基形成亚胺，其然后用氰硼氢化钠还原为仲胺。不像硼氢化钠，氰硼氢化钠不会还原二硫键。但是，此化学品是高度毒性的和必需是谨慎地操作的，特别在更低PH中，其中其变得挥发性。由于多数蛋白上多个赖氨酸残基，定点聚乙二醇化可为挑战。幸运地，因为这些试剂与未质子化的氨基反应，其是可能通过在更低PH进行反应而将聚乙二醇化导向更低-PK氨基。通常，α-氨基的pK是I 2pH单元少于赖氨酸残基的ε-氨基。通过在ρΗ7或更低pH聚乙二醇化分子，常可达到对于N-端的高选择性。但是，此仅当蛋白的N-端部分对于生物学活性不是需要的时可行。尚且，自聚乙二醇化的药代动力学益处常重于体外生物活性的显著损失，无论聚乙二醇化化学而产生具有更大得多体内生物活性的产物。
当开发聚乙二醇化方法时，有几个参数需要考虑。幸运地，通常有不多于4或5个关键参数。接近聚乙二醇化条件的优化的"实验的设计"可非常有用。对于氢硫基-特异性聚乙二醇化反应，需要考虑的参数包括蛋白浓度，PEG —蛋白比(基于摩尔)，温度，pH，反应时间，及在一些实例中，氧的排除。(氧可贡献于由蛋白的分子间二硫化物形成，其会减少聚乙二醇化的产物的产率)。对于胺-特异性修饰(除了氧之外)应考虑相同的因素，除了PH可甚至更关键之外，特别当靶向N-端氨基时。对于胺-特异性和氢硫基-特异性修饰，反应条件可影响蛋白的稳定性。此可限制温度，蛋白浓度，及pH。此外，在起始聚乙二醇化反应之前，应知道PEG接头的反应性。例如，如果聚乙二醇化剂是仅70%有活性的，使用的PEG量应确保仅有活性的PEG分子计入蛋白一 PEG反应化学计量。V.蛋白和肽在特定实施方式中，本发明关心包含至少一种蛋白或肽，诸如加工的甲硫氨酸酶的新组合物。这些肽可包含于融合蛋白或缀合于以上描述的剂。如本文所用，蛋白或肽通常指称，但不限于，大于约200个氨基酸，达自基因翻译的全长序列的蛋白；大于约100个氨基酸的多肽；和/或约3 约100个氨基酸的肽。为便利，术语“蛋白”，“多肽”和“肽”在本文互换使用。如本文所用，“氨基酸残基”指称任何天然存在的氨基酸，本领域知道的任何氨基酸衍生物或任何氨基酸模拟物。在特定实施方式中，蛋白或肽的残基是连续的，无间断氨基酸残基的序列的任何非-氨基酸。在其他实施方式中，序列可包含一个或更多非-氨基酸部分。在特定实施方式中，蛋白或肽的残基序列可由一个或更多非-氨基酸部分间断。因此，术语“蛋白或肽”包括包含见于天然存在的蛋白的20种常见的氨基酸中的至少一种，或至少一个修饰的或罕见的氨基酸，包括但不限于下表I显示的那些的氨基酸序列。蛋白或肽可由本领域技术人员知道的任何技术制造，包括蛋白，多肽或肽通过标准分子生物学技术的表达，蛋白或肽自天然的来源的分离，或蛋白或肽的化学合成。对应于各种基因的核苷酸和蛋白，多肽和肽序列之前已公开，且可见于本领域普通技术人员知道的计算机化的数据库。一种该数据库是美国生物技术信息中心的Genbank和GenPept数据库(在万维网的ncbi.nlm.nih.gov/上可利用)。知道的基因的编码区可使用本文公开的技术或如本领域普通技术人员已知扩增和/或表达。或者，本领域技术人员已知蛋白，多肽和肽的各种商业制备物。VI.核酸和载体在本发明的特定方面，可公开编码加工的甲硫氨酸酶或含有修饰的胱硫醚酶的融合蛋白的核酸序列。基于此，待使用的表达系统，核酸序列可基于的常规方法选择。例如，加工的甲硫氨酸酶源于人胱硫醚酶，且含有可干扰表达的在大肠埃希氏菌(E. coli)中罕见利用的多个密码子，因此相应基因或其变体可对于大肠埃希氏菌(E. coli)表达为密码子优化的。也可使用各种载体来表达目标蛋白，诸如加工的甲硫氨酸酶。例示载体包括，但未限于，质粒载体，病毒载体，基于转座子或脂质体的载体。VII.宿主细胞宿主细胞可为可转化以允许加工的甲硫氨酸酶和其缀合物的表达和分泌的任 何细胞。宿主细胞可为细菌，哺乳动物细胞，酵母或丝状真菌。各种细菌包括埃希氏菌属(Escherichia)和芽抱杆菌属(Bacillus)。属于酵母菌属(Saccharomyces),克鲁维酵母属(Kluyveromyces),汉逊酵母属(Hansenula)或毕赤酵母属(Pichia)的酵母发现作为适当的宿主细胞使用。可将丝状真菌的各种物种用作表达宿主，包括下列属曲霉属(Aspergillus),木霉属(Trichoderma),链抱霉属(Neurospora),青霉属(Penicillium),头孢菌属(Cephalosporium),绵霉属(Achlya),足孢菌属(Podospora),内座壳菌属(Endothia),毛霉菌属(Mucor),弯抱霉属(Cochliobolus)和梨胞霉属(Pyricularia)。可使用的宿主生物的例包括细菌，例如，大肠埃希氏菌(Escherichia coli)MC1061,枯草芽抱杆菌(Bacillus subtil is) BRBl 的衍生物(Sibakov 等人,1984),金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus) SAI123 (Lordanescu, 1975)或浅青紫链球菌(Streptococcus lividans ) (Hopwood 等人，1985);酵母，例如，酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae) AH 22 (Mellor 等人，1983)和粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)；丝状真菌，例如，沟巢曲霉(Aspergillus nidulans),泡盛曲霉(Aspergillus awamori)(Ward, 1989),瑞氏木霉(Trichoderma reesei) (Penttila 等人，1987;Harkki et al, 1989)。哺乳动物宿主细胞的例包括中国仓鼠卵巢细胞(CH0_K1;ATCCCCL61)，大鼠垂体细胞(GH1;ATCC CCL82), HeLa S3 细胞(ATCCCCL2. 2)，大鼠肝细胞瘤细胞(H-4-II_E;ATCCCRL1548) SV40-转化的猴肾细胞(COS-1;ATCC CRL 1650)和鼠胚胎细胞(NIH_3T3;ATCC CRL1658)。本领域知道上述是例证性，但不限于许多可能的宿主生物。原理上，可使用能分泌的全部宿主，无论是原核生物或真核生物。表达加工的甲硫氨酸酶和/或它们的融合蛋白的哺乳动物宿主细胞在培养亲本细胞系中一般采用的条件下培养。