稳定的水性mia/cd-rap制剂的制作方法

专利名称：稳定的水性mia/cd-rap制剂的制作方法
稳定的水性MIA/CD-RAP制剂本发明涉及稳定的水性制剂，所述制剂包含至少5 mg/mL⑶-RAP和带电荷的氨基酸，所述氨基酸优选在约6至8的pH下具有净电荷。所述制剂的成分优选经过重复冻融循环仍稳定。在优选方面，所述制剂用于治疗，优选用于治疗炎性障碍，优选骨关节炎。此外，提供包含本发明的制剂的试剂盒。蛋白质用于药物、兽医产品、化妆品和其它消费产品、食品 、饲料、诊断用品、工业化学和去污领域的多种应用中。有时，这类用途受到蛋白质本身固有的或者其使用环境或介质造成的限制所限。这类限制可能导致蛋白质的稳定性差、性能变化或成本高。由于生物技术的出现，可以生产多种蛋白质用于治疗用途。蛋白质药物生产后，通常在其使用前予以储存。由于蛋白质通常比“传统”药物大且复杂这一事实，适于储存的蛋白质药物的配制和处理可能特别具有挑战性。关于蛋白质药物制剂和方法设计，参见Carpenter等人(1997), Pharm. Res. 14: 969-975 ；ffang (2000), Int. J. Pharmaceutics 203: I -60;以及 Tang 和 Pikal (2004)，Pharm. Res. 21: 191-200。在设计蛋白质药物生产的制剂和方法时，可考虑若干因素。主要考虑因素是蛋白质在制造、运输和操作步骤(可包括组合物的制备、冷冻、干燥、储存、运输、重构、冻/融循环、和最终用户的重构后储存)中任何或全部步骤中的稳定性。其它可能的考虑因素包括制造、操作和分配的容易程度和经济性；对患者给药的成品的组成；以及最终用户使用的容易程度，包括冻干制剂重构后的溶解度。液体制剂可满足某些目标。液体制剂的可能优点包括制造容易且经济以及最终用户便利。通常，当长时间储存时，多肽在溶液中是不稳定的(Manning等人(1989)，Pham.Res. 6: 903-918)。因此，已开发了另外的处理步骤来使得保质期更长，所述步骤包括干燥，例如冻干。冻干制剂还可以提供某些优点。冻干的可能有益之处包括蛋白质的稳定性提高以及运输和储存容易且经济。然而，对于最终用户来说，冻干的药物组合物可能不太便利。除了选择组合物的基本形式(例如，冻干的、液体、冷冻等)之外，蛋白质制剂的优化通常涉及改变所述制剂的组分及其各浓度，以使蛋白质稳定性最大化。多种因素可影响蛋白质稳定性，包括离子强度、pH、温度、冻/融循环、剪切力、冷冻、干燥、搅拌、和重构。物理降解(例如，变性、聚集、或沉淀)或化学降解(例如，脱酰胺、氧化、或水解)可导致蛋白质不稳定。制剂组分和浓度的优化主要基于经验研究和/或推理方法，以克服不稳定原因。有时，由于聚集和/或降解，在含有多肽的药物组合物的长期储存中，活性多肽可能会损失。因此，通过改变制剂内元素的浓度或通过加入赋形剂来修饰制剂，解决改善多肽稳定性的通常问题(美国专利No. 5，580，856和No. 6，171，586以及美国专利申请No. US2003/0202972,No. US 2003/0180287)。US 5，580，856为可加入试剂来使干燥蛋白质在再水合期间或之后稳定的原型应用，所述试剂例如天然聚合物、表面活性剂、硫酸多糖、蛋白质和缓冲剂。然而，除了多个选择之外，美国专利5，580，856并未教导应对哪个蛋白质加入哪个再水合稳定剂。因此，尽管技术人员已经了解该多个选择，但是其仍需在US 5，580，856描述的多个选择中为其蛋白质找到最佳条件。美国专利申请2003/0202972描述了抗Her2抗体的稳定的冻干制剂，其中所述稳定剂为糖、海藻糖、或缓冲剂。但是，尽管这些稳定剂可能可用于抗体，但是不能推导出它们可用于其它蛋白质。美国专利申请2003/0180287在以下方面类似于US 2003/0202972 :它也描述了免疫球蛋白样蛋白质即含Fe结构域的蛋白质的稳定溶液。所述稳定剂可以为磷酸钠、磷酸钾、柠檬酸钠或柠檬酸钾、马来酸、乙酸铵、tris-缓冲剂、乙酸盐、二乙醇胺、组氨酸、赖氨酸或半胱氨酸。在这些可以由技术人员选择的化学上不同的稳定剂中，证明赖氨酸是适合的。然而，与US 2003/0202972相同，特定稳定剂仅适于特定蛋白质，该 文中为含Fe结构域的蛋白质，而本身不能推导到另一蛋白质。因此，添加剂的使用无法从特定蛋白质推到到另一不相关蛋白质。事实上，添加剂的使用——尽管改善储存——仍然导致多肽无活性。此外，在冻干的情况下，再水合步骤可引入导致例如由聚集或变形所致的多肽失活的条件(Hora等人(1992)，Pharm. Res. , 9:33-36 ;Liu等人(1991)，Biotechnol. Bioeng. , 37: 177-184)。事实上，由于其可能导致免疫原性，多肽的聚集是不期望的(Cleland等人(1993)，Crit. Rev. Therapeutic DrugCarrier Systems, 10: 307-377 ;和 Robbins 等人(1987)，Diabetes, 36: 838-845)。生物活性在药物产品开发和制造期间的保持取决于大分子的固有稳定性以及采用的稳定化技术。存在多种蛋白质稳定化技术，包括向蛋白质的水性溶液或悬浮液中加入化学“稳定剂”。例如，美国专利4，297，344公开了通过加入选择的氨基酸使凝血因子II和VIII、抗凝血酶111和血纤溶酶原抗热而稳定。美国专利4，783，441公开了用于通过加入表面活性物质来稳定蛋白质的方法。美国专利4，812，557公开了用于使用人血清白蛋白来稳定白介素-2的方法。其中将制备物与冷冻保护剂混合然后储存于极低温度下的冻/融方法为使蛋白质稳定的另一选择。然而，不是所有的蛋白质都会在冻/融循环中存活。与冷冻保护剂添加剂(通常为甘油)一起冷储存是又一选择。还可以进行描述于美国专利5，098，893中的以玻璃形式储存。在这种情况下，将蛋白质溶解于为无定形或玻璃状态的水溶性或水可溶胀物质中。用于使蛋白质稳定化的最广泛使用的方法冷冻-干燥或冻干。无论是否能够在水溶液中获得足够的蛋白质稳定性，冻干为最可行的备选方案。冻干的一个缺点为其需要复杂的处理、耗时且昂贵。此外，如果没有仔细进行冻干，则大多数制备物会至少部分地被该技术的冷冻和脱水步骤变性。结果是一部分蛋白质分子往往不可逆地聚集，导致制剂无法用于肠胃外给药。通常而言，蛋白质的降解已充分描述于文献中，但是储存和溶解度、特别是⑶-RAP/MIA (进一步称为⑶-RAP)的储存和溶解度尚未得以描述。⑶-RAP为由恶性黑素瘤细胞和软骨细胞分泌的可溶小蛋白。近来，有证据将⑶-RAP鉴定为采用SH3结构域样折叠的胞外蛋白小家族的原型。据认为，CD-RAP与胞外基质蛋白中的特定表位之间的相互作用调节肿瘤细胞和软骨细胞的附着(Moser等人(2002)，Mol Cell Biol. 5:1438-45)。同时，US 2002/0103360和WO 2004/015078公开了 CD-RAP-相关蛋白。然而，两件申请都没有⑶-RAP-相关蛋白的净电荷稳定的制剂。迄今为止，WO 2008/040556公开了基于脂质体的⑶-RAP制剂。具体而言，公开了干燥的药物组合物，所述药物组合物重构后包含含有CD-RAP的多层囊泡，由此CD-RAP蛋白被包封和/或夹带于脂质体中以用于持续CD-RAP递送，使得其可以在期望作用位点保留更长的时间段。CD-RAP的一个功能是其用作间质干细胞上的趋化因子。尽管CD-RAP不能诱导鼠或人间质干细胞(HMSC)的分化，但是其影响骨形态发生蛋白(BMP)-2和转化生长因子(TGF)-P 3在间质干细胞分化期间的作用，从而支持软骨形成显型，同时抑制成骨分化。此外，CD-RAP减量调节骨桥蛋白和骨钙蛋白在经BMP-2处理的HMSC培养物中的基因表达，从而抑制BMP-2的成骨潜力。在人原代软骨细胞的情况下，CD-RAP刺激胞外基质沉积，从而增加氨基葡聚糖含量。因此据信，CD-RAP为软骨形成分化和软骨维持期间的重要调节因子。因此，据信⑶-RAP为有希望用于软骨修复的候选物。因此可期望的是，可得到以足够量包含CD-RAP的药物制剂，其在储存期间长时间稳定。事实上，具有高浓度CD-RAP的稳定制剂将使得患者的注射体积减少，这会将少由于大体积注射导致的如疼痛的副作用，并自然允许提高每个剂量。此外，尽管本领域已知蛋白质稳定剂的多个选择并且可得到允许高浓度蛋白质存在且使其保持稳定的试剂，本领域仍未认识到，包含高浓度CD-RAP蛋白的制剂是不稳定的，并因此需要改进。从而，本发明的技术问题为满足上文所述的需要。
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本发明解决了这些需要，并因而提供了所述技术问题的解决方案，涉及制剂的实施例，以及将这些制剂应用于治疗受试者的方法和用途，所述受试者患有将会从CD-RAP给药受益的疾病。本文以实施例的方式表征和描述了这些实施方案，并反映在权利要求书中。必须注意的是如本文所用，单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数指代，除非上下文另有明确指示。因此，例如，提到“抗体”包括一个或多个此类不同抗体，提到“方法”包括提到本领域普通技术人员已知的等同步骤和方法，所述步骤和方法可以被修改或者代替本文所述的方法。本发明引用的所有出版物和专利均通过引用全文并入本文。当通过引用并入的材料与本说明书冲突或不符合本说明书时，本说明书优先于任何此类材料。除非另有指示，在一系列元素之前的术语“至少”应理解为是指该系列中每一个元素。仅使用常规实验手段，本领域技术人员将认识到或能够确定本文描述的本发明具体实施方案的许多等同方式。此类等同方式意在被本发明涵盖。除非上下文另有指示，在本说明书和所附权利要求书全文中，词语“包含/包括”和变型将理解为表示包括所指出的整数或步骤或者整数或步骤的组，而不排出任何其它整数或步骤或者整数或步骤的组。当本文使用时，术语“包含/包括”可以被替代为术语“含有”，或者当本文使用时，有时可以被替代为术语“具有”。当本文使用时，“由……组成”排除在要求的元素中被指明的任何元素、步骤或成分。当本文使用时，“基本上由……组成”不排除不会实质上影响该权利要求的基本和新颖特征的材料或步骤。在本文的每个情况下，术语“包含/包括”、“由……组成”和“基本上由……组成”中的任一个可被另外两个术语中任一个替代。如本文所用，在多个所述元素之间的连接术语“和/或”理解为涵盖两个单独的选择和组合选择。例如，当两个元素被“和/或”连接时，第一选择是指应用第一元素而无第二元素。第二选择是指应用第二元素而无第一元素。第三选择是指一起应用第一和第二元素。这些选择中的任一个都理解为落入该含义中，因此满足如本文所用的术语“和/或”的要求。同时应用超过一个选择也理解为落入该含义中，因此满足如本文所用的术语“和/或”的要求。本说明书的文本中引用了若干文件。无论上下文，本文应用的每个文件(包括所有专利、专利申请、科学出版物、制造商的说明书、指示等)均通过引用全文并入本文。不能将本文理解为承认本文不在现有发明的这些公开内容之前。本发明人的目标是提供一种制剂，所述制剂具有大量CD-RAP，以便当所述制剂注射到有此需要的受试者中时可以采用小体积，从而减少由于大体积注射导致的副作用如疼痛，本发明人认识到，CD-RAP蛋白在高浓度下可能是不稳定的，并且在经长时间储存后也可能是不稳定的。鉴于此，在本发明人以提供高度浓缩的稳定制剂为目标的研究期间已观察到，他们已观察到CD-RAP蛋白的特定不稳定性，因而，致力于改善此不期望的观察结果。因此，他们致力于浓缩CD-RAP，同时在溶液中保持CD-RAP，即在溶解阶段。通过这样做，他们可获得多个选择和备选，然后却不具有这些选择和备选中任何一个将适于解决目标问题的任何指
