专利名称：缺血再灌注损伤减轻用治疗剂及治疗装置的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于减轻例如在急性心肌梗塞的再灌注治疗中可见的伴随着再灌注的心肌等患部和细小血管的损伤(缺血再灌注损伤)的治疗剂、治疗装置及治疗方法。
背景技术：
在心肌梗塞、脑梗塞、肠间膜血栓症等梗塞性疾病中，有时进行如下的缺血再灌注治疗，即，通过将梗塞部机械地扩张、或将血栓溶解，而使断绝了血流的缺血状态的组织恢复血流。另外，在脏器移植后的移植脏器中，也同样地使断绝了血流的组织恢复血流。已知在这种血流的恢复时，由于对缺血状态的组织急速地补充氧，而会引起以活性氧或自由基的产生、嗜中性粒细胞的浸润、血小板活化为代表的各种各样的生理反应，所述生理反应成为诱因，会导致脏器损伤，例如心肌损伤(如心肌梗塞)，因而被称作缺血再灌注损伤或者简称为再灌注损伤。
一氧化氮(NO)是来源于内皮的血管松弛因子。已知一氧化氮气体的吸入给药通过肺的血管扩张而具有降低肺动脉压、提高对全身的氧补充、抑制血小板的活化、抑制白血球的活化或粘接·凝聚等作用。已经获得如下等一定的成果，即，即使对于缺血再灌注损伤而言，也显而易见的是通过吸入一氧化氮来减少梗塞部位，对心肌损伤的减轻是有效的(参照下述专利文献I和非专利文献I)。但是，一氧化氮虽然能发挥此种保护作用，然而另一方面又特别存在如下的问题，即，与细胞内外产生的过氧化物阴离子反应，生成组织损伤性极高的过氧亚硝基。因而，吸入一氧化氮的副作用的危险性也很大。近年来发现，作为还原剂的氢(H2)与反应性高的活性氧种(羟基自由基〈·0Η>或过氧亚硝基<0Ν00_>)选择性地反应，将它们还原后消除。已知若将氢气从肺吸入给药，则氢可经由血液传递到全身，抑制与活性氧相关的病变，将引起细胞损伤的氧化力强的自由基还原消除，报告过在小鼠的脑梗塞的缺血再灌注模型、肝脏的缺血再灌注模型中可利用氢来减少缺血再灌注时的脏器 组织损伤(参照下述非专利文献2、3)。但是，仅吸入氢，则难以抑制在缺血再灌注时可见的嗜中性粒细胞的浸润或血小板的活化等。专利文献专利文献I :日本特表2004-509850号公报非专利文献非专利文献I :Cardiovascular Research, 75, 339-348, 2007非专利文献2 :Nature Medicine 13，688-694，2007非专利文献 3 :Biochemical and Biophysical Research Communications, 361,670-674,200
发明内容
本发明的目的在于，确立一种副作用的危险性小、并且可以抑制缺血再灌注时的嗜中性粒细胞的浸润或血小板活化的、用于减轻缺血再灌注损伤的治疗技术。本发明人等着眼于对于一氧化氮和氢气而言作用机制不同，发现通过将这两种气体同时从肺吸入，从而在防止由一氧化氮导致的副作用的同时，对于缺血再灌注损伤的各种各样的作用，具体来说，不仅是活性氧或自由基的产生，还有嗜中性粒细胞的浸润或血小板活化都可以减轻， 从而完成了本发明。本发明提供一种用于减轻缺血再灌注损伤的吸入用气体状药剂组合物，其实质上含有21 98%的氧气、O. I 4%的氢气、40 80ppm的一氧化氮，且其余部分由惰性气体(如氮气、氦气等)组成。对于该药剂组合物，即，在氮气、氦气等惰性气体中含有氧气、氢气和一氧化氮的混合气体而言，在从即将开始缺血再灌注之前到再灌注开始后不久之间，被吸入给药给接受再灌注的患者。由此，可防止由再灌注造成的脏器损伤。从另一个侧面看，本发明提供一种用于通过对患者直接或者经由人工呼吸器吸入给予上述药剂组合物而减轻缺血再灌注损伤的治疗装置，其特征在于，具备惰性气体(如氮)、氧气、氢气和一氧化氮各气体的供给源，与各气体供给源连接的压力调整器和流量计，以及用于从供给源供给各气体的供给路径；全部气体供给路径按照在给药前汇合而形成实质上由惰性气体、氧气、氢气和一氧化氮组成的混合气体的方式加以配置。