一般而言，将细胞在含有生理学盐和营养的标准培养基中培养，诸如标准RPMI，MEM，IMEM或DMEM，一般补充5 10%血清，诸如胚胎牛血清。培养条件也是标准的，例如，将培养物于37°C在固定或辊培养中温育，直到达到期望的水平的蛋白。VIII.蛋白纯化蛋白纯化技术为本领域技术人员熟知。这些技术涉及，在一个水平，细胞，组织或器官均化和粗分级分离为多肽和非-多肽级分。目标蛋白或多肽可使用层析和电泳技术进一步纯化而达到部分或完全纯化(或纯化至同质性)，除非另外特定的。对于制备纯肽特别适合的分析方法是离子交换层析，凝胶排阻层析，聚丙烯酰胺凝胶电泳，亲和层析，免疫亲和性层析和等电聚焦。纯化肽的特别有效方法是快效液相层析(FPLC)或甚至高效液相层析(HPLC)。纯化的蛋白或肽旨在指称，可自其他组分分离的组成，其中蛋白或肽纯化至相对于其天然地-可获得的状态的任何程度。因此，分离的或纯化的蛋白或肽，也指称自其可天然地存在的环境游离的蛋白或肽。一般而言，“纯化的”会指称已经历分级分离以移出各种其他组分，且其组成基本上保留其表达的生物学活性的蛋白或肽组合物。其 中使用术语“基本上纯化的”，此指定会指称蛋白或肽形成组合物的主要组分的组合物，诸如在组合物中构成约50%，约60%，约70%，约80%，约90%，约95%或更多的蛋白。蛋白纯化中适合使用的各种技术为本领域技术人员熟知。这些包括，例如，用硫酸铵沉淀，PEG，抗体等，或通过加热变性，之后是离心；层析步骤诸如离子交换，凝胶过滤，反相，羟基磷灰石和亲和层析；等电聚焦；凝胶电泳；及这些和其他技术的组合。如在本领域通常知道，认为，进行各种纯化步骤的顺序可变化，或认为特定步骤可忽略，且仍导致制备基本上纯化的蛋白或肽的适合的方法。本领域技术人员根据本公开已知定量蛋白或肽的纯化程度的各种方法。这些包括，例如，测定有活性的级分的比活性，或通过SDS/PAGE分析评定级分之内的多肽量。优选的评定级分纯度的方法是计算级分的比活性，将其与初始提取物的比活性比较，及由此计算其纯度程度，由纯化倍数”评定。用于代表活性量的实际单位会，当然，依赖于选择来后随纯化的特定检定技术，且是否表达的蛋白或肽呈现可检测的活性。无对于总是以它们的最纯化的状态提供蛋白或肽的一般需求。的确，涵盖的是，欠基本上纯化的产物可在特定实施方式中具有实用性。可通过组合使用更少纯化步骤，或通过利用不同形式的相同的通用的纯化方案实现部分纯化。例如，需知，利用HPLC设备进行的阳离子交换柱层析通常会相比利用低压层析系统的相同的技术导致更大倍数”纯化。呈现更低程度的相对纯化的方法可在蛋白产物的总回收率，或在维持表达的蛋白的活性中具有优势。在特定实施方式中，蛋白或肽可分离或纯化的，例如，加工的甲硫氨酸酶，含有加工的甲硫氨酸酶的融合蛋白，或聚乙二醇化后的加工的甲硫氨酸酶。例如，His标签或亲和性表位可包含于该加工的甲硫氨酸酶，以辅助纯化。亲和层析是依赖于待分离的物质和其可特异性结合的分子之间的特异性亲和性的层析过程。此是受体-配体类型的相互作用。柱材料通过将结合偶体之一与不溶性基质共价偶联来合成。柱材料然后能自溶液特异性吸附物质。洗脱通过改变对于结合不会发生的那些的条件(例如，改变的PH，离子强度，温度，等)而发生。基质应是本身不吸附分子至任何显著程度及具有广普化学，物理和热稳定性的物质。配体应以不影响其结合性质的方式偶联。配体也应提供相对紧密结合。且不毁坏样品或配体而洗脱物质应是可能的。大小排阻层析(SEC)是溶液中的分子基于它们的尺寸，或以更技术性的术语，它们的水动力体积分离的层析方法。其通常应用于大分子或大分子复合物诸如蛋白和工业聚合物。一般而言，当应用水溶液来通过柱运输样品时，技术已知为凝胶过滤层析，对比名称凝胶渗透层析，其在将有机溶剂用作移动相时使用。SEC的原理的基础是不同尺寸的粒子会以不同速度通过固定相洗脱(过滤)。此导致基于尺寸的粒子溶液分离。只要是全部粒子是同时或接近同时装载的，相同的尺寸的粒子应一起洗脱。各大小排阻柱具有可分离的一系列分子量。排除限在此范围的上端限定分子量，且是分子对于在固定相中捕获太大。渗透限在分离范围的下端限定分子量，且足够小的尺寸的分子可完全穿透固定相的孔隙，且此分子质量以下的全部分子小至它们作为单条带洗脱。 高效液相层析(或高压液相层析，HPLC)是在生物化学和分析化学常用来分离，鉴定及定量化合物的一种形式的柱层析。HPLC利用把持层析包装材料的柱(固定相)，使移动相通过柱移动的泵，及显示分子的滞留时间的检测器。滞留时间依赖于固定相，分析的分子，及使用的溶剂之间的相互作用改变。[IX.药学组合物涵盖的是，新甲硫氨酸酶可全身或局部施用以在患局部进展的或转移性癌的癌患者中抑制肿瘤细胞生长及，最优选地，杀癌细胞。它们可静脉内，鞘内和/或腹膜内施用。它们可单独或组合抗-增殖药物施用。在一实施方式中，它们施用，以在手术或其他过程之前减少患者中的癌负荷。或者，它们可在手术之后施用，以确保任何余下癌(例如手术未能消除的癌)不生存。本发明不旨在被治疗性制备物的特定性质限制。例如，该组合物可以与生理学容许的液体，凝胶或固体载体，稀释剂和赋形剂一起的制剂提供。可将这些治疗性制备物施用于哺乳动物，为兽医学使用，诸如家畜，及在以与其他治疗剂类似的方式在人中临床应用。一般而言，治疗性功效需要的剂量会根据使用类型和施用模式，以及个体受试者的列举的需求而改变。该组合物一般制备为液体溶液或悬浮液，作为注射物。适合的稀释剂和赋形剂是，例如，水，盐水，右旋糖，甘油，等，及其组合。此外，如果需要，组合物可含有少量的辅助物质诸如润湿或乳化剂，稳定化或PH缓冲剂。当涵盖临床应用时，制备以对于旨在的应用适当的形式包含蛋白，抗体和药物的药物组合物可为必需。一般而言，药物组合物可包含有效量的一种或更多胱硫醚酶变体或在药学可接受的载体中溶解的或分散的另外的剂。短语“药学或药理学可接受的”指称当施用给动物，诸如，例如，人时(根据需要)不产生不利的，过敏性或其他不利的反应的分子实体和组合物。本领域技术人员根据本公开已知含有由本文公开的方法分离的至少一种胱硫醚酶变体，或另外的活性成分的药物组合物的制备物，如例示于Remington’sPharmaceutical Sciences, 18th Ed. , 1990,其通过引用并入本文。而且,对于动物(例如,人)施用，需知，制备应符合FDA Office of Biological Standards要求的无菌性,热原性，一般安全性和纯度标准。