/Jn ο “溶解阶段”表示，⑶-RAP蛋白为在溶液中，优选地以至少5 mg/ml⑶-RAP的浓度，即直接溶解和/或分散于制剂的水性溶液中(即在水相中)。优选地，CD-RAP蛋白均匀地溶解和/或分散。“均匀地”表示，溶解和/或分散于稳定的水性制剂中的CD-RAP蛋白的量是几乎均一地、优选均一地分散于水性制剂中，以使得⑶-RAP蛋白的量(在摩尔质量的情况下为“n”，或在质量的情况下为“m”)的浓度(“c”)是在水性溶液的体积(“V”)中(或整个体积中)几乎同一地，优选同一地，即c=n/v或c=m/v分别为几乎恒定的，优选恒定的。优选地，在制剂内无浓度梯度。因此，包含⑶-RAP蛋白的本发明的稳定水性制剂可以优选地被认为是水性溶液，其中CD-RAP直接溶解和/或分散于其中。更优选地，本发明的稳定水性制剂可以被认为是至少5 mg/ml的水性⑶-RAP蛋白和带电荷的氨基酸。这表示，所述制剂基于水性溶液，其中至少5 mg/ml⑶-RAP蛋白与至少带电荷的氨基酸一起溶解和/或分散。或者，本发明的稳定水性制剂可以更优选地被认为是基于水性溶液的稳定的制齐U，所述制剂包含至少浓度(重量/体积)为5 mg/ml的CD-RAP蛋白和带电荷的氨基酸。“溶液”为一种或两种或更多种物质/组分的均匀混合物。在这种混合物中，溶质(在本发明中为⑶-RAP蛋白，优选至少5 mg/ml⑶-RAP蛋白)溶解于(如上文所述的)另一物质(在本发明中，优选水性制剂)中，所述另一物质也称为溶剂。鉴于上文，⑶-RAP蛋白优选非不均匀地溶解和/或分散于所述水性溶液中。术语“溶解状态”还包括，所述CD-RAP蛋白优选基本上不乳化于所述水性溶液中，或更优选根本不乳化于所述水性溶液中。并且，术语“溶解状态”包括，所述⑶-RAP蛋白优选基本上不被包封和/或捕集(优选小于2%、1%、或O. 5%的所述CD-RAP蛋白可以被包封和/或捕集)于例如脂质体、多层脂质体等中，或更优选根本不被包封和/或捕集于例如脂质体、多层脂质体等中。因此，在优选方面，本发明包括稳定的水性的基本上不含脂质体(优选小于2%、1%、或O. 5%脂质体)、优选不含脂质体的制剂，所述制剂包含至少5 mg/ml⑶-RAP蛋白和带电荷的氨基酸。在备选的更优选方面，本发明包括稳定的水性制剂，所述制剂包含至少5 mg/mlCD-RAP蛋白和带电荷的氨基酸，其中所述CD-RAP蛋白基本上不被包含(优选小于2、I、或O. 5%)、优选不被包含(包封和/或捕集)于脂质体中。实际上，存在蛋白质可能不稳定多种方式。例如，可以通过蛋白质聚集导致蛋白质不稳定，还可以通过由脱氨基、氧化、二硫键断裂和形成、水解、琥珀酰亚胺化、非二硫键交联、去糖基化或“酶促褐化”(Maillard反应)或这些现象的任何组合所致的化学不稳定导致蛋白质不稳定；参见，例如，Wang等人(1999)，Int. J. Pharm. 185: 129-188和图I。此外，物理化学参数例如温度、PH值、表面吸附、盐、金属离子、螯合剂、物质力量例如剪切力、蛋白质变性剂、非水性溶剂、蛋白质浓度、蛋白质的来源和纯度、蛋白质型态或压力可以影响蛋白质稳定性。尽管存在可以影响蛋白质稳定性的多个因素，但是可以采取多种手段使蛋白质稳定。例如，可以内部地(通过改变氨基酸)或外部地使蛋白质稳定。可以通过螯合剂、金属离子、还原剂、聚合物、聚乙二醇/多元醇、血清白蛋白、表面活性剂、糖和多元醇、脂肪酸和磷脂、氨基酸、缓冲剂等实现外部稳定化；参见，例如，Wang, Y和Hanson M (1988)，J. Parental Sci. & Technology, 42, Supplement: 4-26 ;Wang 等人(1999)，Int. J.Pharm. 185: 129-188，和图2。简而言之，为了使制剂中的⑶-RAP蛋白稳定化，技术人员可以利用多种选择。在这种情况下，本发明人观察到，所述CD-RAP蛋白表现出聚集。多种不同因素可以导致蛋白质制剂中的蛋白质聚集。典型的纯化和储存程序可以将蛋白质制剂暴露于导致蛋白质聚集的条件和组分。例如，蛋白质制剂中的蛋白质由于以下因素中的一种或多种而聚集储存、暴露于高温、制剂的pH、制剂的离子强度、和某些表面活性剂的存在(例如，聚山梨醇酯-20和聚山梨醇酯-80)和乳化剂。类似地，当暴露于剪切应力时,例如,将冻干的蛋白质饼在溶液中重构、用过滤器纯化蛋白质样品、冻融、振摇、或经由注射器转移蛋白质溶液，蛋白质可聚集。还可由于多肽分子在溶液中和在储存瓶内的液体-空气界面处的相互作用而发生聚集。在运输期间由于搅拌导致的界面压缩或延伸过程中，吸附至空气-液体和固体-液体界面的多肽中可发生构象变化。该搅拌可以导致制剂的蛋白质聚集，并且最终与吸附的其它蛋白质一起沉淀。。 此外，蛋白质制剂暴露于光可导致蛋白质聚集。因而，本发明提供能够获得高浓度CD-RAP和降低蛋白质减少的制剂。在不被理论所限的情况下，通过控制上述聚集机制中的一种或多种来实现蛋白质聚集的减少。这可导致例如改善产品稳定性，使制造过程和储存条件更灵活。具体而言，本发明人发现，在约6至约8的pH下携带净电荷的多种被测试试剂氨基酸可用于使高浓度的CD-RAP蛋白稳定，例如通过介导蛋白质溶解度和/或抑制蛋白质聚集。当在本文中提及时，氨基酸优选表示L-氨基酸。较不优选地为D-氨基酸。优选地，所述氨基酸为L-组氨酸、L-精氨酸、L-谷氨酸或其盐；优选地，所述盐为氯化盐、磷酸盐、乙酸盐或硫酸盐。因此，本发明至少部分地基于以下发现，S卩，下述制剂对于长期储存和/或一个或多个冻/融循环来说是充分稳定的所述制剂包含至少5 mg/mL CD-RAP和带电荷的氨基酸或其盐(优选地，所述盐为氯化盐、磷酸盐、乙酸盐或硫酸盐)，更优选地，所述制剂包含缓冲齐U、二糖、增量剂、和任选的表面活性剂。相比标准缓冲制剂，本发明的制剂具有多个优点。一方面，所述制剂包含高CD-RAP蛋白浓度，例如30 mg/mL或更高。令人吃惊的是，尽管包含高浓度的蛋白质，所述制剂的聚集极少，并且可以使用多种方法和形式储存，例如冷冻，而不具有高蛋白质制剂预期具有的有害作用。在一些较不优选的实施方案中，本发明的制剂不需要赋形剂，例如，表面活性剂和缓冲体系，所述赋形剂用于传统制剂中，以使溶液中的蛋白质稳定。此外，本文描述的制剂优于标准制剂，其原因为，优于缺少用于蛋白质稳定化所需的额外的试剂，它们具有的免疫原性低。因而，本发明涉及液体制剂，优选涉及稳定的液体制剂，其令人吃惊地允许长期储存CD-RAP多肽或其生物活性类似物和带电荷的氨基酸或其盐，所述生物活性类似物的氨基酸序列与⑶-RAP的4个半胱氨酸骨架(如下文描述的SEQ ID No. I的氨基酸12至107)共有至少63%序列同源性；所述⑶-RAP多肽或其生物活性类似物的浓度为至少5 mg/mL，优选至少7. 5 mg/mL,更优选至少10 mg/mL,甚至更优选至少15 mg/mL,特别优选至少20 mg/mL更特别优选至少25 mg/mL,甚至更特别优选至少30 mg/mL ;所述带电荷的氨基酸的盐优选氯化盐、磷酸盐、乙酸盐或硫酸盐。此制剂是有用的，部分原因为，此制剂更便于患者使 用，因为此制剂的CD-RAP多肽高度浓缩，从而减少副作用，例如由高体积注射导致的疼痛。此外，在低水平的动态流体压力下将所述制剂关节内注射施用给患者，会增加软骨发生。本发明的制剂(本文中有时还称为“主题组合物”或“组合物”)可以优选地处于各种物理状态，例如液体的、冷冻的、冻干的、冷冻-干燥的、喷雾-干燥的和重构的制剂，其中优选液体的和冻干的。优选地，所述制剂的PH为6. 0，并且更优选地，pH为5. 5至9. 0，更优选地，所述制剂的pH为6. O至8. 0，再更优选地，pH为6. 5至7. 6，最优选地，pH为7. O至
7.5。如本文所用的“液体制剂”是指可见主题组合物为液体的，其特征在于，它们中的组成分子自由运动，但是无在室温下分离的倾向。液体制剂包括水性和非水性液体，其中优选水性制剂。水性制剂为其中溶剂为水的制剂。CD-RAP多肽在所述制剂中的溶解可以为均匀的或不均匀的，其中如上文所述优选均匀的。可以采用任何适合的非水性液体，条件是它给本发明的制剂提供稳定性。优选地，所述非水性液体为亲水液体。适合的非水性液体的示例性实例包括甘油；二甲基亚砜(DMSO);聚二甲基硅氧烷(PMS);乙二醇，例如乙二醇、二乙二醇、三乙二醇、聚乙二醇(“PEG”)200,PEG 300、和PEG 400 ;和丙二醇，例如二丙二醇、三丙二醇、聚丙二醇(“PPG”)425 和 PPG 725。如本文所用的“混合的水性/非水性液体制剂”是指液体制剂，其含有水和另外的液体组合物的混合物。当本文使用时，“制剂”为CD-RAP多肽(S卩，活性药物/物质)和药物产品所需的其它化学物质和/或添加剂的混合物，其优选处于液体状态。本发明的制剂包括药物制剂。术语“药物制剂”是指处于下述形式的制剂所述形式允许活性成分的生物活性为有效的，并因此可以被施用给受试者以用于如本文描述的治疗用途。所述制剂的制备包括以下方法在所述方法中，将不同化学物质，包括所述活性药物，组合以形成最终的药物产品，例如药物组合物。本发明的制剂的活性药物为CD-RAP多肽。术语“多肽”可以在本文中与术语“蛋白质”互换地使用，并且如本文所用，包括肽、多肽、蛋白质和融合蛋白。可以通过重组或合成方法制备蛋白质。