进一步从另一个侧面看，本发明提供一种缺血再灌注损伤的减轻方法，其包括将实质上含有21 98%的氧气、O. I 4%的氢气、40 80ppm的一氧化氮且其余部分由惰性气体组成的气体状药剂组合物，从缺血再灌注的开始前到开始后，通过吸入对接受缺血再灌注治疗的患者给药。根据本发明，不仅可以获得比以往已知的一氧化氮的单独吸入或氢的单独吸入更高的缺血再灌注损伤的减轻效果，而且可以防止利用一氧化氮的吸入进行的缺血再灌注损伤的减轻治疗中的问题，即，由与过氧化物阴离子的反应所产生的过氧亚硝基所引起的组织损伤这样的副作用，而且还可以实现在氢吸入中不可能实现的抑制嗜中性粒细胞的浸润或血小板的活化等。利用一氧化氮与氢气的并用吸入，可以防止一氧化氮吸入的副作用，并且不是获得单纯的并用效果，而是获得比一氧化氮吸入和氢气吸入中的任一种都高的缺血再灌注损伤的协同的减轻效果，这对于本领域技术人员来说也是无法预想到的极有意义的效果。通过减轻缺血再灌注损伤，从而可提高接受再灌注的患者的Q0L。
图I是表示可在依照本发明进行一氧化氮和氢气的并用吸入中使用的治疗装置的一例的装置构成的概要图。图2是表示在实验中将人工呼吸器用于氧吸入情况下的装置构成的概要图。图3是表示动物实验的结果(左心室中的缺血区域的比例)的曲线图。图4是表示动物实验的结果(缺血区域中的梗塞区域的比例)的曲线图。
具体实施例方式根据本发明，例如在心肌梗塞患者中，可以减轻在利用支架置入、血管内膜切除术、血栓溶解疗法等对断绝了血流的缺血心肌组织进行恢复血流的缺血再灌注治疗时可见的缺血再灌注损伤。此种梗塞部位的再灌注也在脑梗塞或肠间膜血栓症的治疗中也会进行，同样地可能引起再灌注损伤。另外，在脏器移植后的移植脏器中对断绝了血流的组织恢复血流时也可能产生再灌注损伤。本发明还可以减轻这样的任意的脏器中的缺血再灌注损伤。本发明中，为了减轻再灌注损伤，而在从即将再灌注开始前到再灌注开始后不久之间，对接受缺血再灌注的患者吸入给予在氮等惰性气体中含有氧气、氢气和一氧化氮的气体。对于给药期间而言，例如在手术中，可以从发生缺血再灌注的5 60分钟前开始到发生再灌注后30分钟 2小时的期间进行。优选的给药期间是从再灌注开始前的10 30分钟前开始到再灌注开始后10分钟 I小时的期间。吸入给药的气体中的氧气浓度为21 98%的范围内，优选为21 30%的范围内。如果氧气浓度过低，则会产生低氧血症，如果过高，则会有产生肺损伤的风险。前述气体中的氢气浓度为O. I 4%的范围内，优选为2%左右。如果氢气浓度过低，则再灌注损伤的减轻效果减少，如果过高，则会产生爆炸的危险性。但是，氢气在空气中如果是4. 7% 以下的浓度，则即使靠近火也不会爆炸。前述气体中的一氧化氮浓度为40 80ppm的范围内，优选为60 80ppm，最优选为约80ppm。如果一氧化氮浓度过低，则再灌注损伤的减轻效果减少，如果过高，则即使使上述范围内的浓度的氢气共存，也难以防止由一氧化氮造成的前述的副作用。一氧化氮作为新生儿的伴随肺高血压的低氧性呼吸不全的改善用药剂(在20ppm浓度下吸入至4天为止)已经被认可,可以作为制剂而被市售为800ppm浓度的气体。本发明中作为药剂组合物使用的气体的其余部分是氮气、氦气或者其他的稀有气体等惰性气体，然而如果是微量的，则也可以含有其他的气体，例如二氧化碳。作为原料使用的气体优选为尽可能高纯度的气体。本说明书中所说的“约”是指容许±5%的变动的意思。依照本发明的吸入治疗可以利用如下的装置来实施，S卩，在夹隔着压力调整器而连接有氧气供给路径的惯用人工呼吸器中，分别夹隔着压力调整器而连接有氮气供给路径、氢气供给路径和一氧化氮供给路径的装置。将此种装置的一例的整体构成表示于图I中。图示的装置具备一氧化氮(NO)的供给源I、将氢气(H2)用氮气(N2)稀释了的氢/氮混合气体的供给源2、以及氧气(O2)的供给源3。