如本文所用，“药学可接受的载体”包括任何和全部溶剂，分散介质，包衣，表面活性剂，抗氧化剂，防腐剂(例如，抗细菌剂，抗真菌剂)，等渗剂，吸收延迟剂，盐，防腐齐[J，药物，药物稳定剂，凝胶，结合剂，赋形剂，解离剂，润滑剂，甜味化剂，调味剂，染料，此类物质和其组合，如本领域普通技术人员已知(见，例如，Remington’s PharmaceuticalSciences, 18th Ed. , 1990,通过引用并入本文)。除非任何常规载体与活性成分不相容，其使用涵盖在药物组合物中。本发明的特定实施方式可依赖于是否其待以固体，液体或气雾剂形式施用，及是否其对于该施用途径作为注射需求无菌而包含不同类型的载体。本领域普通技术人员已知可静脉内，真皮内，透皮，鞘内，动脉内，腹膜内，鼻内，阴道内，直肠内，局部，肌内，皮下，经粘膜，经口，局部，局部，吸入(例如，气雾剂吸入)，注射，输注，连续输注，直接局限性灌注浸浴靶细胞，经导管，经灌洗，在脂质组合物中(例如，脂质体)或由其他方法或任何以上的组合施用的组合物(见，例如，Remington’s Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. , 1990,通过引用并入本文)。修饰的多肽可配制为游离碱，中性或盐形式的组合物。药学可接受的盐，包括酸加成盐，例如，用蛋白性组合物的游离的氨基形成的那些，或用无机酸诸如例如，盐酸或磷酸，或用有机酸如乙酸，草酸，酒石酸或扁桃酸形成的那些。用游离的羧基形成的盐也可源于无机碱诸如例如，钠，钾，铵，钙或铁氢氧化物；或有机碱如异丙基胺，三甲基胺，组氨酸或普鲁卡因。制剂之后，溶液会以与剂量制剂相容的方式及以治疗有效的量施用。制剂是容易以各种剂型施用，诸如配制用于肠胃外施用诸如可注射溶液，或用于递送到肺的气雾剂，或配制用于饮食施用诸如药物释放胶囊等。进一步根据本发明的特定方面，对于施用适合的组合物可在含或不含惰性稀释剂的药学可接受的载体中提供。载体应是可同化的，且包括液体，半-固体，即，糊剂或固体载体。除非任何常规培养基，剂，稀释剂或载体对于受者或其中含有的组合物的治疗性有效性有害，其为在实践方法中使用的在可施用的组合物中的使用是适当的。载体或稀释剂的例包括脂肪，油，水，盐溶液，脂质，脂质体，树脂，结合剂，填料等，或其组合。组合物也可包含各种抗氧化剂，以延缓一种或更多组分的氧化。此外，可由防腐剂诸如各种抗细菌剂和抗真菌剂，包括但不限于对羟基苯甲酸酯(例如，羟苯甲酯，羟苯丙酯)，三氯叔丁醇，苯酚，山梨酸，硫柳汞或其组合实现防止微生物的作用。根据本发明的特定方面，将组合物与载体以任何方便的和实践的方式，S卩，由溶液，悬浮液，乳化，混合物，包裹，吸收等组合。该方法对于本领域技术人员是常规的方法。在本发明的特定实施方式中，组合物与半-固体或固体载体充分组合或混合。混合可以任何方便的方式诸如研磨进行。在混合过程中也可添加稳定化剂，以便保护组合物免于损失治疗性活性，即，在胃中变性。在组合物中使用的稳定剂的例包括缓冲剂，氨基酸诸如甘氨酸和赖氨酸，碳水化合物诸如右旋糖，甘露糖，半乳糖，果糖，乳糖，蔗糖，麦芽糖，山梨糖醇，甘露糖醇，等。在进一步实施方式中，本发明可涉及包括胱硫醚酶变体，一种或更多脂质，及水性溶剂的药学脂质媒质组合物的使用。如本文所用，术语“脂质”被定义为包括特征性地不溶于水和可用有机溶剂提取的任何广普物质。此广类的化合物为本领域技术人员熟知，且如术语“脂质”在本文中使用，其不限于任何特定结构。例包括含有长链脂肪族烃和它们的衍生物的化合物。脂质可为天然存在的或合成的(即，由人设计的或产生的)。但是，脂质通常是生物学物质。生物学脂质为本领域熟知，且包括例如，中性脂肪，磷脂，磷酸甘油脂，甾，萜烯，溶脂，鞘糖脂，糖脂，硫苷脂，具有醚和酯-连接的脂肪酸的脂质和可多聚化的脂质，及其组合。当然，组合物和方法也包括被本领域技术人员称之为脂质的非本文特别所述的那些的化合物。、
本领域普通技术人员熟悉可用于在脂质媒质中分散组合物采用的技术的范围。例如，加工的甲硫氨酸酶或其融合蛋白可通过本领域普通技术人员知道的任何手段分散在含有脂质的溶液中，用脂质溶解，用脂质乳化，与脂质混合，与脂质组合，与脂质共价键合，作为悬浮液含于脂质，与微团或脂质体含有或复合，或与脂质或脂质结构另外关联。分散可或可不导致脂质体形成。施用给动物患者的组合物的实际剂量可通过物理和生理学因素诸如体重，病情的严重性，疾病治疗类型，之前或同时治疗性干预，患者的特发症及基于施用途径确定。依赖于剂量和施用途径，优选的剂量和/或有效量的施用数可根据受试者应答而改变。负责施用的医师会，在任何事件中，确定在组合物中活性成分的浓度和用于个体受试者的适当的剂量。在特定实施方式中，药物组合物可包含，例如，至少约O. 1%的活性化合物。在其他实施方式中，活性化合物可包含单元的约2% 约75%之间的重量，或约25% 约60%之间， 例如和源自其中的任何范围。天然地，在各治疗有用的组合物中活性化合物的量可以任何给定单元剂量的化合物获得适合的剂量的方式制备。制备该药学制剂的本领域技术人员涵盖因素诸如溶解度，生物利用度，生物学半衰期，施用途径，产品货价期，以及其他药理学考虑，及像这样，可期望各种剂量和处理方案。在其他非限制性例中，剂量也可每施用包含自约I μ g/kg/体重,约5yg/kg/体重，约10 μ g/kg/体重，约50 μ g/kg/体重，约100 μ g/kg/体重，约200 μ g/kg/体重，约350 μ g/kg/ 体重，约 500 μ g/kg/ 体重，约 lmg/kg/ 体重，约 5mg/kg/ 体重，约 10mg/kg/ 体重，约 50mg/kg/ 体重，约 100mg/kg/ 体重，约 200mg/kg/ 体重，约 350mg/kg/ 体重，约 500mg/kg/体重，至约1000mg/kg/体重或更多，及源自其中的任何范围。在自本文列的数的可来源的范围的非限制性例中，可基于上述数施用约5mg/kg/体重 约100mg/kg/体重,约5 μ g/kg/体重 约500mg/kg/体重,等的范围。X.试剂盒本发明的特定方面可提供试剂盒，诸如治疗性试剂盒。例如，试剂盒可包含一种或更多本文所述的药物组合物及任选地用于它们的使用的使用说明。试剂盒也可包含一种或更多用于实现该组合物的施用的装置。例如，对象试剂盒可包含用于实现组合物直接静脉内注射进癌性肿瘤的药物组合物和导管。在其他实施方式中，对象试剂盒可包含加工的甲硫氨酸酶的预填充的安瓿，任选地配制为药物，或冷冻干燥的，用以递送装置。试剂盒可包含具有标记物的容器。适合的容器包括，例如，瓶(bottles)，瓶(vials)及测试管。容器可由各种材料诸如玻璃或塑料形成。容器可保持组合物，其包括对于治疗或非-治疗性应用有效的抗体，诸如上述。