在某些实施方案中，要进行配制的⑶-RAP蛋白为基本上纯的和/或基本上同种类的(B卩，，基本上不含污染性蛋白质等)。术语“基本上纯的”蛋白质表示这样的组合物所述组合物包含至少约80重量％、优选90重量％的蛋白质级份,优选包含至少约95重量％的蛋白质级份，更优选包含97重量％的蛋白质级份或最优选包含98重量％的蛋白质级份。术语“基本上同种类的”蛋白质表示这样的组合物除了溶液中的各种稳定剂和水的质量，所述组合物包含至少约99重量％的蛋白质级份。本发明的制剂的⑶-RAP多肽为本领域已知的(参见EP-Bl 710 248或EP-Bl I146 897)和/或为本文所描述。应用于本发明的制剂中的CD-RAP (软骨源性视黄酸敏感蛋白)多肽为⑶-RAP多肽，也称为MIA (黑素瘤抑制活性)、OTOR (纤维细胞源性蛋白FDP，MIA-类，MIAL)和属于分泌蛋白类别的TANGO 130，如Bosserhoff 等人(2004)，Gene Expr.Patterns. 4: 473-479 ;Bosserhoff和Buettner (2003), Biomaterials 24: 3229-3234;Bosserhoff 等人(1997)，Dev. Dyn. 208: 516-525 ；W0 00/12762 ；W0 2004/015078 ；EP-Bl 710 248 ；US 2002/0103360 ;或EP-Bl I 146 897中所述。应用于本发明的制剂中的CD-RAP蛋白优选为重组人CD-RAP蛋白(rh CD-RAP)。还优选的是，本发明的制剂的⑶-RAP多肽为包含或具有⑶-RAP的成熟序列(SEQID No. I)及其功能片段或变体的多肽；b)与⑶-RAP的4个半胱氨酸骨架(SEQ ID No. I的氨基酸12至107)具有至少63%、更优选70%、甚至更优选80%、更优选90%、最优选95%氨基酸序列同源性的多肽；或c)具有本文限定的通用序列I至3 (SEQ ID No. 2、3和4)中任一个的多肽。⑶-RAP的变体为具有SEQ ID NO: 4的蛋白质或如WO 2004/015078中所 述的其成熟形式或者具有SEQ ID NO. 14的蛋白质或如US 2002/0103360中所述的其成熟形式。本文中鉴定的相对于CD-RAP序列的“氨基酸序列同源性百分比(%)”定义为，在将序列和引入间隙(如果需要)进行比对以实现最大序列同一性百分比之后(并且将任何保守置换考虑为序列同一性的一部分)之后，候选序列中的氨基酸残基与CD-RAP序列中的氨基酸残基相同的百分比。可以以多种方式实现以测定氨基酸序列同一性百分比为目的的比对，所述方式在本领域技术范围内，例如使用公众可得的计算机软件，例如BLAST、ALIGN、或Megalign (DNASTAR)软件。本领域技术人员可以确定用于测量比对的合适参数，包括在进行比较的序列全长上实现最大比对所需的任何算法。具有与⑶-RAP相同的生物学功能的功能片段优选具有SEQ ID No. I中所示序列的至少20、特别是至少40、更优选至少50、最优选80个邻近氨基酸长度。优选地，所示功能片段包含SEQ ID No I的第I至50位、第I至70位、第I至80位、第20至80位、第20至107位的氨基酸。成熟的CD-RAP 序列(SEQ ID No. I)GPMPKLADRKLCADQECSHPISMAVALQDYMAPDCRFLTIHRGQVVYVFSKLKGRGRLFWGGSVQGDYY⑶LAARLGYFPSSIVREDQTLKPGKVDVKTD KffDFYCQ通用序列I (SEQ ID No. 2)C X4 C X17 C X12 V X n_13 W X7_18 F X4 V X21 C X通用序列2 (SEQ ID No. 3)K X C X D X E C X11 D X3 P D C X12 V X2 K L X7_9 WXGS X5_13 G Y F P X3 VX18 D F X C X
通用序列3 (SEQ ID No. 4)KXCXD X2 C X8 A X2 D X3 PDCRF X5 GXV X5 KL X7 WXGSV X12 GYF P X22 D F X C Q其中每次出现的“X”独立地表示任何氨基酸，下标数字指示任何氨基酸的数量。优选地，“X”独立地表示天然存在的氨基酸，且特别是表示A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y或V。“X”还可以表示非标准氨基酸，例如羊毛硫氨酸、2-氨基异丁酸、脱氢丙氨酸、鸟氨酸、瓜氨酸、β丙氨酸或正亮氨酸。当然，还预见到本领域熟知的翻译后修饰。因而，本发明的CD-RAP多肽可以经翻译后修饰。可以在原核或真核宿主细胞中由完整的或截短的基因组DNA或cDNA或者由合成的DNA表达应用于本发明的制剂中的CD-RAP蛋白。可以从培养基或内含体中分离蛋 白质和/或再折叠以形成生物活性组合物。参见例如EP-Bl 710 248和Lougheed等人(2001)，Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 98: 5515-5520 的用于 CD-RAP 的重组蛋白质纯化的示例性规程。如何测试此类分离蛋白质的活性(例如软骨发生)的详细说明描述于Tscheudschilsuren等人(2005)，Exp. Cell Res. 1-10 ;或Stoll 等人(2003)，ProteinSci. 12: 510-519中。软骨诱导的生物检测描述于EP-Bl I 146 897的实施例2至5。下文且在实施例7和8中描述了其它生物检测。基因工程细胞生产多肽的方法是本领域熟知的。参见，例如，Ausubel等人，eds.(1990), Current Protocols in Molecular Biology (Wiley, New York)。此类方法包括将编码且允许多肽表达的核酸引入到活宿主细胞中。这些宿主细胞可以为细菌细胞，真菌细胞，或者优选为在培养物中生长的动物细胞。细菌宿主细胞包括、但不限于，大肠杆菌细胞。适合的大肠杆菌菌株的实例包括HB101、DH5a、GM2929、JM109、KW251、NM538、NM539jP无法切除外源DNA的任何大肠杆菌菌株。可以使用的真菌宿主细胞包括、但不限于，酿酒酵母、毕氏酵母和黄曲霉细胞。可以使用的多个动物细胞系实例为CHO、VERO、BHK、HeLa、CoS、MDCK、293、3T3、和WI38。可以使用本领域技术人员熟知的方法建立新的动物细胞系(例如，通过转化、病毒感染和/或选择)。任选地，宿主细胞可以将所述多肽分泌到培养基中。用于多肽纯化的技术例如离子交换柱分级、乙醇沉淀、反相HPLC、硅胶色谱、肝素SEPHAR0SET色谱、阴离子或阳离子交换树脂色谱(例如聚天冬氨酸柱)、色谱聚焦、SDS-PAGE、和硫酸铵沉淀可以根据需要进行使用。可以如EP-Bl I 697 523的实施例中所述表达和纯化应用于本发明的制剂中的⑶-RAP蛋白。在一些实施方案中，⑶-RAP蛋白在本发明的制剂中的浓度为至少5 mg/mL，优选为至少7. 5 mg/mL,更优选为至少10 mg/mL,甚至更优选为至少15 mg/mL,特别优选为至少20mg/mL,更特别优选为至少25 mg/mL,甚至更特别优选为至少30 mg/mL。在一些实施方案中，⑶-RAP蛋白在本发明的制剂中的浓度选自下述范围约5mg/mL 至约 10 mg/mL,约 10 mg/mL 至约 20 mg/mL,约 15 mg/mL 至约 25 mg/mL,约 20 mg/mL至约 30 mg/mL,或约 5 mg/mL 至约 30 mg/mL。在优选方面，本发明的CD-RAP制剂、特别是稳定水性制剂不包含脂质体和/或基质材料。优选地，本发明的CD-RAP制剂不包含脂质体和/或选自下述的基质材料透明质酸、海藻酸盐、胶原、肝素、纤维蛋白、纤维蛋白原、脱矿骨、丙交酯-乙交酯共聚物和/或丙交酯-乙交酯共聚物衍生物或它们的组合。更优选地，所述CD-RAP制剂不含有脂质双层。
在其它优选方面，所述⑶-RAP蛋白不以1-4 mg/mL的浓度(包括I. O mg/mLU. 5mg/mL、2. O mg/mL、2. 5 mg/mL、3. O mg/mL、3. 5 mg/mL>4. 0 mg/mL)包含在精氛酸/H3PO4 中，所述精氨酸/H3PO4的浓度优选为350-420 mM。更优选地，所述⑶-RAP蛋白不以I. 15 mg/mL或3 mg/mL的浓度包含在pH 7. 5的350 mM或420 mM精氨酸/H3PO4中。当本文使用时，术语“约”理解为表示所描述制剂的CD-RAP蛋白的浓度存在变动，所述变动可以为给定值的5%、10%、15%或高达且包括20%。例如，如果制剂具有约5 mg/mL⑶-RAP多肽，则理解为表示制剂可以具有3至7 mg/mL、更优选4至6 mg/mL。因而，如本文所用，限定为“X至Y”的浓度区间等于限定为“X和Y之间”的区间。两个时间区间均特别包括上限值以及下限值。这表示，例如“5 mg/mL至10 mg/mL”或“5 mg/mL至10 mg/mL”之间的区间包括5、6、7、8、9、和/或10 mg/mL的浓度。“稳定的”制剂为这样的制剂在所述制剂中的蛋白质经储存基本上保持其物理稳定性和/或化学稳定性和/或生物活性，和/或优选经颜色和/或澄清度的视觉检查，或通过UV光散射或尺寸排阻色谱测定，与对照样品相比显示出基本上无聚集、沉淀和/或变 性的迹象。本领域可得到用于测量蛋白质稳定性的各种其它分析技术，所述技术综述于例如 Peptide and Protein Drug Delivery, 247-301，Vincent Lee Ed. , Marcel Dekker,Inc. , New York, N. Y., Pubs. (1991)和 Jones, A. Adv. Drug Delivery Rev. 10: 29-90(1993)。优选地，相对于本发明的制剂的术语“稳定的”理解为表示，相对于⑶-RAP多肽在储存开始时和/或冻融期间或之后的活性，所述制剂的CD-RAP多肽在储存期间不失去其生物活性的超过15%、或更优选10%、或甚至更优选5%、以及最优选3%。可以通过描述于EP-BlI 146 897中的实施例2至5的用于软骨诱导的生物检测来测定⑶-RAP生物活性。其它生物检测为 Stoll 等人，(2006)，Biol. Chem. , Vol. 387，pp. 1601 - 1606 或实施例 7 和8中描述的侵入检测。如本文所用的“储存期间”表示这样的制剂所述制剂在制备后不立即使用；相反，在其制备后，将其包装进行储存，以冷冻状态或以干燥形式以之后重构成液体形式或其它形式。“重复冻融循环”包括本发明的制剂进行一次或多次冻融循环，例如1、2、3、4、5或更多次冻融循环。然而，如本文所述且示于实施例中，本发明的制剂在重复冻融循环下保持稳定。因此，所述⑶-RAP多肽优选在重复(1、2、3、优选4、5或更多次)冻融循环下为稳定的，优选地，所述冻融循环如下5° C至-25° C，冷却和加热速率I. O ° C/min，其中各循环之间的等温步骤为15 min。不被理论所限，优选在本发明上下文中应用的冻融循环模拟可能在大量溶解蛋白冷冻期间产生的冷冻应力。因此，由于本发明的制剂证明能够在冻融循环期间保持CD-RAP在溶液中稳定，本发明的制剂是卓越的，且具有有利特性。储存期间可能会形成聚集体，例如由于暴露于高温。“高温”表示高于正常储存本发明的包含CD-RAP多肽的制剂的温度的任何温度正常储存温度为约4° C至10° C，优选约4° C至8° C，更优选约4° C至6° C，甚至更优选在约4° C的温度。形成聚集体的其它原因可以为制剂的pH、制剂的离子强度、某些表面活性剂(例如，聚山梨醇酯-20和聚山梨醇酯-80)的存在、乳化剂，和/或由于多肽具有形成此类聚集体的固有倾向。不被理论所限，估计CD-RAP多肽的聚集体形成可能由前述原因中的一个或多个导致，并且可能造成活性的损失。因此，预见到CD-RAP多肽优选为稳定的，程度为其在储存期间和/或冻融期间或之后基本上不形成聚集体(例如，因为前述原因中的一个或多个)。因此，优选预见到，相对于⑶-RAP多肽在储存开始时的量，⑶-RAP多肽的不超过10%、更优选不超过8%、甚至更优选不超过5%、甚至更优选不超过3%、特别优 选不超过1%形成聚集体。在备选方案中，预见到CD-RAP多肽优选为稳定的，程度为其不形成二聚体或寡聚体。换而言之，可以根据溶液中单体蛋白质的百分比与降解的(例如，片段化的)和/或聚集的蛋白质的低百分比测定CD-RAP蛋白的稳定性。例如，本发明的包含CD-RAP蛋白的制剂可以包括至少90%、更优选至少92%、甚至更优选至少95%、进一步甚至更优选至少97%、特别优选至少98%、最优选99%的单体⑶-RAP蛋白。“聚集体”表示蛋白质分子之间导致共价或非共价二聚体或寡聚体(S卩，高分子量实体)形成的物理相互作用，所述共价或非共价二聚体或寡聚体可以保持可溶或形成从溶液中沉淀出来的不溶的聚集体。