这些气体均由高压储气瓶供给。将氢用氮气稀释后再供给是为了避免爆炸的危险。氢/氮混合气体中的氢气浓度例如优选设为5%以下，特别优选设为4.7%以下。虽然图中未图示，然而考虑到安全性，对于一氧化氮的高压储气瓶而言，在实际中一般使用一氧化氮浓度为1% (IOOOppm)以下左右的氮气稀释一氧化氮气体的高压储气瓶(例如前述的一氧化氮浓度为SOOppm的气体)。来自各供给源的气体经过压力调整器及微量流量计4或5后被混合，经过阀6向患者直接或者经过人工呼吸器7吸入给药到患者的肺中。一旦一氧化氮与氧接触，就会因反应而生成二氧化氮而丧失，因此优选在即将到阀之前再将两者混合。由此，图示的装置中，将氢/氮混合气体和氧气经过相同的微量流量计5调整流量后混合，将所得的氧/氢/氮混合气体与经过专用的微量流量计4供给的一氧化氮气体在即将到阀6之前再混合，将经混合的气体利用阀6的切换向患者直接输送或者输送给人工呼吸器7，吸入给药至患者的肺部。
需说明的是，对于一氧化氮(例如800ppm)，也可以以来自氢气(例如20% )的氮气平衡混合气体高压储气瓶的气体为基础，用氧气和氮气稀释(例如稀释10倍)后使用。实施例利用以下说明的动物实验确认了依照本发明的对由治疗造成的缺血再灌注损伤的减轻。实验方法I.所使用的小鼠和抗生素的给药在实验中使用的是C57BL/6J、10周龄雄性小鼠。为了去除存在于肠内的细菌所产生的氢的影响，而使其自由摄取了 4天的加入有抗生素的饮用水和普通的饲料，从实验开 始18小时前起使其断食。但是，在该期间中也使其自由摄取加入有抗生素的饮用水。为了确认抗生素的效果，而在实验开始前使用自制的呼气氢气浓度测定电路测定呼气中的氢气浓度，仅将氢气浓度为测定灵敏度极限以下的小鼠用于实验中。如果不去除因肠内细菌而产生的氢气的影响，则结果的波动就很大，从而无法正确地判定由吸入氢带来的效果。2.小鼠心肌缺血·再灌注损伤模型的制作将麻醉药戊巴比妥给药到腹膜内，气管插管后与人工呼吸器连接，进行呼吸管理。将左胸部除毛、消毒后，进行开胸，在通过将左冠状动脉前降支用丝线结扎而将缺血状态维持60分钟后，解开结扎了的丝线，产生再灌注。利用血流的恢复确认了再灌注。在确认再灌注后，闭胸，进行人工呼吸管理直至麻醉苏醒为止，麻醉苏醒后拔管，利用室内气进行管理。3.吸入时间带和吸入浓度将吸入时间设为从再灌注开始(结扎解开)的5分钟前开始到再灌注开始的30分钟后为止的35分钟。将不使其吸入作为对象的气体的组(利用氧气吸入进行的人工呼吸管理)作为对照(control)，分为氢吸入组、一氧化氮吸入组、以及依照本发明的氢气/ 一氧化氮并用吸入组，进行了比较研究。4.心脏切片的制作及测量从再灌注开始起经过24小时后，再次如上所述地进行麻醉、开胸及再结扎。从左心室注入Evans Blue染色液,鉴别出缺血区域。在确认Evans Blue染色液行至冠动脉后，摘出心脏。将摘出的心脏以Imm宽度切片而制成心脏切片。将制成的心脏切片用TTC(2，3，5-三苯基氯化四氮唑)染色液染色，鉴别梗塞区域，使用实体显微镜进行拍摄。基于拍摄出的图像，利用使用了图像处理软件image J的测量，对各个心脏切片测量LV (左心室区域)、AAR(Area At Risk :缺血区域)、Nec (Necrosis :梗塞区域)，算出AAR/LV (左心室中的缺血区域的比例)及Nec/AAR(缺血区域中的梗塞区域的比例)。将AAR/LV作为判断在全部样品中是否产生了相同程度的结扎的指标来使用，将Nec/AAR作为吸入效果的指标来使用。5.回路构成及气体的流动回路构成基本上是图I中所示的构成。考虑到安全性，氢气由氮气中的氢气浓度为4%的氮气稀释氢高压储气瓶供给。一氧化氮由在氮气中含有800ppm的一氧化氮的高压储气瓶供给。