容器上的标记物可指示，组合物用于特异性治疗或非-治疗性应用，且也可指示用于体内或体外使用的方向，诸如上述那些。本发明的试剂盒一般包含上述容器及一个或更多包含自商业和用户观点期望的物质的其他容器，包括缓冲剂，稀释剂，滤器，针，注射器及具有用于使用的使用说明的包装说明书。[XI.实施例包括下列实施例，以展示本发明的优选的实施方式。本领域技术人员应知，实施例中公开的技术，其根据由发明人发现的代表技术，在本发明的实践中良好发挥作用，由此可被认为构成其实践的优选的模式。但是，本领域技术人员应，根据本公开，同意，可在公开的特定实施方式中进行许多变化，且仍获得相同或类似结果而不离开本发明的精神和范围。实施例I:天然人胱硫醚-Y -裂合酶和修饰的人胱硫醚-Y -裂合酶的基因合成和表达使用胱硫醚-Y -裂合酶(CGL)和甲硫氨酸-Y -裂合酶(MGL)酶的序列和结构比对作为指南，将CGL，特别人CGL (hCGL)转化为用于甲硫氨酸的有效降解的酶。人胱硫醚酶基因含有在大肠埃希氏菌(E. coli)中罕见-利用且可干扰表达的多密码子。由此，为了优化大肠埃希氏菌(E. coli)中的蛋白表达，使用利用DNA-Works软件设计的密码子优化的寡核苷酸合成hGCL基因(Hoover等人，2002)。将NcoI 5’限制性位点，框内N-端His6标签和3，EcoRI位点导入ORF。克隆进pET28a载体(Novagen)之后，使含有适当的胱硫醚酶表达载体的大肠埃希氏菌(E. coli) (BL21)转化体于37°C，使用含有50μ g/ml卡那霉素的Terrific肉汤(TB)培养基，在摇瓶中，以250rpm生长，直到达到O. 5 O. 6的OD6tltl。在此点，将培养物于25°C转到摇床，用O. 5mM IPTG诱导，及允许表达 蛋白另外的12小时。然后通过离心收集细胞沉淀，并重悬浮于IMAC (固定的金属亲和层析)缓冲剂(10mMNaP04/10mM咪唑/300mM NaCl，pH8)。由弗氏压碎器裂解之后，将裂解产物以20，OOOXg于4°C离心20min，并将得到的上清液应用于镍IMAC柱，用10 20柱体积的IMAC缓冲剂洗涤，然后用IMAC洗脱缓冲剂(50mM NaP04/250mM咪唑/300mM NaCl, pH8)洗脱。然后将含有酶的级分与IOmM吡哆醛-5'-磷酸(PLP)于25°C温育数小时。使用10，000MWC0离心过滤装置(Amicon)，然后对蛋白进行缓冲剂交换几次到IOOmM PBS, 10%甘油，PH7.3溶液。然后将等份的胱硫醚酶在液氮中速冻及于_80°C存储。以此方式纯化的胱硫醚酶是>95%均质，如通过SDS - PAGE和考马斯染色评定。在6M胍鎗盐酸盐，20mM磷酸盐缓冲剂浓度，PH6. 5的最终缓冲剂中，基于计算的消光系数，ε 280=29, 870/McnT1产率计算为 400mg/L 培养物(Gill 及 von Hippel, 1989)。实施例2:用于甲硫氨酸-Y -裂合酶活性及排序克隆的96-孔板筛选MGL和CGL自它们的相应底物产生2_ 丁酮酸。将用于检测α -酮基酸3_甲基苯并噻唑啉-2-酮腙(MBTH)的比色测定(Takakura等人，2004)缩放为96-孔板形式，用于筛选小库及用于以最大MET酶(甲硫氨酸-Y -裂合酶)活性排序克隆。将编码在前段落中描述的测定中显示活性的突变酶的单集落挑选进含有75 μ L的TB培养基/孔和50 μ g/ml卡那霉素的96-孔板的微孔中。使细胞于37°C在平板摇床上生长，直到达到0. 8 I的0D6(KI。冷却至25°C之后，添加另外的75 μ L的含有50 μ g/ml卡那霉素和0. 5mM IPTG的培养基/孔。于25°C伴随振摇进行表达2小时，之后，将100 μ L的培养物/孔转移到96孔测定板。然后离心测定板，以沉淀细胞，移出培养基，及通过添加50 μ L/孔的B-PER蛋白提取试剂(Pierce)裂解细胞。通过离心清除之后，将裂解产物与5mM L-Met于37°C温育10 12小时。然后通过添加3部分的IM乙酸钠中的0. 03%MBTH溶液(pH5)来衍生反应。将板于50°C加热40min，及冷却之后，在320nm处在微孔板读取器中读数。实施例3甲硫氨酸-Y -裂合酶活性的遗传选择通过在大肠埃希氏菌(E. coli)中作为异亮氨酸生物合成通路中的第I酶的苏氨酸脱氨酶(由ilvA编码的)的作用产生α-丁酮酸。几乎40年之前,Grimminger和Feldner鉴定了异亮氨酸营养缺陷型的苏氨酸脱氨酶突变体(Grimminger和Feldner 1974),且更近来，苏氨酸脱氨酶点突变体见于常见的表达株BLR(DE3)，其据说当自培养基略去异亮氨酸时仅具有〈5%的正常生长能力(Goyer等人，2007)。产生α-丁酮酸的甲硫氨酸酶的表达显示拯救ilvA突变体生长，由此允许在最小培养基中集落形成。但是，BLR(DE3)中的苏氨酸脱氨酶基因是点突变体，在尤其非常大库中使逆转似然性不同。苏氨酸脱氨酶在异亮氨酸生物合成操纵子ilvGMEDA中是远端基因，及表达为操纵子的部分或独立于内部启动子(Lopes 和 Lawther 1989)。为了避免对其他Ile基因的表达的不期望的效应，使用通过Pl转导及通过使用在别处描述的FLP重组酶质粒pCP20卡那霉素抗性标记物的固化自Yale大肠埃希氏菌(E. coli) Genetic Stock Center (New Haven, CT)获得的大肠埃希氏菌(E. coli)株JW3745-2 ( Δ (araD-araB) 567, Δ lacZ4787 (: : rrnB-3), λ -, rph-1, Δ ilvA723: : kan, Δ (rhaD-rhaB)568，hsdR514)删除大肠埃希氏菌(E. coli)株BL21的1545bp ilvA基因之内的内部片段(Datsenko和Wanner 2000)。也注意到，L-胱硫醚和L-高半胱氨 酸是大肠埃希氏菌(E. coli)甲硫氨酸生物合成通路的中间体(图11)。L-胱硫醚和L-高半胱氨酸是导致产生α -丁酮酸及允许弥补异亮氨酸生物合成通路的胱硫醚-Y-裂合酶的底物。因此使用通过Pl转导及通过使用在别处描述的FLP重组酶质粒pCP20的卡那霉素抗性标记物的固化自 Yale 大肠埃希氏菌(Ε. coli) Genetic Stock Center (New Haven, CT)获得的大肠埃希氏菌(E. coli )株 JW3973-1 ( Δ (araD-araB) 567, Δ lacZ4787 (: :rrnB-3), λ -, rph-1, Δ (rhaD-rhaB) 568, AmetA780: :kan, hsdR514)敲除基因metA(编码高丝氨酸-0-琥珀酰转移酶)(Datsenko 和 Wanner 2000)。