“聚集体”还包括降解的和/或片段化的CD-RAP蛋白。可以在向制剂中加入如本文描述的带电荷的氨基酸之前、基本上同时或之后测量制剂中蛋白质聚集的水平。在某些实施方案中，在向制剂中加入如本文描述的带电荷的氨基酸之后的约I天至约12周至少一次测量聚集的水平。在其它实施方案中，在向制剂中加入如本文描述的带电荷的氨基酸之后的约I个月至36个月至少一次测量聚集的水平。如上文所述，可以使用多种不同分析方法来检测包含蛋白质的制剂中聚集体的存在和水平。这些方法包括、但不限于，例如，非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)、十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、毛细管凝胶电泳(CGE)、尺寸排阻色谱(SEC)、分析超离心(AUC)、场流分级(FFF)、光散射检测、沉降速度、紫外光谱、差异扫描量热法、浊度测定法、比浊法、显微法、尺寸排阻色谱-高效液相色谱(SEC-HPLC)、反相高效液相色谱(RP-HPLC)、电喷雾串联质谱(ESI-MS)、和串联RP-HPLC/ESI-MS、流场流分级技术以及静态和/或动态光散射。可以单独或组合使用这些方法。优选地，检测包含蛋白质、优选CD-RAP的制剂中聚集体的存在和水平的分析方法为尺寸排阻色谱-高效液相色谱(SEC-HPLC)和流场流分级技术稳态和/或动态光散射。包含蛋白质的制剂的常见问题是聚集体随时间、热或剪切应力的不可逆累积。通常，当聚集体沉淀时，它们形成易于检测的大颗粒。然而，通常是沉淀大颗粒的前体的较小、非共价可溶聚集体更难以检测和定量。因而，检测和定量蛋白质制剂中蛋白质聚集的方法需要基于进行评估的聚集体的类别。在上述方法中，测定蛋白质制剂中可溶、共价聚集体的存在和/或量的推荐方法为SEC/光散射、SDS-PAGE、CGE、RP-HPLC/ESI-MS、FFF和AUC。测定蛋白质制剂中可溶、非共价聚集体的存在和/或量的推荐方法为SEC、PAGE、SDS-PAGE、CGE、FFF、AUC、和动态光散射。测定蛋白质制剂中不可溶、非共价聚集体的存在和/或量的推荐方法为紫外光谱、浊度测定法、比浊法、显微法、AUC、和动态光散射。鉴于上文，本发明的另一实施方案是提供用于本发明的制剂中CD-RAP多肽的稳定性的快速稳定性检测的方法，所述方法包括以下步骤测试根据本发明配制的多肽在储存之前(即，时间为零)的活性，将所述组合物储存于约37° C至42° C、优选约37° C至少一个月并测量所述多肽的稳定性，然后将时间为零的稳定性与一个月时间点的稳定性进行比较。此信息有助于较早去除看起来初始具有良好稳定性、但无法更长时间良好储存的批次或批号。此外，本发明的制剂优选提供改善的长期储存，使得所述CD-RAP蛋白以液体或冷冻状态(优选以液体形式)经储存期为稳定的。如本文所用，短语“长期”储存理解为表示，所述制剂可以储存至少I个月、2或3个月或者更长、6个月或更长、并优选I年或更长。长期储存还理解为表示，所述药物组合物以2-8 C下液体或-20° C下或更冷的冷冻储存，从而所述制剂优选如本文描述的程度不失去其生物活性和/或如本文描述的程度不形成聚集体和/或如本文描述的程度包含单体。本文别处描述了用于这些性质的测试。还预见到并在实施例中证明了所述制剂可以被冷冻和融解超过一次。在本发明的一个方面，所述制剂中的⑶-RAP蛋白以液体形式稳定至少I个月、2个月、3个月；至少4个月、至少5个月；至少6个月；至少12个月。同样预期上述时间段中间的范围也是本发明的一部分，例如9个月等等。此外，预期包括使用任何上述数值作为上限 值和/或下限值的组合的数值范围。优选地，所述制剂在室温(约20° C)或30° C下稳定至少I个月和/或在约2-8° C下稳定至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月，或更优选在约2-8° C下稳定至少2年。此外，所述制剂优选在制剂的冷冻(至例如-80° C)和融解之后(本文还称为“冻/融循环”)为稳定的。出乎意料地，旨在使⑶-RAP蛋白在高浓度下稳定的本发明人发现，在约6至8的PH下具有净电荷的氨基酸允许制备高度浓缩的CD-RAP制剂，并且所述氨基酸起到长期减少CD-RAP多肽在这种制剂中聚集的作用，由此得到如本文描述的稳定的制剂。因此，在优选方面，由本发明的稳定制剂包含的带电荷的氨基酸在在约6至8的pH下具有净电荷。术语“净电荷”表示，取决于蛋白质的氨基酸的性质，在所述氨基酸或蛋白质的表面上的正和负电荷不为零。所述净电荷取决于带电荷的氨基酸的数量和性质，并取决于PH以及氨基酸在多肽一级序列内的位置。在特定pH下，所述正和负电荷被平衡，净电荷将为零。这种pH称为等电点，在等电点处蛋白质具有其最低溶解度。更优选地，氨基酸或带电荷的氨基酸选自甘氨酸、精氨酸、赖氨酸、组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸以及它们的盐。组氨酸、谷氨酸盐、精氨酸或其盐是特别优选的。在一些实施方案中，将前述氨基酸或它们的盐的组合应用于本发明的制剂中。在其它实施方案中，所述氨基酸为精氨酸、赖氨酸或组氨酸的类似物，所述类似物保持优选在PH6. O或更高下增强CD-RAP溶解度的能力。这种类似物包括、但不限于含有精氨酸、赖氨酸或组氨酸的二肽和三肽。在其它优选实施方案中，所述氨基酸盐为精氨酸盐酸盐(优选在pH 6. O至8. O、更优选在pH 6. 5至7. 5、最优选在pH 6. O或7. 4的溶液中)、精氨酸磷酸盐(优选在pH 6. O至
8.O、更优选在pH 6. 5至7. 5、最优选在pH 6. O或7. 4的溶液中)、组氨酸磷酸盐(优选在pH6. O至8. O、更优选在pH 6. 5至7. 5、最优选在pH 6. O或7. 4的溶液中)、组氨酸盐酸盐(优选在pH 6. O至8. O、更优选在pH 6. 5至7. 5、最优选在pH 6. O或7. 4的溶液中)、谷氨酸钾和谷氨酸钠(优选在PH 6. O至8. O、更优选在pH 6. 5至7. 5、最优选在pH 6. O或7. 4的溶液中)。应用于本发明的氨基酸以及它们的盐为本领域熟知的，通过已知方法制造且可从商业供应商得到。
带电荷的氨基酸、其盐或任何特定氨基酸例如甘氨酸、精氨酸、赖氨酸、组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸以及它们的盐在所述制剂中的浓度优选为约O. 5% (w/v)至约8% (w/v), 1%(w/v)至约 8% (w/v) > 1% (w/v)至约 5% (w/v)、I. 5% (w/v)至约 5% (w/v) >2. % (w/v)至约5% (w/v) >0. 5% (w/v)至约3% (w/v)、更优选约I. 0% (w/v)至约3% (w/v)、甚至更优选约I. 5% (w/v)至约3% (w/v)、甚至进一步优选2. 0% (w/v)至约3% (w/v)、以及特别优选约2. 5% (w/v)。可从商业供应商得到所述带电荷的氨基酸。除了如本文描述的⑶-RAP多肽之外，通过将在约6至8的pH下具有净电荷的氨基酸组合在例如水性溶液中来制备本发明的制剂。此外,可以根据需要加入缓冲剂、张力调节剂(tonicity modifier)和/或稳定剂以及任选的另外的赋形剂。本领域普通技术人员将会理解，可以以任何合适的顺序组合要被包括在所述制剂中的各种组分。例如，可以首先、中间或最后加入缓冲剂，或者还可以首先、中间或最后加入张力调节剂。还将会被本领域普通技术人员理解的是，这些化学品中的一些可能在某些组合中不相容，因此，容易地用具有类似特定但在相关混 合物中相容的不同化学品进行替代。在本发明的优选实施方案中，选择包含在本发明的制剂中的氨基酸和其它成分(例如可被包含在所述制剂中的缓冲剂、张力调节剂、稳定剂、赋形剂)中的任何一种，使得其提供⑶-RAP蛋白经过重复冻/融循环(优选经过5个冻/融循环(5° C至-25° C，冷却和加热速率I. O ° C/min,其中各循环之间的等温步骤为15 min))的稳定性。在本发明的优选方面，所述制剂包含缓冲剂。如本文所用的术语“缓冲剂”包括将PH维持在所需范围内的那些试剂。缓冲剂为由弱酸及其缀合的碱或者由弱碱及其缀合的酸组成的水性溶液。其具有下述特定当加入少量强酸或碱时，所述溶液的PH变化非常小。在多种化学应用中，缓冲溶液用作将PH保持在接近恒定的数值的方式。缓冲溶液用于维持PH量级的某个水平。通常而言，当缓冲剂应用于本发明的制剂中时，其优选使CD-RAP蛋白稳定。当本文使用时，“氨基酸缓冲剂”包括例如氨基酸碱，例如精氨酸及其缀合的盐。氨基酸缓冲剂的实例为精氨酸/精氨酸盐酸盐、精氨酸/精氨酸磷酸盐、组氨酸/组氨酸盐酸盐、组氨酸/组氨酸磷酸盐、谷氨酸/谷氨酸钠或谷氨酸钾。优选将这些实例应用于本发明。如本文描述的制剂的优选pH可选择下述范围约4至约10，约5至约9，优选约6至约8。因此，优选使用可以将溶液维持在pH 6.0至8.0的缓冲剂。当用于pH值/范围的上下文中时，术语“约”优选表示具有围绕所述数值的+/_ 25%的范围的数值。当将药物组合物的PH设定在生理水平或附近时，使给药后患者的舒适情况最大化。一般而言，缓冲剂的性质和/或氨基酸及其浓度为使得所述制剂的重量渗克分子浓度为280 - 320 mosmol/kg。具体而言，优选的是，pH在pH约5. 8至8. 4的范围内，约
6.2至7. 4为优选的，更优选pH为pH 5. 8至8. 4，最优选6. 2至7. 4，然而应该理解，可以根据需要调节PH，以使具体制剂中的多肽的稳定性和溶解度最大化，并因此，生理范围之外、但优选患者仍耐受的PH在本发明的范围内。可用于本文描述的制剂中的缓冲剂的非限制性实例包括，组氨酸、琥珀酸盐、葡萄酸盐、柠檬酸盐、三(氨基丁三醇)、Bis-Tris、MOPS、ACES、TES、HEPES、EPPS、乙二胺、磷酸、马来酸/磷酸盐、柠檬酸盐、2-吗啉乙磺酸(MES)、磷酸钠、乙酸钠和二乙醇胺。
