专利名称：前药组合物、前药纳米粒子及其使用方法
技术领域：
本发明包括前药组合物、包含一种或多种前药的纳米粒子及其使用方法。
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背景技术：
具有体外活性的已知活性化合物在体内疗法中可以不是易进入的，原因是难以传递这些化合物。例如，所述化合物可具有短的体内半衰期，致使该化合物实际上在体内无用。类似地，化合物可在体内不稳定，在生理条件下转化为无活性化合物，或者作为选择，化合物可与显著的毒性相关联，致使其在体内应用困难。因此，需要传递这些活性化合物的方法，既维持化合物在体内的活性，又直接传递至想要的靶细胞，避免潜在的毒性。发明简沭本发明一个方面包括在体内传递化合物至靶细胞的组合物。该组合物包含非脂质体粒子和至少一种前药。粒子的外表面是包含至少一种前药的膜，其还包含约100%至约60%磷脂,其中在体内粒子的外表面能够融合至祀细胞膜的外层(outer leaflet),这样的融合导致前药从粒子转移至靶细胞的外层。前药包含键接至磷酸甘油酯的酰基部分的、小于约3000da的化合物，其中该化合物可经由酶裂解从磷酸甘油酯主链释放。前药基本上保留在粒子的外表面膜中，直至前药转移至靶细胞的外层，且前药还从靶细胞膜的外层进一步转移至内层(inner leaf let)，导致化合物在细胞内经由酶可裂解的键合的裂解而释放。本发明的另一个方面包括体内传递化合物至靶细胞的方法。该方法包括给予患者组合物，所述组合物包含在药学上可接受的载体中的非脂质体粒子和至少一种前药。粒子的外表面是包含至少一种前药的膜，其还包含约100%至约60%磷脂，其中在体内粒子的外表面能够融合至靶细胞膜的外层，这样的融合导致前药从粒子转移至靶细胞的外层。该前药包含键接至磷酸甘油酯的酰基部分的、小于约3000da的化合物，其中该化合物可经由酶裂解从磷酸甘油酯主链释放。前药基本上保留在粒子的外表面膜中，直至前药转移至靶细胞的外层，且前药还从靶细胞膜的外层转移至内层，导致化合物在细胞内经由酶可裂解的键合的裂解而释放。下文更详细地讨论本 发明的其他方面和相互作用(iterations)。参考彩图本申请文件包含至少一张彩色照片(photograph executed in color)。将由事务所按需求提供这种带有彩色照片的专利申请出版物的副本并支付必需的费用。图的简沭
图1描绘用(A)由前药传递的多柔比星和(B)游离多柔比星药物处理的细胞的光学显微镜图像。图2是描绘与未治疗的对照组比较的、游离多柔比星药物和前药多柔比星对细胞增殖的作用的图。图3是描绘在大鼠基质胶塞(matrigel plug)模型(η = 2/组)中，对结合到整联蛋白整联蛋白-标靶的PFC纳米粒子的多柔比星和紫杉醇前药的血管新生应答的图。图4描绘两个图，阐明在兔νχ2肿瘤模型(η = 2/组)中(A)与非-前药紫杉醇对照，于1.5Τ血管新生增强无显著性变化，和(B)对掺入整联蛋白标靶的PFC纳米粒子的紫杉醇前药的血管新生应答。图5描绘多柔比星 和可用到的功能修饰的位点。图6描绘PC-多柔比星共轭结合体(conjugate) I的合成流程。图7描绘PC-多柔比星(PC-DXR)候选者-1前药和前药的IH NMR(400MHZ)波谱。图8描绘紫杉酚前药的合成流程。图9是描绘PC-紫杉醇(PC-PXTL)前药对2F2B内皮细胞的抗增殖效应的图。图10描绘顺钼前药-1的合成流程。图11描绘顺钼前药-2的合成流程。图12描绘甲氨蝶呤前药的合成流程。图13描绘硼替佐米(brotezomib)前药的合成流程。