将大肠埃希氏菌(E. coli)株 BL21 (DE3) (F-ompT gal dcmIon hsdSB (rB-mB-) λ (DE3 [lacl lacUV5_T7 基因 I indl sam7 nin5])用作受者株，产生对于L-异亮氨酸和L-甲硫氨酸营养缺陷型的大肠埃希氏菌(E. coli)株BL21(DE3)(ΔilvA, ΔmetA)。由此带有含有甲硫氨酸-Y -裂合酶，加工的胱硫醚-Y -裂合酶的基因的质粒的大肠埃希氏菌(E. coli)BL21 (DE3) ( AilvA, ΔmetA)可生长在补充L-甲硫氨酸的M9-最小培养基板上，但具有仅野生型胱硫醚-Y-裂合酶和空质粒的相同的株不可(图12)。可由此针对无活性克隆或具有胱硫醚酶活性的克隆的背景快速选择具有甲硫氨酸-Y -裂合酶活性的非常大库的重组表达的加工的胱硫醚-Y -裂合酶变体。更大集落和呈现更快速的那些指示更多活性酶。实施例4:对hCGL的残基E59，Rl 19和E339的诱变效应结构分析指示，残基E59，Rl 19和E339可能涉及hCGL识别其底物L-胱硫醚。在这些位点构建NNS密码子饱和度库及使用下列诱变引物筛选(E59)正向' 5-ggccagcatagcggttttNNStatagccgtagcggc (SEQ ID NO: 2 )，反向 ' 5-GCCGCTACGGCTATASNNAAAACCGCTATGCTGGCC (SEQID NO: 3), (R119)正向 ' 5-gtatggtgggaccaatNNStatttccgtcaggtggcg (SEQID N0:4)，反向'5-CGCCACCTGACGGAAATASNNATTGGTCCCACCATAC (SEQID NO: 5)，(E339)正向' 5-ctgaaactgtttaccctggcaNNSagcttgggcggctttg (SEQ ID NO:6),及反向 ' 5-CAAAGCCGCCCAAGCTSNNTGCCAGGGTAAACAGTTTCAG (SEQ ID NO: 7)，使用 hCGL 基因作为模板 DNA 和特定末端引物；正向' 5-gatataccATGGGAGGCCATCACCACCATCATCATGGCGGGCAGGAAAAGGATGCG( SEQ IDNO: 8 )和反向' 5-CTCGAATTCTCAACTGTGGCTTCCCGATGGGGGATGGGCCGCTTTCAGCGCCTGATCC (SEQID N0:9)o用NcoI和EcoRI消化PCR产物及用T4 DNA连接酶连接到pET28a载体。将得到的连接直接转化进大肠埃希氏菌(E. coli) (BL21)及平铺在用于随后如在实施例2中描述筛选的LB-卡那霉素板上。筛选相比库的理论多样性2倍更多集落。将显示活性的克隆分离及测定hCGL基因的序列，以鉴定突变。将酶变体纯化至大于95%同质性，如由SDS-PAGE评定。用PLP温育显示增强比活性，大概因为用于表达的大肠埃希氏菌(E. coli)细胞不产生对于产生的全部hCGL足够的PLP。一旦酶已装载PLP，其稳定，在存储后无辅因子损失。实施例5:人胱硫醚-Y -裂合酶变体的表征自作为具有最高催化性活性筛选鉴定的2种hCGL变体发现具有下列突变E59N或V，R119L和E339V，以及N-端His6标记添加。这些变体分别称之为hCGL_NLV (SEQ IDN0:10)，&hCGL-VLV (SEQ ID N0:11)。这些变体均使用类似于实施例2中描述的检定的Iml规模MBTH检定动力学地表征它们以pH7. 3和37°C在IOOmMPBS缓冲剂中降解L-Met的能力。Ellman氏试剂(DTNB)检测由L-Met的hCGL变体催化的甲烷氢硫基的释放，导致轻易的连续测定。hCGL-NLV，及hCGL-VLV对L-Met具有 I X 104s^M^的keat/KM。亲本酶天然hCGL不能在这些测定的检测限之内降解L-Met。·通过于37°C在合并的人血清中酶的温育测试甲硫氨酸酶的血清稳定性，且终浓度IOuM0在不同时间点，抽出等份，及测试活性。标绘数据之后，自恶臭假单胞菌(P. putida)的MGL发现具有2±0. I小时的表观Τα5。人CGL显示16±0.8小时的表观Τα5。意外地，hCGL-NLV和CGL-VLV显著更稳定，前者显示95±3小时的表观Ta 5，及hCGL-VLV具有260±18小时的表观Ta5 (图2)。也通过圆二色性光谱学(⑶)评价甲硫氨酸酶的热稳定性。人CGL和变体hCGL-NLV具有 68°C的表观Tm值，hCGL-VLV稍微更稳定，具有 71 °C的表观Tm (图3)。hCGL，hCGL-NLV和hCGL-VLV的类似Tm值提示，延伸的血清稳定性是由于PLP辅因子在hCGL-NLV，及hCGL-VLV的活性位点优先保留。实施例6:人甲硫氨酸-Y-裂合酶针对成神经细胞瘤的细胞毒性评价用成神经细胞瘤细胞系Lan-I的hCGL和pMGL的体外细胞毒性。以 7000细胞/孔接种LAn-I细胞，及用改变浓度的pMGL或hCGL-NLV温育。3 5天暴露之后，之前使用WST-8测量增殖，以及标绘数据，以计算表观IC5tl值(Hu和Cheung 2009)。得到的数据的分析(图6)对于pMGL治疗的细胞产生O. 34U/ml的表观IC5tl值( O. 6 μ Μ)，和对于hCGL-NLV治疗的细胞产生O. 15U/ml的表观IC5tl值( O. 3 μ M)。实施例7:聚乙二醇化的人甲硫氨酸-Y-裂合酶针对一组成神经细胞瘤细胞系的细胞毒性在96-孔板(BD Biosciences, Bedford, MA)中用改变浓度的 PEG-hMGL 或PEG-hCGL-NLV 检定 NB 细胞系(BE (I) N, BE (2) N, BE (2) S，BE (2) C，SK-N-LD, NMB-7, SH-EP-1, IMR32, CHP-212, SKN-MM, LAN-1, LAI 66N，LAI 55N，LAI 5S)的体外增殖。以3000 6000细胞/孔的密度接种之后24小时，添加PEG_hCGL_NLV和pMGL。3天的培养之后，移出PEG-hMGL和pMGL，添加新鲜培养基，及将细胞温育另外的36小时。