优选缓冲剂为磷酸盐缓冲剂、Tris缓冲剂、氨基酸缓冲剂，例如但不限于精氨酸、组氨酸和谷氨酸盐缓冲剂。更优选地，将下述缓冲剂应用于本发明的制剂中精氨酸磷酸盐(优选pH 6. O至8. O、更优选pH 6. 5至7. 5、最优选pH 6. O或7. 4 )、组氨酸磷酸盐(优选pH 6. O至8. O、更优选pH 6. 5至7. 5、最优选pH 6. O或7. 4)、组氨酸盐酸盐(优选pH 6.0至8. O、更优选pH 6. 5至7. 5、最优选pH 6. O或7. 4)。应用于本发明的缓冲剂为本领域熟知的，通过已知方法制造且可从商业供应商得到。氨基酸、其盐、甘氨酸、精氨酸、赖氨酸、组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸以及它们的盐、缓冲剂(例如但不限于Tris缓冲剂、组氨酸缓冲剂、精氨酸磷酸盐缓冲剂和磷酸盐缓冲剂)在本发明的组合物中的浓度可以选自下述范围约I至约500 mM、约I至约450 mM、约I至约400 mM、约I至约350 mM、约I至约300 mM、约I至约250 mM、约I至约200 mM、约I至约150 mM、约I至约100 mM、约I至约50 mM、约I至约40 mM、约I至约30 mM、约I至约20mM、约 I 至约 10 mM、约 10 至约 500 mM、10 至约 450 mM、10 至约 400 mM、10 至约 350 mM、10至约 300 mM、10 至约 250 mM、10 至约 200 mM、10 至约 150 mM、约 30 至约 500 mM、30 至约450 mM、30 至约 400 mM、30 至约 350 mM、30 至约 300 mM、30 至约 250 mM、30 至约 200 mM、或30至约150 mM。对于Tris缓冲剂，最优选的浓度为30至100 mM ;对于组氨酸缓冲剂，优选浓度为45至60 mM或250至350 mM,最优选50 mM至300 mM ;对于磷酸盐缓冲剂，优选浓度为45至60 mM;对于精氨酸缓冲剂，优选浓度为250至380 mM ;对于谷氨酸盐缓冲剂，优选浓度为250 至 360 mM，最优选 280 至 360 mM。在本发明的优选方面，所述制剂包含张力调节剂。如本文所用，术语“张力调节剂”旨在表示可以用于调节液体制剂的张力的化合物。适合的张力调节剂包括甘油、乳糖、甘露醇、葡萄糖、氯化钠、硫酸镁、氯化锰、氯化钾、硫酸钠、山梨糖醇、海藻糖、蔗糖、棉籽糖、麦芽糖和本领域普通技术人员已知的那些。在一个实施方案中，液体制剂的张力近似血液或血浆的张力。张力调节剂有助于组合物的重量渗克分子浓度。人血清的重量渗克分子浓度为约250-350 mOsM/kg。为了维持蛋白质稳定性和使患者的不舒适性最小化，通常优选的是，所述制剂为等渗的，即，具有与人血清或或滑液大致相等的重量渗克分子浓度。因此，所述组合物的重量渗克分子浓度优选为180至420 mOsM/kg,更优选280至320 mOsM/kg。在此范围内最理想的重量渗克分子浓度即等渗。术语“等渗的”表示，目标制剂具有与人血液基本上相同的渗透压。等渗制剂通常具有约270-328 mOsM的渗透压。稍低张力的渗透压为250-269，稍高张力的渗透压为328-350 mOsm。例如可以使用蒸气压或冰冻型渗透压计测量渗透压。然而，本领域技术人员将会理解，根据所需具体条件，组合物的重量渗克分子浓度可以更高或更低。本领域已知多种张力调节剂(参见，例如美国专利申请2003/0180287的段)。所述制剂的其它组分，包括、但不限于盐(例如，氯化钠、氯化钾和柠檬酸钠)、缓冲剂、二糖(例如，蔗糖、葡萄糖和甘露醇)、增量剂、和表面活性剂，也可有助于所述组合物的重量渗克分子浓度。张力调节剂在所述制剂中的浓度优选为约I mM至1000 mM、更优选约10 mM至约200 mM。应用于本发明的制剂中的优选张力调节剂为氯化钾或氯化钠，优选浓度为小于150 mM、小于100 mM、小于80 mM、小于50 mM、浓度为10至50 mM、40至90 mM、40 至 120 mM、50 至 120 mM、50 至 150 mM、80 至 150 mM、80 至 120 mM、40 至 45 mM、80 至 90mMUOO 至 150 mMUOO 至 120 mM,42. 5 mM,89. 5 mMU16. 5 mM 或 150 mM。在一些实施方案中，所述制剂还包含氯化钠(NaCl)。在具体实施方案中，所述制剂包含1-200 mM、或小于50 mM、小于40 mM、小于35 mM、小于30 mM、小于25 mM、小于20 mM、小于15 mM、小于10 mM、或小于5 mM NaCl。在某些条件下，NaCl可造成冻干期间出现困难或导致在重构的冻干物中出现乳白色物。因此，在较不优选的实施方案中，所述制剂不包含NaCl。除了所述⑶-RAP蛋白，如本文描述的制剂还可含有其它物质。这些物质包括、但不限于，稳定试剂(稳定剂)。因此，在优选方面，所述制剂包含稳定剂。术语“稳定试剂”是指改善或者说是增强所述制剂、特别是CD-RAP蛋白的稳定性的试剂。稳定试剂可以为二糖、糖醇、金属螯合剂或金属螯合剂的组合、自由基清除剂或它们的组合。·优选地，用作稳定试剂的二糖可以为非还原糖，例如蔗糖、海藻糖或甘露醇。在某些实施方案中，二糖在所述组合物中的浓度选自下述范围0. 5至5%、0. 5至4%、0. 5至3%、O. 5 至 2. 5%、0· 5 至 2%、0· 5 至 I. 5%、0· 5 至 I %、I 至 I. 5%、I. 5 至 2%、2 至 2. 5%、2· 5 至 3%、3至4%、4至5%或超过5% (w/v)。在具体实施方案中，二糖在所述组合物中的浓度为约O. 5至5%，例如约O. 5至2. 0% (w/v)。应用于本发明的制剂中的优选稳定剂为蔗糖(优选为5. 0%)或甘露醇(优选为5. 0% (w/v))。所述稳定试剂还可以为糖醇，例如乙二醇、甘油、赤藓醇、苏糖醇、阿拉伯糖醇、木糖醇、核糖醇、甘露醇、山梨糖醇、卫矛醇、艾杜糖醇、异麦芽、麦芽糖醇、乳糖醇或氢化葡萄糖(polyglycitol)。另一种稳定剂可以为金属螯合剂或金属螯合剂的组合。在具体实施方案中，所述金属螯合剂为DTPA、EGTA和DEF。在一些实施方案中，DTPA或EGTA在所述蛋白质制剂中的浓度为约I μ M至约10 mM、约I μΜ至约5mM、约10 μΜ至约10mM、50 μΜ至约5mM、或约75 μΜ至约2.5mM。在一些实施方案中，DEF在所述蛋白质制剂中的浓度为约I μΜ至约10 mM、约I μ M至约5 mM、约10 μ M至约I mM、或约20 μ M至约250 μ Μ。所述稳定剂还可以为自由基清除剂，特别是氧自由基的清除剂。在具体实施方案中，所述自由基清除剂为甘露醇或组氨酸。在一些实施方案中，甘露醇在所述蛋白质制剂中的浓度为约0. 01%至约5%、约0. 1%至约5%、约0. 5%至约5%、或约1%至约5%。在其它实施方案中，减少蛋白质在所述制剂中的聚集的试剂为金属螯合剂和自由基清除剂的组合。在一些实施方案中，减少蛋白质在所述制剂中的聚集的试剂为柠檬酸盐。在某些实施方案中，柠檬酸盐在所述蛋白质制剂中的浓度为约0.5 mM至约50 mM、约0. 5 mM至约25 mM、约I mM至约35 mM、约5 mM至约25 mM、或约5 mM至约10 mM。在优选实施方案中，本文描述的制剂包含赋形剂。优选地，所述赋形剂选自冷冻保护剂、冻干保护剂、表面活性剂、增量剂、抗氧化剂以及它们的组合。可以将赋形剂加入到本发明的制剂中，所述赋形剂也被称为化学添加剂、共溶质、或共溶剂，其优选使CD-RAP多肽在溶液中(还以干燥或冷冻形式)稳定。优选地，赋形剂有助于所述CD-RAP蛋白的稳定性，但是应该理解的是，赋形剂另外可以有助于所述制剂的物理、化学、和生物特性。赋形剂为本领域熟知的，通过已知方法制造且可从商业供应商得到。赋形剂的实例包括但不限于糖/多元醇，例如蔗糖、乳糖、甘油、木糖醇、山梨糖醇、甘露醇、麦芽糖、肌醇、海藻糖、葡萄糖；聚合物，例如血清白蛋白(牛血清白蛋白(BSA)、人SA或重组HA)、葡聚糖、PVA、羟丙基甲基纤维素(HPMC)、聚乙烯亚胺、明胶、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、羟乙基纤维素(HEC)、羟乙基淀粉(HES);非水性溶剂，例如多元醇(例如，PEG、乙二醇和甘油)、二甲基亚砜(DMSO)和二甲基甲酰胺(DMF);氨基酸，例如脯氨酸、L-丝氨酸、谷氨酸钠、丙氨酸、甘氨酸、盐酸赖氨酸、肌氨酸和Y-氨基丁酸；表面活性剂，例如Tween-80、Tween-20、SDS、聚山梨醇酯、聚氧乙烯共聚物；和各种赋形剂,例如磷酸钾、乙酸钠、硫酸铵、硫酸镁、硫酸钠、三甲基胺N-氧化物、甜菜碱、金属离子(例如，锌、铜、钙、锰、和镁)、CHAPS、单月桂酸盐、2-0-β-单甘油酸盐或上述的任何组合。在某些实施方案中，表面活性剂在所述制剂中的浓度为O. 001至5. 0%、0· 001至2. 5%、0· 001至1%、0· 001至O. 5%、0· 001 至 O. 2%、0· 001 至 O. 1%、0· 001 至 O. 05%、O. 001 至 O. 01%、或 O. 001 至 O. 005%/重量。“冷冻保护剂”包括给冷冻的蛋白质提供生产、冷冻、储存、操作、分配、重构、或使用期间的稳定性的物质。在特定方面，“冷冻保护剂”包括保护蛋白质免于由冷冻过程导致的应力影响的物质。冷冻保护剂可以具有冻干保护剂作用。冷冻保护剂的非限制性实例包括糖，例如蔗糖、葡萄糖、海藻糖、甘露醇、甘露醇、和乳糖；聚合物，例如葡聚糖、羟乙基淀粉和聚乙二醇；表面活性剂，例如聚山梨醇酯(例如，PS-20或PS-80);和氨基酸，例如甘氨酸、精氨酸、亮氨酸、和丝氨酸。通常使用在生物体系中显示具有低毒性的冷冻保护剂。加入冷冻保护剂(如果被包括在所述制剂中的话)至约1%至约10% (w/v)的终浓度，优选至下述终浓度:0· 5 至 8% (w/V)、0· 5 至 6% (w/V)、0· 5 至 8% (w/ν)、0· 5 至 5% (w/v)、I 至 8% (w/v)、I 至 6% (w/v)、I 至 8% (w/v)、I 至 5% (w/v)、I. 5 至 8% (w/v)、I. 5 至 6% (w/v)、I. 5 至 8%(w/v)、I. 5 至 5% (w/v)、2 至 8% (w/v)、2 至 6% (w/v)、2 至 8% (w/v)、2 至 5. 5% (w/v)。如本文描述的二糖可以起冻干保护剂或冷冻保护剂的作用。“冻干保护剂”包括预防或减少蛋白质冻干和后续储存后的化学或物理不稳定性的物质。在一个方面，随着在干燥过程中从组合物中去除水，所述冻干保护剂预防或减少蛋白质的化学或物理不稳定性。在其它方面，所述冻干保护剂通过经氢键帮助维持蛋白质的适当构象来使蛋白质稳定。因此，在一个方面，如本文描述的二糖可以用于使所述CD-RAP蛋白在冷冻期间稳 定。因为冷冻期间的保护可取决于所述二糖的绝对浓度(Carpenter等人，Pharm. Res.(1997)，14:969-975)，因此大于5%的浓度可能是使稳定性最大化所必需的。在一个方面，所述二糖使CD-RAP蛋白在干燥期间稳定。干燥期间的保护可以取决于所述二糖和蛋白质之间的最终质量比。Carpenter等人，Pharmaceutical Research14:969-975 (1997)。因此，在一些实施方案中，选择二糖的浓度以实现二糖与蛋白质的所需质量比，通常为至少I: I。在一些实施方案中，二糖蛋白质的质量比为约5:1使稳定性为最优的。在其它实施方案中，二糖蛋白质的质量比为10:1、20:1、30:1、40:1、50:1、100:1、200:1、300:1、400:1、500:1、600:1、700:1、800:1、900:1、1000:1、或大于 1000:1。在一个实施方案中，将冻干保护剂加入到本文描述的制剂中。如本文所用的术语“冻干保护剂”包括给蛋白质提供冷冻-干燥或脱水过程中的稳定性的试剂(第一和第二冷冻-干燥循环)，其通常提供无定形玻璃基质和通过氢键结合蛋白质、替代在干燥过程中去除的水分子。这帮助维持蛋白质构象、使冻干循环期间的蛋白质降解最小化、和改善长期产品稳定性。以“冻干保护量”将冻干保护剂加入到预冻干制剂中，所述“冻干保护量”表示，在冻干保护量的冻干保护剂存在下冻干所述CD-RAP蛋白之后，所述蛋白质在冻干和储存后基本上保持其物理和化学稳定性以及完整性。