图14描绘myc-抑制剂前药(A)和供选择的变体⑶的合成流程。图15描绘来那度胺前药的合成流程。图16描绘烟曲霉素(又称夫马洁林，fumagillin)前药I (顶部)和烟曲霉素前药2(底部)的合成流程。图17描绘光动力学疗法(TOT)前药的合成流程。图18描绘多西他赛前药(A)和供选择的变体⑶的合成流程。图19描绘两个图，阐明溶解于脂质膜的烟曲霉素在体外是稳定的，但在体内迅速丢失。(A)烟曲霉素的体外释放持续4天。(B)烟曲霉素的体内释放发生在大约数分钟内。图20描绘显示给予用α V β 3标靶的烟曲霉素前药减少植入物体积增加(implantvolume enhancement)的图。图21描绘两个图，阐明α V β 3标靶的烟曲霉素前药减少如由CyQuant分析检测的细胞增殖㈧，以及经阿尔玛蓝试验(Alamar blue assay)在HUVEC细胞检测的细胞代谢活性⑶。图22描绘阐明用多西他赛前药进行阿尔玛蓝试验的结果的图。将七千个2F2B细胞/孔暴露于不含药物(对照组)、含多西他赛或多西他赛前药的ανβ3标靶的粒子。图23描绘显微图和直方图，证明多西他赛前药对肿瘤生长的作用。㈧四个小图，阐明暴露于或者含多西他赛前药的ανβ 3标靶的粒子或者不含多西他赛的ανβ3标靶的粒子于基线和于注射后3hr组织的显微图。(B)给予多西他赛前药，肿瘤体积减少。(C)阐明含多西他赛前药的ανβ3标靶的粒子(左侧小图)或不含多西他赛的ανβ3标祀的粒子(右侧小图)治疗的肿瘤体积。图24描绘多西他赛前药对增殖指数的作用。㈧用α V β 3标靶且含多西他赛前药的粒子使肿瘤细胞的增殖指数减少。⑶显微图证明在暴露于含多西他赛的ανβ 3标靶的粒子之后减少的增殖。增殖指数等于PCNA阳性面积除以仅甲基绿核阳性的面积。图25描绘多西他赛前药对凋亡指数的作用。(A)用α V β 3标靶且含多西他赛前药的粒子使肿瘤细胞的凋亡指数减少。⑶显微图证明在暴露于含多西他赛的ανβ3标靶的粒子之后减少的凋亡。凋亡指数等于TUNEL阳性面积除以仅甲基绿核阳性面积。图26描绘(A)myc药物的结构和(B)图，阐明myc药物对多发性骨髓瘤细胞系
1.H-929 ii LP-1 ii1.KMS-1l iv.UTMC-2增殖的作用，用不同浓度的myc-药物孵育细胞，以含相应体积的DMSO作对比,采用台盼蓝拒染法(Trypan Blue Exclusion)进行实验。图27描绘阐 明于48小时α V β 3标靶的myc-前药PFC纳米粒子减少SMC增殖的图。图28描绘阐明于(A)48hrs和(B)72hrs, myc_max拮抗剂前药体外抑制黑色素瘤增殖的图。Tg:标祀的；PFC:全氟化碳粒子；tween:聚山梨醇酯胶束。图29描绘聚山梨醇酯胶束的图解。图30描绘沉积的玻璃表面之上的(nanocelle)滴的水分散体的轻敲模式原子力显微镜图像(tapping mode AFM image)的图解。图31描绘包含甲基泼尼松龙的前药。图32描绘喜树碱(A)的前药和合成喜树碱(campothecin)前药(B)的流程。图33描绘两个包含PNA的前药。图34描绘产生烟曲霉素类似物的流程。发明详沭本发明提供一个或多个前药组合物、含一个或多个前药的粒子及其使用方法。有利地，本发明提供组合物和体内传递化合物至靶细胞的方法。在一个方面，本发明由含包埋在非脂质体纳米粒子(在以下第II节描述)的前药(在以下第I节描述)的药物传递系统组成。纳米粒子还可任选包含如本文描述的归巢配体(homing ligand)。药物传递系统允许细胞内传递前药，同时保护前药免于可使药物失活的生理条件的影响。1.