专利名称：新方法
技术领域：
本发明涉及改进的用于生产水包油乳液(具体地，包含角鲨烯的亚微米水包油乳液)的方法。
背景技术：
本发明涉及用于生产水包油乳液的方法。生产方法公开在0tt等人，2000(The Adjuvant MF59: A 10-year Perspective. Vaccine Adjuvants: Preparationmethods and Research Protocols [Methods in Molecular medicine,第 42 卷，第 12章，第 211-228 页]，Ott 等人，1995 (MF59 - Design and Evaluation of a Safe an·dPotent Adjuvant for Human Vaccines: Vaccine Design, the Subunit and AdjuvantApproach [Pharmaceutical Biotechnology 第6卷]Powel I 和 Newman 编，W006/10011OA I,以及 Lidgate 等人,1992 (Sterile Filtration of a Parenteral Emulsion.Pharmaceuticals Research 9(7): 860-863)。水包油乳液经常作为佐剂用于疫苗/免疫原性组合物中。由于这些乳液被施用给人类，因而所述乳液必须是无菌的。用作佐剂的水包油乳液是亚微米乳液，且油微滴足够小以穿过0. 2Mffl过滤器进行无菌过滤。本发明的一个目的是，提供一种用于生产水包油乳液的方法。
发明内容
本发明涉及一种用于生产亚微米水包油乳液，尤其是包含角鲨烯的亚微米水包油乳液的方法。具体地，本发明涉及一种用于生产水包油乳液的方法，所述方法包括步骤a)通过在含有油相的罐中施加正压，将油相引入混合装置中。
图I :乳液微滴的Z-平均直径随着穿过次数并在过滤以后的发展。误差棒是标准偏差。图2:乳液微滴的多分散性随着穿过次数并在过滤以后的发展。误差棒是标准偏差。图3 :乳液在3次穿过以后的滤过率，表示为过滤能力，通过在150 cm2膜上或在1300 cm2膜上测得。误差棒是标准偏差。
具体实施例方式通过将油相(其包含一种或多种油和任选的一种或多种表面活性剂)与包含表面活性剂的水相进行组合和混合，制备水包油乳液。所述表面活性剂和微流态化允许形成稳定的乳液，即不会在至少3年内分离成油相和水相的乳液。发明人已经证实，与通过例如膜泵引入油相而产生的水包油乳液相比，通过在包含油相的贮器(例如进料罐)中施加正压而将油相引入混合装置中，会产生具有减小的多分散性、减小的微滴尺寸和提高的滤过率的水包油乳液。因此，本发明提供了一种用于生产水包油乳液的方法，所述方法包括步骤a):通过在含有油相的罐中施加正压，将油相引入混合装置中。本领域技术人员可以容易地确定引入油相和/或水相时的压力。在本发明方法的一个具体实施方案中，通过调节压力至约2-6巴，例如约4巴至约5巴，例如4. 5巴，将油相和/或水相引入混合装置中。为了使任意水包油组合物适合对人施用，所述油相必须包含可代谢的油(即可生 物降解的)。所述油可以是任意植物油、鱼油、动物油或合成油，其对受体无毒，且能够通过代谢进行转化。坚果、种子和谷物是植物油的常见来源。合成油也是合适的。因此，本发明的水包油乳液包含可代谢的油，在一个具体实施方案中，本发明的水包油乳液包含角鲨烯(例如约4%至6% [v/V]) ο所述油相可以包含一种或多种可代谢的油。在一个具体实施方案中，所述油相包含角鲨烯或角鲨烷，尤其是角鲨烯。在本发明的另一个实施方案中，所述油相包含母育酚，在本发明的一个具体实施方案中，所述油相包含Ct -生育酹。在本发明的另一个实施方案中，所述油相包含角鲨烯和α-生育酚。所述油相可以进一步包含表面活性剂。