将WST8 (Dojindo Molecular Technologies, MA)以 1:10 的体积比加入培养孔。在 4 6 小时的反应之后，在450nm处读数光学密度(0D)。细胞增殖如下计算％细胞生长=(实验孔的O450-仅孔培养基的OD45tl)/ (对照孔的OD45tl-仅孔培养基的OD45tl) X 100%。使用SigmaPlot8. O(Systat 软件，Inc.，San Jose, CA)计算 IC5tl (一半最大抑制性药物浓度)。PEG-hCGL-NLV针对用O. 175 O. 039U范围的IC50值测试的全部细胞系显示细胞毒性，类似于假单胞菌MGL，其具有O. 174 O. 042U范围的IC50值(图9)。实施例8:人胱硫醚-Y -裂合酶变体的药理学制备如在实施例I中描述纯化hCGL-NLV，仅一个例外在结合到IMAC柱之后，蛋白用样品中含有O. l%Triton 114的IMAC缓冲剂广泛地洗涤(90 100柱体积)。10 20柱体积的IMAC缓冲剂，然后用IMAC洗脱缓冲剂(50mM NaP04/2 50mM咪唑/300mM NaCl, pH8)洗脱。采用用Triton 114的洗涤来减少内毒素(脂多糖)混杂。将纯化的蛋白使用10，000MWC0过滤装置(Amicon)经历缓冲剂交换到IOOmM NaPO4,pH8. 3的缓冲剂。随后，以IOmM浓度添加PLP，并将蛋白于25°C温育I小时。然后添加甲氧基PEG琥珀酰亚胺基羧 甲基酯5000MW(JenKem技术)至80:1摩尔比的hCGL-NLV，并允许在恒定搅拌下于25°C反应I小时。将得到的混合物使用100，000MWC0过滤装置(Amicon)充分地缓冲剂交换(含10%甘油的PBS)，及用O. 2 μ m注射器式滤器(VWR)灭菌。使用鲎属(Limulus)变形细胞裂解产物(LAL)试剂盒(Cape Cod Incorporated)分析全部聚乙二醇化的酶的脂多糖(LPS)含量。分通过SDS-PAGE和大小排阻层析析(图4 5)显示，80倍摩尔过量的PEG丽5000大大增加hCGL变体的水动力半径，MGL活性自对于未聚乙二醇化的四聚体的 220kDa至聚乙二醇化的hCGL变体的估计的1，340kDa。聚乙二醇化的人甲硫氨酸酶发现相比未-聚乙二醇化的酶具有几乎相同的动力学活性和体外血清稳定性。实施例9:小鼠中PEG MW 5000 hCGL-NLV的药效学分析测定用50U的PEG-hCGL-NLV尾静脉注射之后小鼠(balb/c) (n=5)中的聚乙二醇化的hCGL变体的体内半衰期。在不同时间抽出血样品，并如上测定hCGL-NLV活性。将在t=l小时抽出的血中的活性设置为100%。数据的指数拟合揭示相比PEG-pMGL，28±4小时W T172 (图7)，14倍改善。实施例10:小鼠血浆中的甲硫氨酸耗尽给小鼠(n=5)在用200U的PEG_hCGL_NLV由尾静脉注射处理之前饲喂甲硫氨酸(-)高胱氨酸(-)胆碱(-)(Met (-) Hcyss (-) Chl(-))膳食。如基本上在别处描述由HPLC分析血浆样品的L-Met水平(Sun, et al. 2005)。在8小时时血甲硫氨酸水平自处理之前的124±37μΜ现有降低至最小3·9±0·7μΜ，及保持低24小时(图8)。实施例11PEG-hCGL-NLV对LAN-I肿瘤异种移植物的效应作出PEG-hCGL-NLV施用的日程表，以最小化体重减轻及最大化PEG_hCGL_NLV的药代动力学。(仅限制体内毒性的剂量是甲硫氨酸剥夺后体重减轻)。当将用LAN-I异种移植的无胸腺小鼠用100UPEG-hCGL-NLV每周三次持续4周静脉内治疗时，观察到15 20%可反转的体重减轻。在治疗的最后(第4)周期间第3PEG-hCGL-NLV注射之后24小时，在PEG-hCGL-NLV-治疗的饲喂Met (-) Hcyss (-) Chl (-)膳食的小鼠中，相比在治疗之前的124±37μΜ，血浆甲硫氨酸浓度是 5.8±2. ΙμΜ (η=10)。饲喂 Met (-) Hcyss (-) Chl (-)膳食的小鼠具有10 15%可反转的体重减轻，且血浆甲硫氨酸浓度是13. 2±4. 5μΜ，对于饲喂 Met(-)Hcyss(-)Chl(_)膳食的小鼠。当将 lOOUPEG-hCGL-NLV 治疗与 Met (-) Hcyss (-)Chl (-)膳食组合时，相比无处理组或接收仅Met(-)HCySS(-)Chl(-)膳食的组，观察到针对LAN-I异种移植物的显著抗-肿瘤效应(p〈0. 01)(图10)。
实施例12:灵长类动物甲硫氨酸-Y -裂合酶的加工自灵长类动物物种诸如黑猩猩((黑猩猩(Pan troglodytes)),猩猩(苏门答腊猩猩(Pongo abelii))和短尾猴(食蟹猴(Macaca fascicularis))的CGL的序列分别在氨基酸组成中与人CGL具有约99，96和95%同一性。使用标准诱变技术如在实施例4中所述构建具有赋予甲硫氨酸-Y-裂合酶活性的突变的灵长类动物CGL酶。将得到的基因克隆进具有L-甲硫氨酸酶活性的pET28a非-人灵长类动物hGCL，然后表达及如上所述纯化。用对应于N，或V59，L119和V339的氨基酸位置加工的灵长类动物CGL降解具有至少I X
的 keat/KM 值的 L-Met。具有MGL活性的加工的灵长类动物CGL的氨基酸序列的例公开如下苏门答腊猩猩(Pongoabelii) CGL-NLV (SEQ ID NO: 12，在具有 Genbank ID NP_001124635. I 的天然序列(即，SEQ ID NO: 18)上具有 V59N, R119L 和 E339V 取代，和N-端His6标签的添加)，苏门答腊猩猩(Pongo abelii) CGL-VLV (SEQ ID NO: 13,在具有GenbankID NP_001124635. I的天然序列上具有R119L和E339V取代，和N-端His6标签的添加);食蟹猴(Macacafascicularis) CGL-NLV (SEQ ID NO: 14,在具有 Genbank IDAAW71993. I 的天然序列(即，SEQ ID NO: 19)上具有E59N, R119L和E339V取代，和N-端His6标签的添加)，食蟹猴(Macaca fascicularis) CGL-VLV (SEQ ID NO: 15,在具有 GenbankIDAAW71993. I的天然序列上具有E59V，R119L和E339V取代，和N-端His6标签的添加)；黑猩猩(Pantroglodytes) CGL-NLV (SEQ ID NO: 16,在具有 Genbank IDXP_513486. 