前药组合物一般而言，本发明的前药包括键接至磷酸甘油酯的酰基部分的化合物。适宜的磷酸甘油酯可包括磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇和磷脂酰丝氨酸。化合物可键接至磷酸甘油酯中的任一位置。例如，化合物可键接至磷酸甘油酯的snl位或sn2位。在优选的实施方案中，化合物键接至sn2位。(a)适宜的化合物一般而言，适宜的本发明化合物小于3000da。在一个实施方案中，化合物小于约3000、2900、2800、2700、2600、2500、2400、2300、2200、2100、2000、1900、1800、1700、1600、1500、1400、1300、1200、1100、1000、900、800、700、600、500、400、300、200 或 IOOda0 在另一个实施方案中，化合物介于约2500da和约200da之间。在还一个实施方案中，化合物介于约2000da和约200da之间。在一些实施方案中，化合物可大于3000da，只要含化合物的前药维持从细胞膜外层转移细胞膜内层的能力。典型地，适宜的化合物包含化合物活性位点外面的反应性基团。如下描述的，该反应性位点使得化合物键接至甘油酯主链。本发明适宜的化合物可典型地选自小分子、金属原子、有机金属复合物、放射性化合物、氨基酸聚合物(如蛋白质、肽等)、碳水化合物、月旨质、核酸聚合物，或其组合。一般而言，适宜的化合物可如本文描述的键接至磷酸甘油酯。一旦化合物从甘油酯主链裂解下来，释放的形式可为活性化合物或前-活性化合物。可使化合物衍生以增强想要的化合物的特性。使化合物衍生的方法为本领域已知。在一些实施方案中，例如，化合物可为药物、治疗性化合物、类固醇、核酸基物质，或其衍生物、类似物或它们的组合，以其原生形式或带有疏水或荷电部分以增强掺和或吸附于纳米粒子的衍生形式呈现。这样的化合物可为水溶性的或可为疏水性的。化合物的非限制性实例可包括免疫相关制剂、甲状腺制剂、呼吸产品、抗肿瘤药、抗-蠕虫药、抗-疟药、有丝分裂抑制剂、激素、抗-原生动物药、抗-结核药、心血管产品、血液制品、生物应答改进剂、抗-真菌药、维生素、肽、抗-过敏药、抗凝剂、循环药物、代谢增强剂、抗-病毒剂、抗-心绞痛剂、抗生素、抗-炎 症剂、抗风湿药、麻醉止痛剂、强心苷、神经肌肉阻断剂、镇静齐U、局部麻醉药、全身麻醉药或放射性原子或离子。在某些实施方案中，化合物是适配子或核酸衍生物、诸如肽核酸(PNA)或锁核酸(locked nucleic acid) (LNA)。在作为范例的实施方案中，所述化合物可为多柔比星、紫杉醇、紫杉酚、来那度胺、甲氨蝶呤、硼替佐米(b0rteZ0mib)、myC-抑制剂、来那度胺、顺钼、甲基泼尼松龙、烟曲霉素、喜树碱、肽核酸、PDT药物或其保留药学活性的衍生物或类似物。在一个实施方案中，所述化合物可为烟曲霉素的类似物。在一些实施方案中，烟曲霉素的类似物选自在实施例12中详细描述的类似物。在其他实施方案中，所述化合物可为PDT药物，诸如式XI的前药。另外的适宜的PDT药物为本领域已知,且可包括卩卜吩姆钠(porfimer sodium)、氨基乙酰丙酸和氨基乙酰丙酸的甲基酯。在其他的示例性实施方案中，所述化合物可为选自列于下表A中的化合物。表A:化合物的非限制性实例
权利要求