合适的表面活性剂是技术人员众所周知的，包括但不限于聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯(吐温80、聚山梨酯80)、脱水山梨糖醇三油酸酯(司盘85)、磷脂酰胆碱(卵磷脂)、聚氧乙烯(12)鲸蜡硬脂酰醚和辛苯昔醇-9(TRITON X-100)。在一个具体实施方案中，所述油相包含脱水山梨糖醇三油酸酯(司盘85)。在本发明的一个具体实施方案中，所述油相包含角鲨烯和脱水山梨糖醇三油酸酯(司盘 85)。在本发明的另一个实施方案中，提供了如本文所述的方法，所述方法进一步包括步骤b):通过在含有水相的罐中施加正压，将水相引入所述混合装置中。在本发明的方法中使用的水相可以是水，例如注射用水(WFI)。但是，优选地，本发明的水相包括缓冲液。合适的缓冲液是本领域技术人员众所周知的，包括但不限于磷酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、Tris缓冲液、琥珀酸盐缓冲液、马来酸盐缓冲液或硼酸盐缓冲液。在一个具体实施方案中，所述缓冲液选自磷酸盐缓冲盐水(PBS)、改进的PBS (PBS-mod)和柠檬酸盐缓冲液。在一个具体实施方案中，所述水相包括这样的缓冲液当与所述油相混合时，会产生基本上等渗的水包油乳液。在本发明的一个具体实施方案中，所述水相包含一种或多种本文所述的表面活性齐U。在本发明的一个具体实施方案中，所述水相包含表面活性剂聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯(吐温80、聚山梨酯80)。在本发明的一个具体实施方案中，水相的引入[步骤b)]和油相的引入[步骤a)]基本上同时地进行。在本发明的另一个实施方案中，本文所述的水相和油相以约90:10或约95:5或约97. 5:2. 5或约98. 75:1. 25 (v/v百分比)的比例引入。本文使用的术语“混合装置”是指，适用于混合油相和水相以形成乳液的装置。在本发明的一个具体实施方案中，所述混合装置是高剪切混合装置。合适的高剪切混合装置是技术人员已知的，包括但不限于高速桨叶勻衆器、直列勻衆器(inline homogeniser)、胶体磨或声谱显示仪(sonolator)。在本发明的一个具体实施方案中，所述混合装置是高压匀浆器。合适的高压匀浆器是技术人员已知的，包括但不限于固定几何形状的微射流机(microfluidiser)或可变几何形状的高压勻衆器。在本发明的另一个实施方案中，提供了如本文所述的方法，所述方法进一步包括步骤c):混合所述油相和水相，以形成水包油乳液。在步骤c)中混合以后，如果在例如高剪切混合装置中混合的话，所述水包油乳液可以是粗的水包油乳液。为了减小水包油乳液中的油微滴的尺寸使得它适合无菌过滤，例如，可以在例如高压匀浆器中进一步加工得自步骤c)的乳液。因此，在本发明的另一个实施方案中，提供了本文所述的方法，所述方法进一步包括步骤d):对步骤c)的水包油乳液进行高压匀浆化，以形成亚微米水包油乳液。
通过改变乳液穿过高压匀浆器的次数，技术人员可以实现所需的油微滴尺寸，因 为油微滴大小在每个循环以后都会减小。因此，在本发明的一个实施方案中，提供了如本文所述的方法，其中对所述乳液进行高压匀浆化[步骤f)] 1、2、3、4、5、6、7、8或更多次。在本发明的另一个实施方案中，所述高压匀浆化是在约10000至约20000、约12000至约18000、约14000至约16000或约15000±1000 psi的压力进行。在高压匀浆化过程中，所述水包油乳液的温度通常升高，因而，在本发明的一个实施方案中，在对所述乳液进行高压匀浆化一次或多次以后，但是至少在最后一次以后，将所述水包油乳液冷却至约15°C至约30°C、约16°C至约29°C、约17°C至约28°C、约16°C至约27°C、或约 16°C 至约 28 °C。在另一个实施方案中，本发明的方法包括下述步骤