冻干保护剂的非限制性实例包括糖，例如蔗糖或海藻糖；氨基酸，例如谷氨酸一钠、甘氨酸或组氨酸；甲基胺，例如甜菜碱；易溶盐，例如硫酸镁；多元醇，例如三元或更高糖醇，例如阿拉伯糖醇、木糖醇、山梨糖醇、和甘露醇；聚乙二醇；普流罗尼(pluixmics)以及它们的组合。加入到制剂中的冻干保护剂的量通常为这样的量当冻干所述蛋白质制剂时，所述量不会导致蛋白质的不可接受量的降解/聚集。在所述冻干保护剂为糖(例如蔗糖或海藻糖)并且所述蛋白质为抗体的情况下，蛋白质制剂中冻干保护剂浓度的非限制性实例为约10 mM至约400 mM、优选为约30 mM至约300 mM、最优选为约50 mM至约100 mM。 在某些实施方案中，表面活性剂可以被包括在所述制剂中。另一种优选赋形剂为表面活性剂。术语“表面活性剂”通常包括保护所述⑶-RAP蛋白免于空气/溶液界面导致的应力和溶液/表面导致的应力影响的那些试剂。例如表面活性剂可以保护所述蛋白质免于聚集。表面活性剂的实例包括、但不限于,非离子表面活性剂,例如聚山梨醇酯(例如,聚山梨醇酯80或聚山梨醇酯20);帕洛沙姆(例如，帕洛沙姆188) ;Triton、十二烷基硫酸钠(SDS ;月桂基硫酸钠、葡萄糖苷辛基钠；月桂基磺基甜菜碱、肉豆蘧基-磺基甜菜碱、亚油基-磺基甜菜碱、硬脂基-磺基甜菜碱、月桂基-肌氨酸、肉豆蘧基-肌氨酸、亚油基-肌氨酸、硬脂基-肌氨酸、亚油基-甜菜碱、肉豆蘧基-甜菜碱、十四烷基-甜菜碱、月桂酰胺丙基-甜菜碱、椰油酰胺丙基-甜菜碱、亚油酰胺丙基-甜菜碱、肉豆蘧酰胺丙基-甜菜碱、棕榈酰胺丙基-甜菜碱、异硬脂酰胺丙基-甜菜碱(例如，月桂酰胺丙基)、肉豆蘧酰胺丙基-二甲基胺、棕榈酰胺丙基-二甲基胺、或异硬脂酰胺丙基-二甲基胺；甲基椰油酰基牛磺酸钠、或甲基油基牛横酸二钠；以及 Monaquat 系列(Mona Industries, Inc. , Paterson, NJ.)、聚乙二醇、聚丙二醇、和乙二醇和丙二醇的共聚物(例如，普流罗尼、PF68)。加入的表面活性剂的量使得具有以下效果其将重构蛋白质的聚集维持在可接受的水平(如使用例如用于测定高分子量(HMW)物质或低分子量(LMW)物质百分比的SEC-HPLC进行测定)，并且使本文描述的蛋白质制剂的冻干物重构后颗粒形成最小化。例如，存在于制剂(液体的，或冻干物重构之前)中的表面活性剂的量可以为约O. 001至约O. 5%，例如约O. 05至约O. 3%。应用于本发明的制剂中的优选表面活性剂为聚山梨醇酯20或80。其它优选的赋形剂可以为增量剂。即，在本发明的一个方面，预见到本发明的制剂以大批量制剂制备，由此调节所述药物组合物的组分，以使得其高于给药所需，并且在给药之前适当地进行稀释。如本文所用的术语“增量剂”包括提供冷冻-干燥产品的结构而不与药物产品直接反应的试剂。除了提供药学精致饼剂之外，增量剂还可以赋予关于下述方面的有用质量改变塌缩温度，提供冻融保护，和增强经长期储存的蛋白质稳定性。增量剂的非限制性实例包括甘露醇、甘氨酸、乳糖、和蔗糖，增量剂可以为晶体的(例如甘氨酸、甘露醇、或氯化钠)或无定形的(例如葡聚糖、羟乙基淀粉)，并且通常以O. 5%至10%的量用于蛋白质制剂中。优选地，应用于本发明的制剂中的增量剂促进形成美学上可接受的、均一的或机械上强的饼剂。增量剂还优选促进形成开孔结构，并促进重构的容易性和速度。增量剂同样优选减少或防止饼剂塌缩、共晶熔化或保持残留水分。另一方面，增量剂优选帮助保护所述CD-RAP蛋白免于应力(例如物理和化学应力)影响，并且帮助维持蛋白质活性。在某些实施方案中，增量剂在所述组合物中的浓度选自下述范围1至10%、I至8%、I 至 5%、2 至 8%、2 至 6%、2，5 至 6%、0· 5 至 1%、I 至 I. 5%、I. 5 至 2%、2 至 2. 5%、2· 5 至 3%、3 至 3. 5%、3· 5 至 4%、4 至 4. 5%、4· 5 至 5%、超过 5%、0· 5 至 5%、0· 5 至 4%、0· 5 至 3%、0· 5 至
2.5%、0. 5至2%、0. 5至I. 5%、或O. 5至1%。在某些实施方案中，增量剂在所述组合物中的浓度为O. 5至5%，例如O. 5至3%，甚至更精确地为I. 8至2%。另一种优选的赋形剂可以为抗氧化剂。如本文所用，“抗氧化剂”为能够减慢或预防其它分子氧化的分子。氧化为将电子从某物质转移至氧化试剂的化学反应。对于用于本发明的方法，生理上可接受的抗氧化剂是感兴趣的。此类抗氧化剂包括、但不限于，还原剂、抗坏血酸(维生素C)、硫辛酸、褪黑激素、尿酸、胡萝卜素、视黄醇、生育酚和生育三烯酸例如α -生育酚(维生素Ε)、泛醌(辅酶Q)等。 在一些实施方案中，所述制剂可以任选地含有防腐剂。“防腐剂”为可以加入到本文的制剂中以减少细菌活性的化合物。加入防腐剂可以例如有利于生产多用途(多剂)制齐U。可能的防腐剂的实例包括十八烷基二甲基苄基氯化铵、氯化六烃季铵、苯扎氯铵(烷基苄基二甲基氯化铵的混合物，其中烷基为长链化合物)、和苄索氯铵。其它类型的防腐剂包括芳族醇，例如酚、丁基和苄基醇、对羟基苯甲酸烷基酯例如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯、儿茶酚、间苯二酚、环己醇、3-戊醇、和间甲酚。本文最优选的防腐剂为苄基醇。所附实施例(参见实施例3和4)证明(还参见图6、7、10和11)，所测试制剂(除50mM磷酸钾/5%蔗糖和150 mM甘氨酸pH 6. O中的⑶-RAP之外)的冷冻融化循环对蛋白质稳定性没有影响。在后一情况下，可见第三次冻/融循环后CD-RAP的浓度显著降低。然而，在全部其它制剂中，在每一个冷冻循环之后溶液为澄清的。与通过UV/Vis对rhCD-RAP进行定量的结果相组合，这解决了本发明的问题，从而得到高浓度rhCD-RAP的适合条件。因此，在更优选的实施方案中，本发明的制剂为液体的、优选水性的制剂，所述制剂包含至少5、10、15、20、25或30 mg/mL⑶-RAP和缓冲剂以及氨基酸，所述缓冲剂选自磷酸钾或磷酸钠、TRIS、组氨酸、精氨酸和谷氨酸盐缓冲剂，所述氨基酸选自天冬酸盐、谷氨酸盐(优选谷氨酸盐磷酸盐)、精氨酸(优选精氨酸磷酸盐或精氨酸盐酸盐)、组氨酸(优选组氨酸盐酸盐或组氨酸磷酸盐)、赖氨酸和甘氨酸。优选地，存在于所述制剂中的谷氨酸盐、天冬酸盐、精氨酸、组氨酸、赖氨酸和甘氨酸的量为2. 5% (w/v)。优选地，选择所述缓冲剂和所述氨基酸以使得它们给所述CD-RAP蛋白提供经过5个冻/融循环(5° C至-25° C，冷却和加热速率I. O ° C/min，其中各循环之间的等温步骤为15 min)的稳定性。因此，在具体优选实施方案中，本发明的制剂为液体的、优选水性的制剂，所述制剂包含至少30 mg/mL CD-RAP和50 mM TRIS氯化物以及2. 5%谷氨酸盐；50 mM组氨酸和2. 5% (w/v)甘氨酸、2. 5% (w/v)谷氨酸盐(w/v)或2. 5%赖氨酸(w/v) ；300 mM组氨酸盐酸盐pH 6.0 ;50、100、200或300 mM组氨酸磷酸盐pH 6.0 ；350 mM精氨酸盐酸盐pH 6.0 ；350mM精氨酸磷酸盐pH 6. O ；350 mM精氨酸磷酸盐pH 7. 4;或300 mM谷氨酸钾pH 6. O。这些制剂可以任选地包含如本文描述的稳定剂、张力调节剂和/或赋形剂。应该理解的是，所述组合物中的某些组分可以与本领域已知的备选物互换。然而，本领域技术人员将会理解，加入某些组分会排除其它组分、浓度、或制剂制备方法的使用，其原因包括、但不限于，化学相容性、pH、张力、和稳定性。如本文所述，此应用通常涉及下述发现将带电荷的氨基酸加入到制剂中可以减少高浓度CD-RAP蛋白在制剂中的聚集。无论造成高浓度CD-RAP蛋白在制剂中聚集的原因如何，加入如本文描述的带电荷的氨基酸或带电荷的氨基酸的组合，减少CD-RAP蛋白在所述制剂中的聚集。在某些实施方案中，加入带电荷的氨基酸减少由例如储存、暴露于高温、暴露于光、暴露于剪切应力、存在表面活性剤、PH和离子条件以及它们的组合导致的制剂中的聚集。由本发明人发现的此方法可以用于减少配制的CD-RAP蛋白(尤其以液体形式)的聚集。因而优选在液体制剂中观察到聚集減少。估计，当直接以液体形式储存以用于之后使用、以冷冻状态储存并在使用之前融化、或以干燥形式(例如冻干的、风干的、或喷雾-干燥形式)制备以之后重构成液体形式或其它形式然后使用吋，也可以观察到聚集減少。
因而，预见到可以通过本领域技术人员已知的任何方法储存本文描述的制剂。非限制性实例包括冷冻、冻干、和喷雾干燥所述制剂。在一些情况下，所述蛋白质制剂为冷冻的以进行储存。因此，理想的是，所述制剂在此类条件下、包括在冻融循环下为相对稳定的。确定制剂的合适性的ー种方法为，将样品制剂进行至少2个、例如3至10个冷冻和融化循环(例如通过在室温下快速融化或在冰上缓慢融化)，測定在冻融循环之后累积的低分子量(LMW)物质和/或高分子量(HMW)物质的量，然后将其与在冻融程序之前样品中存在的LMW物质或HMW物质的量进行比较。LMW或HMW物质的增加指示作为所述制剂的一部分储存的蛋白质的稳定性降低。可以将尺寸排阻高效液相色谱(SEC-HPLC)用于测定LMW和HMW物质的存在。在一些情况下，所述蛋白质制剂可以作为液体储存。因此，如本文描述的，理想的是所述液体制剂在此类条件下、包括在各种温度下为稳定的。例如，确定制剂的合适性的一种方法为将所述样品制剂储存于若干温度(例如2-8、15、20、25、30、35、40、和50° C)下，然后检测随时间变化累积的HMW和/或LMW物质的量。随时间变化累积的HMW和/或LMW物质的量越少，用于所述制剂的储存条件越好。另外，可以通过阳离子交換-高效液相色谱(CEX-HPLC)检测所述蛋白质的电荷情況。或者，可以在冻干之后储存制剂。术语“冻干的”或“冷冻-干燥的”包括已进行干燥程序例如冻干的物质的状态，其中已去除至少90%、优选95%、最优选98%的水分。因此，如本文所用的术语“冻干”是指这样的过程通过所述过程，首先冷冻要被干燥的物质，然后通过在真空环境下升华去除冰冻或冷冻的溶剤。可以将赋形剂(例如，冻干保护剂)包括在要被冻干的制剂，从而增强冻干产品经储存的稳定性。如本文所用的术语“重构的制剂”是指通过下述方式制备的制剂在稀释剂中溶解冻干的蛋白质制剂以使得蛋白质分散在所述稀释剂中。如本文所用的术语“稀释剂”为药学上可接受的(对于施用给人而言安全且无毒的)且可用于制备液体制剂的物质，所述液体制剂例如冻干之后重构的制剂。稀释剂的非限制性实例包括无菌水、抑菌性注射用水(BWFI)、pH缓冲溶液(例如，磷酸盐缓冲盐水)、无菌盐水溶液、林格氏溶液、葡萄糖溶液、或盐和/或缓冲剂的水性溶液。针对制剂测试所述制剂的蛋白质组分在冻干之后的稳定性，可用于确定制剂的适合性。所述方法类似于上文针对冷冻描述的方法，不同之处在于所述样品制剂为冻干的，而非冷冻的，使用稀释剂重构，然后测试重构制剂的LMW物质和/或HMW物质的存在。相比于未冻干的对应样品制剂，LMW或HMW物质在冻干样品中的増加指示所述冻干样品的稳定性下降。在一些情况下，将制剂喷雾-干燥，然后储存。对于喷雾-干燥，在干燥气体流的存在下将液体制剂烟雾化。将水从制剂小滴中去除到气流中，从而得到药物制剂的干燥颗粒。所述制剂中可以包括赋形剂，以(i)在喷雾-干燥脱水期间保护蛋白质，(ii)在喷雾-干燥之后的储存期间保护蛋白质，和/或iii)孵育适于烟雾化的溶液特性。