使用流量调整器及微量流量计，将在氮气中含有30%的氧气、2%的氢气、SOppm的一氧化氮的混合气体经由人工呼吸器向小鼠的肺中吸入给药。为了比较，将除了不含有氢气或一氧化氮以外与上述相同组成的混合气体同样地吸入给药，分别设为一氧化氮吸入组(一氧化氮80ppm、氧气30%)或氢气吸入组(氢2%、氧 30% )。在对照组中利用氧吸入进行呼吸管理的情况下，如图2所示，仅将来自氧气供给源3的氧气经由表盘式流量计8送至人工呼吸器7。实验结果将实验结果示于图3及图4中。图3针对各组表示出左心室中的缺血区域的比例(AAR/LV)。试验数如图所示，各值以平均土标准偏差表示。缺血区域的比例随着将左冠状动脉结扎的位置而变化。为评价再灌注损伤的程度，优选通过结扎制成的缺血区域的比例在各组中是相同程度。从图中可知，AAR/LV的值在各组中大致为相同程度。即，在各组中制成了大致相同程度的缺血区域。 图4表示缺血区域中的梗塞区域的比例(Nec/AAR)。试验数如图所示，各值以平均土标准偏差表示。将在t检验中确认到显著性差异的情况用*(p < O. 01)表示。与氢气和一氧化氮中的任一种都没有吸入的对照组相比，在氢气吸入组、一氧化氮吸入组、氢气 一氧化氮并用吸入组中Nec/AAR的值减少，利用t检验可以确认出显著性差异。另外，在一氧化氮吸入组与氢气 一氧化氮并用吸入组之间也有显著性差异，依照本发明的氢气·一氧化氮并用吸入组显示出比一氧化氮吸入组更高的再灌注损伤的减轻效果。在将氢气 一氧化氮并用吸入组与氢吸入组比较的情况下，虽然没有显著性差异，然而可以看到Nec/AAR值进一步减少的趋势。如前所述，作为副作用，一氧化氮产生细胞损伤性强的过氧亚硝基。可认为或许是因为氢气将该过氧亚硝基还原、中和，所以减少了因过氧亚硝基所致的损伤。另外，如果只是吸入氢气，则无法抑制在缺血再灌注时可见的嗜中性粒细胞的浸润或血小板的活化等，而通过并用一氧化氮，则可以实现这种抑制。需说明的是，本实验中，虽然同时吸入了氢气和一氧化氮，但是也可以在所述同时吸入的前后中的任一种情况、或者前后这两种情况下，进行仅吸入氢气或者仅吸入一氧化氮的操作。这种情况下的气体中的氢气浓度和一氧化氮浓度可以与本发明中给药的气体中的各自的浓度相同。
权利要求
1.一种用于减轻缺血再灌注损伤的吸入用气体状药剂组合物，其含有21 98%的氧气、O. I 4%的氢气、40 80ppm的一氧化氮,且其余部分实质上由惰性气体组成。
2.根据权利要求I所述的组合物,其中,所述惰性气体为氮气。
3.一种用于通过对患者直接或者经由人工呼吸器吸入给予权利要求I或2所述的药剂组合物而减轻缺血再灌注损伤的治疗装置，其具备惰性气体、氧气、氢气和一氧化氮各气体的供给源，与各气体供给源连接的压力调整器和流量计，以及用于从供给源供给各气体的供给路径；且全部气体供给路径按照在给药前汇合而形成实质上由惰性气体、氧气、氢气和一氧化氮组成的混合气体的方式加以配置。
4.一种缺血再灌注损伤的减轻方法，其特征在于，将实质上含有21 98%的氧气、O.I 4%的氢气、40 80ppm的一氧化氮且其余部分由惰性气体组成的气体状药剂组合物，通过吸入从缺血再灌注开始前到开始后对接受缺血再灌注治疗的患者给药。
5.根据权利要求4所述的方法，其中，所述惰性气体为氮气。
全文摘要
本发明提供一种副作用的危险性小、可抑制缺血再灌注时的嗜中性粒细胞的浸润或血小板活化的、用于减轻缺血再灌注损伤的治疗，其包括将含有21～98％的氧气、0.1～4％的氢气、40～80ppm的一氧化氮且其余部分由氮气、氦气等惰性气体组成的混合气体，在即将开始缺血再灌注前到再灌注开始后不久之间，对接受再灌注治疗的患者吸入给药。
文档编号A61P43/00GK102883730SQ20118001957
公开日2013年1月16日 申请日期2011年3月2日 优先权日2010年3月10日
发明者小林弘祐, 新保年弘, 小久保谦一 申请人:学校法人北里研究所