e.预过滤所述水包油乳液；和
f.通过无菌级过滤器，过滤根据步骤e)滤过的水包油乳液。“无菌级过滤器”是指，在大于或等于lxlOVcm2有效过滤面积的挑战水平，用微生物挑战以后，产生无菌流出液的过滤器。无菌级过滤器是本发明领域的技术人员众所周知的，且具有约0. 2Mffl的孔径，因而包括具有约0. 22ΜΠ1孔径的过滤器。在预过滤中使用的过滤器(即在步骤e中使用的过滤器)可以具有这样的孔所述孔的大小范围是从无菌级过滤器的孔径(即约0. 至约2Mm的孔径。在一个具体实施方案中，所述预滤器的孔径范围是从无菌级过滤器的孔径至约IMffl的大小。例如，在步骤e)中使用的过滤器的孔径是约2Mm、约2. 5Mm、约IMm、约0. 9Mm、约0. 8Mm、约0. 9Mm、约0. 7Mm、约0. 6Mm、约0. 5Mm、0. 45Mm或无菌级,例如约0. 2Mm,例如0. 22Mm。所述过滤器的膜可以由技术人员已知的任意合适的材料制成，例如，但不限于醋酸纤维素、聚醚砜(PES)、聚偏氟乙烯(PVDF)、聚四氟乙烯(PTFE)。在本发明的一个具体实施方案中，一个或多个或所有本发明的过滤器膜包含聚醚砜，例如亲水性聚醚砜。在本发明的一个实施方案中，所述亚微米水包油乳液包含约2%至约15%、约4%至约12%的油、约5%至约10%、约4%至约6%、约8%至约12%、例如约5%或10% (v/v)的油。与借助于诸如膜泵引入油相而生产的水包油乳液相比，本发明的方法生产这样的水包油乳液其中油微滴更小，多分散性减小，和/或所述水包油乳液更容易滤过。因此，本发明提供了通过本文所述方法生产的水包油乳液。
本发明的水包油乳液可以用作佐剂，且可以与多种或多种抗原相组合，以生成免疫原性组合物。因此，本发明提供了一种免疫原性组合物，其包含通过本文所述方法生产的水包油乳液和抗原。在本发明的另一个实施方案中，提供了一种试剂盒，所述试剂盒包含i)通过本文所述方法生产的水包油乳液；和Qi)抗原。适用于本发明的免疫原性组合物或试剂盒中的抗原包括但不限于源自流感病毒的抗原。具体地，所述流感抗原是亚单位的或裂解的流感病毒。所述流感抗原是卵衍生的，或尤其是细胞培养物衍生的。本发明的水包油乳液还可以包含母育酚。母育酚是本领域众所周知的，且描述在EP0382271中。具体地，所述母育酚是α -生育酚或其衍生物，诸如α -生育酚琥珀酸盐(也称作维生素E琥珀酸盐)。在本发明的一个具体实施方案中，提供了包含角鲨烯(例如约5% [v/v])和α -生·育酚(例如约5% [v/v])的本发明的水包油乳液。本发明的水包油乳液包含一种或多种表面活性剂。合适的表面活性剂是技术人员众所周知的，包括但不限于聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯(吐温80、聚山梨酯80)、脱水山梨糖醇三油酸酯(司盘85)、磷脂酰胆碱(卵磷脂)、聚氧乙烯(12)鲸蜡硬脂酰醚和辛苯昔醇-9 (TRITON X-100)。在本发明的一个具体实施方案中，水包油乳液包含聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯(吐温80、聚山梨酯80)。在另一个实施方案中，本发明的水包油乳液包含聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯(吐温80、聚山梨酯80)和其它表面活性剂，尤其是脱水山梨糖醇三油酸酯(司盘85)。在本发明的一个具体实施方案中，所述水包油乳液包含可代谢的油(例如角鲨烯)、母育酚(例如α-生育酚)和表面活性剂(例如聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯[吐温80、聚山梨酯80])。