2的天然序列(即，SEQ ID NO: 20)上具有E59N, R119L和E339V取代，和N-端His6 标签的添加)和黑猩猩(Pan troglodytes) CGL-VLV (SEQ ID NO: 17，在具有 GenbankIDXP_513486. 2的天然序列上具有E59V, R119L和E339V取代，和N-端His6标签的添加)。***本文公开的及要求保护的全部方法均可根据本公开实施及无需过度实验。已描述了本发明的组合物和方法的优选的实施方式，可将改变应用于本文所述的方法及方法的步骤或步骤的顺序，而不脱离本发明的概念，精神和范围对于本领域技术人员是显而易见的。更特别是，用化学和生理学相关的特定剂可取代本文所述的剂而会达到相同的或类似结果也是显而易见的。全部该类似代用品和修饰会被本领域技术人员认为在由随附的权利要求定义的本发明的精神，范围和概念之内。参考文献下列参考文献以它们提供例示程序或对于本文所示的那些补充性的其他细节的程度特别通过引用并入本文。U. S.专利 5，889，155U. S.专利公开· 20090304666Ashe et al. , Biochem. Biophys. Res. Commun. , 57:417, 1974.Ausubel et al. , Current Protocols in Molecular Biology,Greene PublishingAssociates and Wiley Interscience, N. Y. , 1994.BreiIlout et al. , In:Methionine dependency of malignant tumors : apossible approach for therapy, Oxford University Press, 1628-1632，1990
Datsenko and Wanner, Proc. Natl. Acad. Sci. USA，97 (12) : 6640-5，2000.Esaki and Soda, Methods Enzymol. , 143:459, 1987.Gill and von Hippel，Anal. Biochem.，182:319-326，1989.Goyer et al·，Plant and cell Physiology, 48 (2) : 232, 2007.Grimminger and Feldnerj J. Bacteriology, 118 (2) : 753, 1974.Halpern et al.，Proc. Natl. Acad. Sci.，71:1133-1136，1974.Harkki et al. , Bio Technology，7:596-603，1989.Hoover et al. , J. Biol. Chem. , 277:37647-37654, 2002. Hopwood et al. , In:Genetic Manipulation of Streptomyces, A LaboratoryManual,The John Innes Foundation, Norwich, CTj 1985.Hori et al.，Cancer Res.，56:2116—2122，1996.Hu and Cheung, Intl. J. Cancer, 124(7)，2009.Ito et al.，J. Biochem.，79:1263，1976.Kreis and Goodenowj Cancer Res. , 38:2259-2262, 1978.Kreis et al.，Cancer Res.，40:634-641，1980.Kreisj Cancer Treatment Rpts.，63:1069，1979.Kudou et al.，J. Biochem.，141:535，2007.Lishko et al. , Anticancer Res.，13:1465-1468，1993.Lopes and Lawther，Gene (Amsterdam)，76 (2) : 255-269，1989.Lordanescu, J. Bacteriolj 12:597601，1975.Lu et al.，Biochem. Biophys. Res. Comm.，189:749-758，1992.Maniatisj et al. , Molecular Cloning,A Laboratory Manual, Cold SpringHarborPress, Cold Spring Harbor, N. Y.，1988.Mellor et al. , Gene, 24:1-14, 1983.Nakamura et al. , Anal. Biochem.，138:421 - 424，1984.Penttila et al.，Gene，61:155—164，1987.Rao et al.，J. Nutrition, 120:837，1990.Remington’s Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. Mack PrintingCompany, 1289-1329，1990.Roopenian and Akileshj Nat. Rev. Immunol.，7:715-725，2007.Sibakov et al.，Eur. J. Biochem.，145:567572，1984.Sridhar et a I . ,Acta Crystall. Section D : B i o I o g ,Crystall.，56:1665-1667，2000.Steegborn et al.，J. Biolog· Chem.，274:12675，1999.Sun et al.，Anticancer Res.，25 (IA) : 59-62，2005.Takakura et al.，Analytical Biochem.，327:233-240，2004.Tan et al. , Anticancer Res.，16:3937-3942，1996a.Tan et al. , Anticancer Res.，16:3931-3936，1996b.Tan et al. , Protein Express. Purif. , 9:233-245, 1997a.