1.一种在体内将化合物传递至靶细胞的组合物，该组合物包含非脂质体粒子和至少一种前药，其中 (a)粒子的外表面是包含至少一种前药的膜，并且还包含约100%至约60%磷脂，其中在体内粒子的外表面能够融合至靶细胞膜的外层，这样的融合导致前药从粒子转移至靶细胞的外层， (b)所述前药包括键接至磷酸甘油酯的酰基部分的、小于约3000da的化合物，其中的化合物可经由酶裂解从磷酸甘油酯主链释放， (C)所述前药基本上保留在粒子的外表面膜中，直至将前药转移至靶细胞的外层，和 (d)所述前药从靶细胞膜外层被进一步转移至内层，导致在细胞内经由酶可裂解的键合的裂解而释放化合物。
2.权利要求1的组合物，其中粒子的外表面包含不超过3%的前药。
3.权利要求1的组合物，其中的外表面可包含最高至约10%聚山梨醇酯。
4.权利要求1的组合物，其中不少于约10%的外表面是交联的。
5.权利要求1的组合物,其中的外表面还包含归巢配体。
6.权利要求5的组合物，其中的外表面不是聚乙二醇化的，除了归巢配体之外。
7.权利要求5的组合物，其中的归巢配体选自抗体、抗体片段、肽、无唾液酸糖蛋白、多糖、核酸、小分子和拟肽。
8.权利要求1的组合物，其中的化合物键接至磷酸甘油酯的sn-2酰基部分。
9.权利要求8的组合物，其中前药的酰基部分离丙三醇主链sn-2酯键的长度为至少4个碳原子。
10.权利要求1的组合物，其中的前药包括选自肽、肽拟似物或类似物、有机金属复合物、有机分子和核酸或其类似物的化合物。
11.权利要求1的组合物，其中在体内酶可裂解的键合在细胞外基本上不裂解。
12.权利要求1的组合物，其中的前药包括选自化合物1、I1、II1、IV、V、V1、VI1、VII1、IX、X、X1、XI1、XII1、XIV、XV、XV1、XVI1、XVIII 和 XIX 的化合物。
13.权利要求1的组合物，其中的前药包括选自多柔比星、多西他赛、甲泼尼龙、烟曲霉素或其类似物、喜树碱或其类似物，以及PDT药物的化合物。
14.权利要求1的组合物，其中的前药包括选自磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇和磷脂酰丝氨酸的磷酸甘油酯。
15.权利要求1的组合物,其中的粒子在约10nm和10微米之间。
16.权利要求1的组合物，其中的化合物是前药。
17.一种在体内将化合物传递至祀细胞的方法,该方法包括给予患者组合物，所述组合物包含在药学上可接受的载体中的非脂质体粒子和至少一种前药，其中 (a)粒子的外表面是包含至少一种前药的膜，其还包含约100%至约60%磷脂，其中粒子的外表面能够在体内融合至靶细胞膜的外层，这样的融合导致前药从粒子转移至靶细胞的外层， (b)所述前药包括键接至磷酸甘油酯的酰基部分的、小于约3000da的化合物，其中的化合物可经由酶裂解从磷酸甘油酯主链释放， (c)所述前药基本上保留在粒子的外表面膜中，直至将前药转移至靶细胞的外层，和(d)所述前药还从靶细胞膜外层转移至内层，导致化合物经由酶可裂解的键合的裂解在细胞内释放。
18.权利要求17的方法，其中组合物经静脉给予。
19.权利要求17的方法，其中的组合物还包含另外的药用活性成分。
20.权利要求17的方法，其中的组合物包含选自化合物1、I1、II1、IV、V、V1、VI1、VII1、IX、X、X1、XI1、XII1、XIV、X`V、XV1、XVI1、XVIII 和 XIX 的前药。
全文摘要
本发明公开包含前药和连接于磷脂的前药的纳米粒子，其中所述键合促使前药从纳米粒子释放至靶细胞的位点或通过粒子与细胞膜的融合释放至细胞膜。本发明也公开了制备和及其使用纳米粒子及其成分的方法。
文档编号A61K9/10GK103096874SQ201180029772
公开日2013年5月8日 申请日期2011年4月15日 优先权日2010年4月15日
发明者G.M.兰扎, D.潘 申请人:华盛顿大学