在本发明的另一个实施方案中，本发明的水包油乳液包含可代谢的油(例如角鲨烯)、表面活性剂(例如聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯[吐温80、聚山梨酯80])和任选的第二种表面活性剂(例如脱水山梨糖醇三油酸酯[司盘85])。在本发明的另一个实施方案中，本发明的水包油乳液包含可代谢的油(例如角鲨烯)、聚氧乙烯烷基醚亲水性非离子表面活性剂(例如聚氧乙烯(12)鲸蜡硬脂酰醚)和疏水性非离子表面活性剂(例如聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯[(吐温80、聚山梨酯80)])或脱水山梨糖醇三油酸酯[司盘85])。本文所述的水包油乳液和免疫原性组合物适合用于药物中，特别是用于预防和/或治疗疾病。因此，提供了用于药物中的通过本文所述的任意方法生产的水包油乳液或本文所述的免疫原性组合物。在另一个实施方案中，提供了用于预防和/或治疗哺乳动物(尤其是人)的疾病的通过本文所述的任意方法生产的水包油乳液或本文所述的免疫原性组合物。在另一个实施方案中，提供了通过本文所述的任意方法生产的水包油乳液或本文所述的免疫原性组合物在生产药物中的用途，所述药物用于预防和/或治疗哺乳动物(尤其是人)的疾病。
在另一个实施方案中，提供了一种治疗方法，所述方法包括下述步骤给哺乳动物(尤其是人)施用通过本文所述的任意方法生产的水包油乳液或本文所述的免疫原性组合物。在本文中与本发明的“疫苗组合物”有关的实施方案也适用于与本发明的“免疫原性组合物”有关的实施方案，反之亦然。在每种情况下，本发明人在本文中意图任选地用术语“由……组成”、“由……构成”分别替代术语“包含”、“包括”。与数字值z有关的术语“约”是指z±5%或10%。
实施例
方法
通过混合注射用水、磷酸盐缓冲盐水和吐温，在罐2中制备水相。通过混合生育酚和角 鲨烯，在罐I中制备油相。搅拌两相，直到得到均质。用氮冲洗整个装置，以避免生育酚氧化。用膜泵给高压匀浆器供料。以需要的流量比，一起进料两相。首先使两相穿过高剪切匀浆器，在这里得到粗乳液。然后，与高剪切匀浆器连通地，产物进入高压匀浆器，在这里得到细乳液。在混合装置的出口处，将产物收获在罐3中(第I次穿过)。当罐2和I空时，将来自罐3的乳液导向混合装置的入口，进行第2次穿过。在第2次穿过结束时，将产物收获在罐2中。当罐3空时，将来自罐2的乳液导向混合装置的入口，进行第3次穿过。将乳液收犾在te 3中，并在过滤以如在氣下保减。为了评估进料方法的影响，还在对整个装置施加正进料压的情况下，进行所述方法。为了实现该目的，用氮或空气给罐加压。结果
通过动态光散射(一种基于光漫射的方法)，测量大小。与对整个装置施加正压的方法相比，使用膜泵进料的方法得到的Z-平均直径更小。在所述方法开始时(第I次穿过)，该差异更大，但是在所述方法结束时(过滤产物)，该差异倾趋向于消失。另外，当整个系统处于正压下进行进料时，当增加穿过次数时，尺寸的变异性也减少。当使用膜泵时，则并非如此。参见图I。无论进料方法如何，多分散性是在相同范围内，但是，当对整个装置施加正压来实现该方法时，再现性要好得多。参见图2。与用膜泵进料的方法相比，当对整个装置施加正压来实现该方法时，滤过率增加，最重要的是，再现性提高。参见图3。结论
通过对整个装置施加正压来给混合装置供料，允许得到更小的微滴尺寸和提高的滤过率。此外，还会提高该方法的再现性，因为与用膜泵进料的方法相比，得到的ZAD、PDI和滤过率的标准偏差都更小。
权利要求
1.一种用于生产水包油乳液的方法，所述方法包括步骤a):通过在含有油相的罐中施加正压，将油相引入混合装置中。
2.根据权利要求I所述的方法，所述方法包括步骤b):通过在含有水相的罐中施加正压，将水相弓I入所述混合装置中。
3.根据权利要求I或2所述的方法，其中通过调节压力至约2-6巴，例如约4巴至约5巴，例如4. 5巴，将所述油相和/或水相引入所述混合装置中。