所述方法类似于上文针对冷冻描述的方法，不同之处在于所述样品制剂为喷雾-干燥的，而非冷冻的，在稀释剂中重构，然后测试重构制剂的LMW物质和/或HMW物质的存在。相比于未冻干的对应样品制剂，LMW或HMW物质在喷雾-干燥样品中的増加指示所述喷雾-干燥样品的稳定性下降。 通常通过加入水性溶液以溶解冻干制剂，而重构所述冻干制剂以进行使用。可以将多种水性溶液用于重构冻干制剂。优选地，使用水来重构冻干制剂。优选用基本上由水组成的溶液(例如，USP WFI、或注射用水(WFI))或抑菌水(例如，具有0.9%苄基醇的USP WFI)来重构冻干制剂。然而，还可以使用包含缓冲剂和/或赋形剂和/或一种或多种药学上可接受的载体的溶液。通常由液体制备冷冻-干燥制剂或冻干制剂，所述液体为溶液、悬浮液、乳液等。因而，要进行冷冻-干燥或冻干的液体优选包含最后重构液体制剂中期望的全部组分。因此，当重构时，所述冷冻-干燥制剂或冻干制剂将经重构后得到期望的液体制剂。在本发明的另一方面，预见到所述制剂用于治疗。因此，本发明预见到包含本文描述的制剂的药物组合物(或药物)。在另ー个实施方案中，本发明提供了治疗受试者的方法，所述方法包括施用治疗有效量的本文描述的制剂，其中所述受试者具有可以有益地用CD-RAP多肽进行治疗的疾病或障碍。优选地，在预防和/或治疗可以用CD-RAP预防和/或治疗的疾病时应用本文描述的制剂。术语“受试者”预期包括活生物体。受试者的实例包括哺乳动物，例如，人、狗、牛、马、猪、绵羊，山羊、猫、小鼠，兔、大鼠、转基因非人动物。在本发明的优选实施方案中，所述受试者为人。术语“有效剂量”定义为足以实现或至少部分实现所需效果的量。术语“治疗有效剂量”定义为足以治愈或至少部分制止已经患有疾病的受试者的所述疾病及其并发症。有效用于此用途的量将取决于感染的严重性和受试者自身免疫系统的一般状态。术语“患者”包括接受预防性或治疗性处理的人和其它哺乳动物受试者。所述制剂的合适剂量或治疗有效量将取决于要治疗的病症、病症的严重性、之前的治疗、和患者的临床史以及对于治疗试剂的反应。可以根据临床医师的判断调节合适的剂量，以使得可以一次或经过一系列给药将所述合适的剂量施用给患者。可以作为唯一的治疗剂或者根据需要与另外的疗法组合，将所述药物组合物进行给药。本发明的药物组合物特别可用于肠胃外给药，S卩，皮下地、肌肉内地、静脉内地、关节内地和/或滑膜内地给药。肠胃外给药可以通过弾丸注射或连续输注。在优选实施方案中，所述注射为局部或全身注射，优选地进入滑膜、滑膜空间、滑液、或进入优选膝、肩、髋、拇指、颞颌关节或小关节的滑膜关节、软骨下区、骨软骨缺损、关节内空间，纤维环、髓核、髓核空间，间盘内地或间盘间地。更优选地，所述注射为关节内注射，优选进入膝、肩、髋、拇指、颞颌关节或小关节。更优选地，所述关节内注射为关节内注射进入小关节或颞颌关节的滑液中。进ー步优选的注射为进入滑膜下室或区域的注射，或者为进入软骨或骨软骨缺损的注射。还涵盖了在用膜闭合缺损之前或之后进入软骨或骨软骨缺损的注射。所述膜可以为、但不限于骨膜或胶原膜。在另ー个优选实施方案中，所述膜为包含I型胶原、III型胶原、猪或大鼠I型或III型胶原、透明质酸或其衍生物的膜。在注射所述制剂之前闭合该缺损的优点在于减少所述制剂的稀释，或提高所述制剂的活性成分的局部浓度。所述膜进一歩起用于附着细胞的生物粘合剂的作用。如果所述蛋白质制剂已被冻干，在给药之前，首先将冻干物质在合适的液体中重构。冻干物质可以在例如抑菌性注射用水(BWFI)、生理盐水、磷酸盐缓冲盐水(PBS)、水性溶液、或所述蛋白质在冻干之前所在的相同制剂中重构。用于注射的药物组合物可以以添加有防腐剂的单位剂型存在，例如在安瓿或多 剂量容器中。此外，已经开发了多种新药物递送方法，本发明的药物组合物适于使用这些新方法给药，所述新方法例如Inject-ease、Genject、注射笔例如Genen和无针装置例如MediJector和Biojector。本发明的药物组合物还可以适于尚未发现的给药方法。还參见Langer, 1990, Science, 249: 1527-1533。所述药物组合物还可以配制为储库制备物(depot preparation)。此类长效制剂可以通过植入(例如皮下地、进入韧带或腱、滑膜下地或肌肉内地)、通过滑膜下注射或通过肌肉内注射施用。因而，例如，所述制剂可以用适合的聚合物或疏水物质改性(例如作为在可接受的油中的乳液)或用离子交换树脂改性或作为难溶衍生物，例如难溶盐。所述药物组合物还可以为多种常规储库形式，采用所述形式给药以提供活性组合物。这些包括，例如，固体、半固体和液体剂型，例如液体溶液或悬浮液、浆剂、凝胶、霜剂、油剂、乳液、洗液、粉末、喷剂、泡沫、糊剂、膏剂、油膏、软膏剂和滴剂。如果需要，所述药物组合物可以存在于小瓶、包装或分配装置中，所述小瓶、包装或分配装置可含有ー个或多个含活性成分的单位剂型中。在一个实施方案中，所述分配装置可以包括具有准备用于注射的单个剂量的液体制剂的注射器。所述注射器可以伴有给药说明。所述药物组合物还可以包含其它药学上可接受的组分。其它药学上可接受的载体、赋形剂、或稳定剂，例如描述于Remington 的Pharmaceutical Sciences 16th edition,Osol, A. Ed. (1980)中的那些，也可以被包括在本文描述的蛋白质制剂中，条件是它们不会不利地影响所述制剂的所需特性。如本文所用“药学上可接受的载体”表示与药物给药相容的任何和全部溶剂、分散介质、包衣剂、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂。用于药物活性物质的此类介质和试剂的使用是本领域熟知的。在采用的剂量和浓度下的可接受的载体、赋形剂、或稳定剂对受体是无毒的，并且包括另外的缓冲剂、防腐剂；共溶剂；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；螯合剂，例如EDTA ;金属络合物(例如，Zn-蛋白质络合物);可生物降解的聚合物，例如聚酯；成盐反离子，例如钠、多元糖醇；氨基酸，例如丙氨酸、甘氨酸、天冬酰胺、2-苯基丙氨酸、和苏氨酸；糖或糖醇，例如乳糖醇、水苏糖、甘露醇、山梨糖、木糖、核糖、核糖醇、myoinisitose、肌醇、半乳糖、半乳糖醇、甘油、环多醇(例如，肌醇)、聚こ二醇；含硫还原剂，例如谷胱甘肽、硫辛酸、硫代こ醇酸钠、硫代甘油、[a]-单硫代甘油、和硫代硫酸钠；低分子量蛋白，例如人血清白蛋白、牛血清白蛋白、明胶、或其它免疫球蛋白；和亲水聚合物，例如聚こ烯吡咯烷酮。在治疗和/或预防有此需要的患者的疾病或障碍时，本文描述的制剂可用作药物组合物。术语“治疗”是指治疗性处理和预防性或防止性方法。治疗包括将所述制剂应用或施用至身体、分离的组织或来自具有疾病/障碍、疾病/障碍的症状、或疾病/障碍的倾向的患者的细胞，其目的为治愈、恢复、缓和、缓解、改变、治疗、减轻、改善、影响所述疾病、所述疾病的症状、或所述疾病的倾向。那些“有治疗需要”包括已具有障碍的那些以及要预防障碍的那些。术语“障碍”为将受益于用本文描述的蛋白质制剂治疗的任何病症。这包括慢性和急性障碍或疾病，包括使哺乳动物易于患有目标障碍的那些病理病症。本文要治疗的障碍的非限制性实例包括退行性疾病、骨和/或软骨和/或关节软骨缺损、免疫学疾病(优选关节、骨或软骨组织的慢性炎症，例如关节炎(包括但不限于骨关节炎、类风湿性关节炎))和脊柱障碍例如退行性椎间盘疾病。在优选实施方案中，所述脊柱障碍为特发性腰痛、椎间盘突出、椎间盘内破裂或椎间盘裂缝、神经根病、椎管狭窄、髓核突出诱发的坐骨神经痛、坐骨神经痛、特发性脊椎侧弯或脊椎病。术语“退行性疾病”表示具有受损软骨结构的疾病或缺损，例如涉及或不涉及骨骼结构的软骨退变或破坏。优选地，退行性疾病为退行性软骨疾病。这些包括颌颞关节障碍(TMD)、髋臼春障碍、关节炎、骨关节炎、类风湿性关节炎、银屑病性关节炎、青少年慢性关 节炎、rhizomelic pseudoarthritis、类风湿性多关节炎、退行性椎间盘疾病、软骨或骨软骨缺损、局灶性软骨缺损、局灶性骨软骨缺损、表层软骨缺损、剥脱性骨软骨炎、全层软骨缺损、半层软骨缺损、软骨软化症，与膝关节内和周围的腱和韧带相关的创伤、外侧或内侧半月板创伤、半月板撕裂、前十字韧带损伤、滑膜骨软骨瘤病、脊椎炎、僵直性脊椎炎、滑膜炎、绒毛结节性滑膜炎。
术语“软骨缺损”是指任何软骨异常，包括软骨疾病、例如由创伤或退行性过程导致的软骨改变。术语“关节软骨”覆盖关节中一部分骨的表面，并且起到两个骨自检的垫的作用，以允许在关节内移动。将正常健康的关节软骨描述为透明软骨。关节软骨由嵌入到胞内物质的基质中的特化细胞(软骨细胞)组成，所述胞内物质的基质富含蛋白聚糖，主要为蛋白聚糖聚合物、II型胶原纤丝、其它蛋白质和水。所述基质由嵌入其内的软骨细胞产生和維持。软骨组织不受神经支配和血管化，并且由下层组织滋养。除了⑶-RAP蛋白之外，本发明的药物组合物可以包含另外的治疗剂或生物活性齐U。例如，可以存在可用于治疗特定适应症(例如骨关节炎)的治疗因子，例如涉及于关节软骨或滑膜组分破坏的ー种或多种抑制剂，不限于抗金属蛋白酶、环状化合物、细胞因子拮抗齐U、皮质类固醇、TNF抑制剂、IL-抑制剂、抗血管新生物质、聚蛋白多糖抑制剂、P38激酶抑制剂、细胞凋亡抑制剂、透明质酸酶抑制剂和蛋白水解酶的抑制剂。控制炎症的因子可以为所述组合物的一部分，所述因子包括英夫利西单抗、依那西普、阿达木单抗、nerelimonmab、来纳西普等或它们的组合。还预见到，药物脂质体组合物可以包括胞外基质组分，例如透明质酸或其衍生物，包括盐、酷、内酯和硫化衍生物，优选透明质酸的偏酷。在另ー个实施方案中，本发明涉及试剂盒(制造制品)或容器，其含有本发明的制齐U。所述制剂可以优选地已经是液体状态。然而，或者，其可以优选为冻干状态。其还可以为冷冻的、冻干的、冷冻-干燥的或喷雾-干燥的状态。因此，如果所述制剂为不是液体的状态，其可以被从业者制备成(液体)水性药物组合物。例如，所述制剂可以为冻干的，因此需要进行重构。因此，所述试剂盒还可以包括分别用于重构冷冻的、冻干的、冷冻-干燥的或喷雾-干燥的制剂的手段和/或用于稀释所述制剂的手段和/或用于施用所述制剂或药物组合物的手段。所述试剂盒还可以伴有使用说明。因而，提供了制造制品，其含有本文描述的制剂，并且优选地其提供使用说明。所述制造制品包括适于含有所述制剂的容器。适合的容器包括、但不限于，瓶、小瓶(例如，双室小瓶)、注射器(例如，单或双室注射器)、测试管、喷雾器、吸入器(例如，计量剂量的吸入器或干粉吸入器)或储药罐(depot)。所述容器可以由各种材料形成，所述材料例如玻璃、金属或塑料(聚碳酸酷、聚苯こ烯、聚丙烯、多烯烃)。所述容器容纳该制剂，并且所述容器上 或与所述容器相关的标签可以指示重构和/或使用说明。所述标签还可以指示该制剂可用于或预期用于皮下给药。容纳制剂的所述容器可以为多用途小瓶，其允许制剂的重复给药(例如，1-6次给药)。所述制造制品还可以包括包含适合的稀释剂(例如，WFI、0. 9% NaCl,BWFI、磷酸盐缓冲盐水)的第二容器。当所述制造制品包含冻干形式的蛋白质制剂时，将稀释剂与所述冻干制剂混合将得到重构制剂中通常至少20 mg/mL的最終蛋白质浓度。所述制造制品还可以包括出于商业和用户角度有利的其它物质，包括其它缓冲剂、稀释剂、过滤器、针头、注射器、和具有使用说明的包装插页。在本发明的另ー个实施方案中，提供了制造制品，其含有本发明的水性制剂并提供了其使用说明。所述制造制品包括容器。适合的容器包括例如，瓶、小瓶(例如，双室小瓶)、注射器(例如，双室注射器)、含有注射器的自动注射笔、和测试管。所述容器可以由各种材料形成，所述材料例如玻璃、塑料或聚碳酸酷。所述容器容纳该水性制剂，并且所述容器上或与所述容器相关的标签可以指示使用说明。例如，所述标签可以指示该制剂可用于或预期用于皮下给药。容纳制剂的所述容器可以为多用途小瓶，其允许该水性制剂的重复给药(例如，1-6次给药)。所述制造制品还可以包括第二容器。所述制造制品还可以包括出于商业和用户角度有利的其它物质，包括其它缓冲剂、稀释剂、过滤器、针头、注射器、和具有使用说明的包装插页。本发明中还包括可用于递送本发明的制剂的装置。此类装置的实例包括、但不限于，注射器、笔、植入器、无针头注射装置、吸入装置和贴剂。通过附图和实施例进ー步示例了本发明，所述附图和实施例仅为示例性的，且不被理解为限制本发明的范围。所述附图示出图I :影响蛋白质稳定性的因素。图2 :可以采取的使蛋白质稳定的示例性方法。图3 :rh⑶-RAP在磷酸钾中的连续浓度。图4 :rh⑶-RAP在TRIS氯化物中的连续浓度。图5 :rh⑶-RAP在组氨酸盐酸盐中的连续浓度。图6 :高浓度rh⑶-RAP在不同缓冲体系中的稳定性。图7 :高浓度rh⑶-RAP在不同缓冲体系中的稳定性。