Tan et al.，Anticancer Res.，17:3857-3860，2007b.Volker Schellenbergerlj Nature Biotech.，27:1186-1190，2009.Ward, Proc, Embo-Alko Workshop on Molecular Biology of FilamentousFungi，Helsinki， 119-128， 1989.Wawrzynczak&Thorpe, In :Immunoconjugatesj Antibody Conuugates InRadioimaging And Therapy Of Cancer, Vogel(Ed. ), NYj Oxford UniversityPress, 28，1987.Yang et al. , In:PEGylation confers greatly extended half-lifeand attenuated immuno gen i c i t y to recombinant methioninase inprimates, AACRj 6673-6678，2004a. Yang et al., In:Pharmacokinetics, methionine depletion, and antigenicityof recombinant methioninase in primates，AACR，2131—2138，2004b.Yoshioka et al.，Cancer Res.，58:2583-2587，1998.
权利要求
1.多肽，其包含相比天然灵长类动物胱硫醚Y-裂合酶包含至少一个氨基酸取代的灵长类动物胱硫醚Y-裂合酶变体，其中胱硫醚Y-裂合酶变体具有约IOM-1S-1和约I X IO6M-1S-1之间的对于降解L-甲硫氨酸的催化特异性常数(kMt/KM)。
2.权利要求I的多肽，其中至少一个氨基酸取代在天然胱硫醚Y裂合酶上的底物识别位点的一个或更多带电残基上。
3.前述权利要求之任一项的多肽，其中至少一个氨基酸取代在天然胱硫醚Y裂合酶的氨基酸第59，119和/或339位上。
4.前述权利要求之任一项的多肽，其中至少一个氨基酸取代在SEQID NO: I的氨基酸第59，119和/或339位上。
5.前述权利要求之任一项的多肽，其中在氨基酸第59，119和/或339位的取代是天冬氨酸(N)，缬氨酸(V)，或亮氨酸(L)。
6.前述权利要求之任一项的多肽，其中在氨基酸第59，119和/或339位的取代包含R119L 和 E339V 取代。
7.前述权利要求之任一项的多肽，其中在氨基酸第59，119和/或339位的取代包含另外的E59V或E59N的取代。
8.权利要求I的多肽，其中胱硫醚Y-裂合酶变体具有至少约IO4M-1S-1的对于降解L-甲硫氨酸的krat/KM。
9.前述权利要求之任一项的多肽，其中胱硫醚Y-裂合酶变体具有少于约SOif1s-1的对于降解L-高胱氨酸的keat/KM。
10.前述权利要求之任一项的多肽，其中天然灵长类动物胱硫醚Y-裂合酶与SEQIDNO: I的序列具有至少95%序列同一性。
11.前述权利要求之任一项的多肽，其中天然灵长类动物胱硫醚Y-裂合酶与SEQIDN O: I的序列具有至少98%序列同一性。
12.前述权利要求之任一项的多肽，其中天然灵长类动物胱硫醚Y-裂合酶具有SEQID NO: 18 20之任何的序列。
13.前述权利要求之任一项的多肽，其中天然灵长类动物胱硫醚Y裂合酶是人胱硫醚Y 裂合酶(SEQ ID NO: I)。
14.前述权利要求之任一项的多肽，其还包含异源肽段。
15.前述权利要求之任一项的多肽，其中异源肽段是XTEN肽。
16.前述权利要求之任一项的多肽，其中多肽偶联于聚乙二醇(PEG)。
17.前述权利要求之任一项的多肽，其中多肽经一个或更多Lys或Cys残基偶联于PEG。
18.核酸，其包含编码前述权利要求之任一项的多肽的核苷酸序列。
19.权利要求18的核酸，其中核酸是为在细菌中表达而密码子优化的。
20.表达载体，其包含权利要求19的核酸。
21.宿主细胞，其包含权利要求19的核酸。
22.权利要求21的宿主细胞，其中宿主细胞是细菌。
23.权利要求22的宿主细胞，其中宿主细胞是具有基因iIvA和metA缺失的大肠埃希氏菌(E. coli)株。
24.药学制剂，其在药学可接受的载体中包含权利要求I的多肽或权利要求18的核酸。
25.用于治疗受试者中的肿瘤细胞的组合物,其包含 权利要求I 17之任一项的多肽， 权利要求18或19的核酸， 权利要求20的表达载体，或 权利要求24的药学制剂。
26.权利要求25的组合物，其中受试者维持于甲硫氨酸限制的膳食。
27.权利要求25的组合物，其中受试者维持于正常膳食。
28.权利要求25 27之任一项的组合物，其中受试者是人患者。
29.权利要求25 28之任一项的组合物，其中肿瘤细胞是乳腺癌，前列腺癌，成神经细胞瘤或胰腺癌细胞。
30.权利要求25 29之任一项的组合物，其中组合物在肿瘤细胞的营养培养基中。
31.权利要求30的组合物，其中营养培养基是血，淋巴液，或脊髓液。
32.鉴定具有L-甲硫氨酸降解活性的灵长类动物胱硫醚Y-裂合酶变体的方法，包括 (a)在具有基因ilvA和metA缺失的大肠埃希氏菌(E.coli)株细胞中表达一群灵长类动物胱硫醚Y-裂合酶变体，其中变体相比天然灵长类动物胱硫醚Y-裂合酶包含至少一个氨基酸取代；以及 (b)鉴定具有L-甲硫氨酸降解活性的灵长类动物胱硫醚Y-裂合酶变体，其中表达鉴定的变体的细胞在补充了 L-甲硫氨酸的最小培养基中相比在另外同一条件中的表达天然灵长类动物胱硫醚Y-裂合酶的细胞具有更高生长速率。
全文摘要
本发明描述了与具有甲硫氨酸-γ-裂合酶活性的新蛋白的加工相关的方法和组合物。例如，在特定方面，可公开了包含一个或更多氨基酸取代和能降解甲硫氨酸的修饰的胱硫醚-γ-裂合酶(CGL)。此外，本发明的特定方面提供使用公开的蛋白或核酸治疗具有甲硫氨酸耗尽的癌的组合物和方法。
文档编号A61P35/00GK102791856SQ201180013307
公开日2012年11月21日 申请日期2011年2月3日 优先权日2010年2月4日
发明者E·斯通, G·乔治欧 申请人:得克萨斯大学体系董事会