4.根据权利要求2或3所述的方法，其中步骤a)和b)基本上同时地进行。
5.根据任一项前述权利要求所述的方法，其中以约90:10、95:5或98.75:1. 25 (v/v百分比)的比例，引入所述水相和油相。
6.根据任一项前述权利要求所述的方法，其中所述混合装置是高剪切匀浆器或高压匀浆器。
7.根据权利要求2-6中任一项所述的方法，所述方法包括步骤c):混合所述油相和水相，以形成水包油乳液。
8.根据权利要求7所述的方法，所述方法进一步包括步骤d):对步骤c)的水包油乳液进行高压匀浆化，以形成亚微米水包油乳液。
9.根据权利要求8所述的方法，其中步骤d)进行2、3、4、5或6次。
10.根据权利要求8或9所述的方法，其中在约IOOOOpsi至约20000psi、约12000psi至约18000psi、约HOOOpsi至约16000psi或约15000±1000 psi进行所述高压匀浆化。
11.根据权利要求8-10中任一项所述的方法，其中在每次进行步骤d)以后，将水包油亚微米乳液冷却到 15°C至 30°C、16°C至 29°C、17°C至 28°C、16°C至 27°C、或 16°C至 28V。
12.根据权利要求8-11中任一项所述的方法，所述方法进一步包括下述步骤 e.预过滤所述水包油乳液；和 f.通过无菌级过滤器，过滤根据步骤b)滤过的水包油乳液。
13.前述权利要求所述的方法，其中所述水包油乳液包含2%至8%(v/v)的油。
14.前述权利要求所述的方法，其中所述亚微米水包油乳液包含4%至6%(v/v)的油。
15.根据任一项前述权利要求所述的方法，其中所述水包油乳液包含8-12%(v/v)的油。
16.根据任一项前述权利要求所述的方法，其中所述油相包含角鲨烯。
17.根据任一项前述权利要求所述的方法，其中所述油相包含表面活性剂。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述表面活性剂是脱水山梨糖醇三油酸酯(司盘 85)。
19.根据任一项前述权利要求所述的方法，其中所述油相包含母育酚。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述母育酚是α-生育酚。
21.根据权利要求2-20中任一项所述的方法，其中所述水相包含水溶液和表面活性剂。
22.根据权利要求21所述的方法，其中所述表面活性剂是聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯(吐温80、聚山梨酯80)。
23.通过根据权利要求1-22中任一项所述的方法生产的水包油乳液。
24.一种免疫原性组合物，其包含根据权利要求23所述的水包油乳液和抗原。
25.用于药物中的根据权利要求23所述的水包油乳液或根据权利要求24所述的免疫原性组合物。
26.用于预防和/或治疗疾病的根据权利要求23所述的水包油乳液或根据权利要求24所述的免疫原性组合物。
27.根据权利要求23所述的水包油乳液或根据权利要求24所述的免疫原性组合物在生产药物中的用途，所述药物用于预防和/或治疗疾病。
28.一种治疗方法，所述方法包括下述步骤给哺乳动物、例如人施用根据权利要求23所述的水包油乳液或根据权利要求24所述的免疫原性组合物。
29.—种试剂盒，其包含i)根据权利要求23所述的水包油乳液；和(ii)抗原。
30.根据权利要求23所述的免疫原性组合物或根据权利要求29所述的试剂盒，其中所述抗原源自流感病毒。
全文摘要
本发明提供了一种用于生产水包油乳液的方法，所述方法包括步骤a)通过在含有油相的罐中施加正压，将油相引入混合装置中。
文档编号A61K39/00GK102917689SQ201180028584
公开日2013年2月6日 申请日期2011年6月8日 优先权日2010年6月10日
发明者V.德库佩雷, V.曼库索 申请人:葛兰素史密丝克莱恩生物有限公司