图8 :不同pH值下甘氨酸和rh⑶-RAP的净电荷。图9 :pH对rh⑶-RAP在150 mM甘氨酸中的溶解度的作用。

图10 :组氨酸磷酸盐摩尔浓度对rh⑶-RAP的溶解度的作用。图11 :组氨酸磷酸盐(调节成具有氯化钾的等渗的重量渗克分子浓度)对rhCD-RAP溶解度的作用。请注意在图3-11中，添加于柱状例的编号属于所述图中所示的每个“块”的柱条(从左至右)。例如，“0”属于最左边的柱条，“I”属于与标注“0”的柱条相邻的柱条，等
坐寸o下述实施例示例了本发明。基于本发明人以高浓度CD-RAP的稳定制剂为目标、从而得到用于患者的较小体积的注射剂(这会減少由于大体积注射剂导致的副作用，如疼痛)的考虑，测试了多个制剂对CD-RAP蛋白稳定化的作用。这些制剂中的一些示例性地示出于下文实施例中。然而，如本文所述，当以本发明的目的开始时，发现满足所述目的的制剂的适当成分属于经验性的工作，原因在于，每个蛋白质具有不同的性质，因此，无法从ー个实施例得到哪些成分为适当成分的结论。实施例I :对于rh⑶-RAP分析不同缓冲体系用36种缓冲体系透析rhCD-RAP (50 mM氯化钾、50 mM组氨酸盐酸盐或50 mMTRIS氯化物，每个pH 6.0)，每种缓冲剂加入或未加入下述稳定剂中的ー种，所述稳定剂选自蔗糖、甘露醇、甘氨酸、赖氨酸和谷氨酸，具有或不具有0. 1% Tween 20。在通过透析至30 mg/mL的rh⑶-RAP的后续浓缩过程期间,用UV/Vis分析过滤样品。通过冻融循环给稳定的制剂施加应力。在每个循环之后，将所述样品离心，然后用UV/Vis定量rhCD-RAP。透析在4° C和温和搅拌下，通过使用6-8 kDa分子量截留管，用500 mL所需缓冲剂透析2.0 ml的rh⑶-RAP散装料(pH 7. 4的350 mM精氨酸/磷酸盐中)，历时24小时。16小时之后，用500 mL新鮮缓冲剂交换该透析缓冲剂。将所得蛋白质溶液储存于2-8° C下，以用于进ー步分析。UV-VIS以13. 000 rcf离心经透析的rh⑶-RAP 5分钟之后，用UV/Vis测定样品中的蛋白质含量。对应的样品缓冲剂用于空白减去。为计算蛋白质浓度[mg/ml],使用280 nm下的吸光度和rhCD-RAP在280 nm下的比吸光系数[I. 649 mL/ (mg*cm)]。rhCD-RAP-浓度的提高将经透析的rh⑶-RAP转移到2 mL离心浓缩机中。在后续离心步骤(4000 rcf, 4° C)之后，rh⑶-RAP溶液的体积降低。测定剩余rh⑶-RAP溶液的体积，然后用UV/Vis定量rhCD-RAP浓度。热稳定性(冷冻/融化-循环)通过使用深冻机施加5个温度5 ° C至-25 ° C的冻/融循环，评估rh⑶-RAP的热稳定性。冷却和加热速率为1.0 ° C/min，其中各循环之间的等温步骤为15 min。将蛋白质溶液储存于4° C - 8 ° C下，直到分析。将浓度为30 mg/mL的300 W rh⑶-RAP转移到1.5 mL PP小瓶中，然后如上文所述通过限定的冻融步骤施加应力。
实施例2: rh⑶-RAP在不同缓冲体系中的稳定性測定了实施例I的全部不同缓冲体系的稳定化作用。磷酸钾缓冲体系将下述物质溶解在WFI中至最终重量为I kg得到50 mM的缓冲剂浓度。通过分别加入KOH和HCl，将pH调节至pH 6. O0a) 6，8 g 磷酸钾、12. 4 g KCl，具有和不具有 I. 0 g Tween 80b)6. 8 g 磷酸钾、50 g 蔗糖、4. 9 g KC1，具有和不具有 I. 0 g Tween 80c)6. 8 g磷酸钾、50 g甘露醇，具有和不具有I. 0 g Tween 80 d)6. 8 g磷酸钾、25 g甘氨酸，具有和不具有I. 0 g Tween 80e)6. 8 g磷酸钾、25 g谷氨酸，具有和不具有I. 0 g Tween 80f)6. 8 g磷酸钾、25 g赖氨酸，具有和不具有1.0 g Tween 80g)61. 0 g精氨酸,用磷酸(对照)调节pH 7.4。如果需要,用氯化钾调节300 - 400 mOsm/kg的等渗。姆种缓冲剂的重量渗克分子浓度不于表I。蓋！:磷酸钾缓冲剂的重量渗克分子浓度
制剂重量渗克分子浓度[mOsm/kg]
50 mM磷酸钾345
50 mM憐酸钾+ 5% (w/v)鹿糖34O
50 mM磷酸钾+ 5% (w/v)甘露醇376
50 mM憐酸钾+ 2. 5% (w/v)甘氨酸 371 50 mM憐酸钾+ 2. 5% (w/v)谷氨酸 3M 50 mM憐酸钾+ 2. 5% (w/v)赖氨酸 3〇2然后基于表I所列的缓冲体系，用磷酸钾透析rh⑶-RAP，并且在过滤装置中通过离心浓縮。在限定的缓冲剂连续減少后，测定维持的蛋白质溶液体积，然后用UV/Vis定量rh⑶-RAP浓度。图3示出了在透析5 mg/mL⑶-RAP溶液之前和之后以及浓缩至10、20和30 mg/mL之后的所得⑶-RAP浓度。所述精氨酸/磷酸盐缓冲剂用作对照。如图3中所示，所述制剂在精氨酸/磷酸盐缓冲体系中显示出全部浓缩步骤中的最佳溶解度。甚至在最高浓缩步骤，所测得的蛋白质含量达到rhCD-RAP的理论含量。因而，由于在精氨酸/磷酸盐中无rhCD-RAP的蛋白质损失，这种缓冲剂为最优选的增溶溶液之一。相比于精氨酸/磷酸盐，使用磷酸钾作为制剂缓冲剂需要ー个额外的补充物，以达到足够的溶解。由于50 mM的磷酸钾(包含氯化钾作为离子添加物，以达到等渗状态)显示出最高仅达到10 mg/mL rhCD-RAP的良好溶解度，因此需要加入补充物，以便实现浓度水平为高达30 mg/mL rh⑶-RAP和更好的溶解度。在大量稳定剂中，仅蔗糖得到甚至rh⑶-RAP在30 mg/mL浓度下的极好的溶解度。其它稳定剂显示出在不同浓缩步骤中具有部分可见沉淀蛋白的聚集作用。Tris缓冲体系将TRIS氯化物与不同稳定剂(例如蔗糖、甘露醇、甘氨酸、谷氨酸和赖氨酸，具有或不具有Tween80 )作为溶解促进剂溶解在WFI中至最终重量为I kg得到50 mM的缓冲剂浓度。通过分别使用额外的HC1，将pH调节至pH 6.0。a) 6. 05 g TRIS 碱、9. 7 g NaCl，具有和不具有 I. 0 g Tween 80b)6. 05 g TRIS 碱、50 g 蔗糖、3. 9 g NaCl，具有和不具有 l.Og Tween 80c)6. 05 g TRIS 碱、50 g 甘露醇，具有和不具有 I. 0 g Tween 80d)6. 05 g TRIS 碱、25 g 甘氨酸，具有和不具有 I. 0 g Tween 80e)6. 05 g TRIS 碱、25 g 谷氨酸，具有和不具有 I. 0 g Tween 80f)6. 05 g TRIS 碱、25 g 赖氨酸，具有和不具有 I. 0 g Tween 80如果需要,用氯化钾调节300 - 400 mOsm/kg的等渗。姆种缓冲剂的重量渗克分子浓度不于表2。直！TRIS缓冲剂的重量渗克分子浓度
权利要求
1.一种稳定的水性制剂，其包含至少5 mg/mL⑶-RAP和带电荷的氨基酸，其中所述CD-RAP蛋白直接溶解于其中。
2.根据权利要求I所述的制剂，其中所述氨基酸在约6至8的pH下具有净电荷。
3.根据前述权利要求中任一项所述的制剂，其包含缓冲剂。
4.根据前述权利要求中任一项所述的制剂，其包含张力调节剂。
5.根据前述权利要求中任一项所述的制剂，其包含稳定剂。
6.根据前述权利要求中任一项所述的制剂，其还包含赋形剂。
7.根据前述权利要求中任一项所述的制剂，其中所述制剂具有约6至8的pH。
8.根据权利要求I所述的制剂，其中所述带电荷的氨基酸选自精氨酸、组氨酸、赖氨酸和谷氨酸。
9.根据前述权利要求中任一项所述的制剂，其可以为冷冻干燥的、冻干的、或喷雾-干燥的。
10.根据前述权利要求中任一项所述的制剂，其中所述制剂的成分经过重复冻融循环具有稳定性。
11.根据前述权利要求中任一项所述的制剂，其用于治疗。
12.根据前述权利要求中任一项所述的制剂，其用于治疗炎性障碍，优选骨关节炎。
13.—种试剂盒，其包含根据前述权利要求中任一项所述的制剂。
14.根据前述权利要求中任一项所述的制剂，其包含至少30mg/mL⑶-RAP，其中所述缓冲剂选自磷酸钾、TRIS氯化物、组氨酸、精氨酸和谷氨酸盐，并且所述氨基酸选自天冬酸盐、谷氨酸盐(优选谷氨酸磷酸盐)、精氨酸(优选精氨酸磷酸盐或精氨酸盐酸盐)、组氨酸(优选组氨酸盐酸盐或组氨酸磷酸盐)、赖氨酸和甘氨酸。
15.根据前述权利要求中任一项所述的制剂，其包含至少30mg/mL⑶-RAP和 (i)50 mM TRIS氯化物和2. 5%谷氨酸盐； (ii)50 mM组氨酸和2. 5% (w/v)甘氨酸、2. 5% (w/v)谷氨酸盐(w/v)或2. 5%赖氨酸(w/v); (iii)300mM组氨酸盐酸盐pH 6.0 ；(iv)50、100、200或 300 mM 组氨酸磷酸盐 pH 6. O ； (V) 350 mM精氨酸盐酸盐pH 6. O ； (vi)350 mM精氨酸磷酸盐pH 6. O ； (vii)350 mM精氨酸磷酸盐pH 7. 4 ;或(viii)300 mM 谷氨酸钾 pH 6.0。
全文摘要
本发明涉及稳定的水性制剂，其包含至少5mg/mL CD-RAP和带电荷的氨基酸，所述氨基酸优选在约6至8的pH下具有净电荷。所述制剂的成分优选经过重复冻融循环具有稳定性。在优选方面，所述制剂用于治疗，优选用于治疗炎性障碍，优选骨关节炎。此外，提供了包含本发明制剂的试剂盒。
文档编号A61K9/00GK102869679SQ201180021207
公开日2013年1月9日 申请日期2011年4月27日 优先权日2010年4月27日
发明者K·海勒布兰德, R·西格 申请人:Scil技术股份有限公司