使用金颗粒丰富凝溶胶蛋白血液样本的制作方法

专利名称：使用金颗粒丰富凝溶胶蛋白血液样本的制作方法
使用金颗粒丰富凝溶胶蛋白血液样本本发明涉及一种制备至少一种治疗性蛋白质或包含在容器中的具有体液、培养物和治疗性蛋白质的蛋白质混合物。本发明还涉及用于进行该方法的容器和含有该制备的蛋白质作为活性成分的药物。关节变性疾病在人类和动物中均大量存在。在人类中，老年病人会自发性地产生关节病(由于已知的风险因素)，在年轻患者中，也会由于创伤后以并发症的形式产生。但两种形式具有相同的临床症状，包括关节疼痛和功能受限，以及会使患者的生活质量大幅受限。大量的原因，例如负荷过大、不合适的负荷、关节不稳定或其它的感染，都会由于软骨细胞的细胞凋亡，导致关节软骨的机械和酶损伤，也会引起胶原II型和蛋白多糖的缺失。因此，在退化和修补中存在不平衡。软骨的退化是发病的核心，该疾病不仅影响软骨，还影响关节囊和软骨下的骨头。在软骨损伤的情况下，分解物会到达滑液并引起滑膜炎。此外，对关节囊的损害还会直接释放出炎症介质，且严重受损的关节囊还会导致关节不稳定。在大且环形的负荷下，软骨下的骨头层会相应地提高骨密度。然而，这种硬化的结果是，骨头越来越硬，越来越脆。这首先会导致振动吸收能力的降低，在已经过负的软骨上会增加更大的负荷，其次，在移动中，会在软骨下骨板和矿物化骨头之间产生剪切力。在患有关节病和/或骨关节炎和/或其它关节疾病的马中，在体液中已经测出了促炎症(炎症促进)细胞活素肿瘤坏死因子Ct (TNFa )、白介素I (IL 一 I)和白介素6 (IL — 6)以及前列腺素E2(PGE2)和金属蛋白酶的浓度升高。在患有关节病的人类中，促炎症细胞活素在血液和体液中也升高。促炎症(炎症促进)细胞活素TNF a、IL 一 I和IL 一 6通过滑膜的B —滑膜细胞(synoviocyti sectetorii )、滑膜中的炎症细胞和软骨细胞隐藏,且会刺激基体金属蛋白酶(MMPs)和聚蛋白多糖酶和其它的炎症介质释放，该炎症介质例如是前列腺素(PGE2)或一氧化氮(NO)。金属蛋白酶是可以降解软骨基体(包括胶原II型、蛋白多糖)、IL 一 I和TNF a，也能直接抑制胶原II型的产生。在大多数情况下，对 变性关节疾病的常规治疗包括对于炎症的症状疗法，例如通过合适的药物，在全身或关节内抑制炎症。这包括皮质类固醇，有时与玻璃酸联用，其直接在关节内给药，且经常被使用。此外，还经常使用软骨保护剂。然而,这些药物治疗存在大量不良反应。症状治疗的替代方法(基于非留族和留族消炎)通过细胞因子抑制剂或软骨保护剂进行，其被认为是“疾病改性药物”(Qvist等2008)。其还包括患者血液获得由内源(内源)蛋白质，并作为个体药物再次向所述患者给药的治疗。W09909051公开了一种在事先由(动物或人类)患者获得的体液试样中制备治疗性，内源(=内源)蛋白质，以及用于进行该方法的注射器。该方法所得蛋白质被描述为红细胞生成素、胰岛素、干扰素、白介素4、白介素10、可溶肿瘤枯斑因子受体和白介素一 I受体拮抗剂。蛋白质在注射器中制备并提供。该注射器的内部结构包括排列在注射器中的颗粒、浸溃在硫酸铬中的玻璃珠，这样的结构被能刺激所需蛋白质生物合成的固定诱导物覆盖。在以血液作为体液试样的情况下，免疫球蛋白，尤其是免疫球蛋白G被看作是用于刺激包含在血液中的单核细胞，从而形成消炎蛋白质的诱导物。该方法通过用来自患者的体液来充满和培养该注射器进行。该治疗性蛋白质在体液中形成。该方法得到的体液被无菌保存在注射器中，当需要时，直接重新导入患者，而无需额外的处理，例如，在离心和/或无菌过滤后。本发明的一个目的是进一步发展或改进该方法，使得产生的蛋白质具有更高的量，且避免不期望的副作用。该方法通过提供下述的方法实现，其中，容器含有金颗粒。术语“容器”在本文中是指用于储存液体足够时间的密闭容器或密闭贮藏器具，其中，容器或贮藏器具能防止储存液体泄露。金作为药物的用途在药物领域中已知很久了。在19世纪末期，金尤其是用于治疗肺结核。由于类风湿性关节炎也是传染性疾病的错误假设，金也被用于该情况。治疗是成功的，并持续使用多年直至现在(Kean and Kean 2008)。人类软骨细胞的体外试验示出金化合物(硫代苹果酸金)能已知软骨细胞产生一氧化氮(NO)。一氧化氮会对促炎症细胞因子IL 一 I和TNFa产生破坏性的效果(Green等2006)。这会导致胶原和蛋白多糖的产生降低，会引起软骨细胞细胞凋亡 并刺激金属蛋白酶(Vuolteenaho等2005)。在现有技术已知的治疗方法中，金可以肌肉给药或口服。然而，使用合适的给药方法和合适的金药剂，在体内研究中已知的期望效果只能达到一定的程度。根据本发明的方法，首次提供了将金颗粒与人类或动物内源或同源体液，尤其是一个人自己的血样在一个密闭体系中混合，令人惊讶地发现不仅(i )与以前的方法相比，在血液的情况下，期望的蛋白质浓度明显提高，特别是软骨系统(尤其是IL 一 1、IL 一 6、IL 一8、IL — 10、G — CSF,MCP — 1、MIP — 1、RANTES、TNF — alpha、GRO — alpha、MCP — 3、MIF和IL 一 1RA)，而且(ii)在培养过程中，由于老化的生理蛋白质得到已知，因此可疑的蛋白的质量更好，以及(iii)蛋白质凝溶胶蛋白明显收集。凝溶胶蛋白是一种肌动蛋白粘结蛋白质，其普遍存在于动物细胞中(包括人类细胞)和体外(例如在血浆中)，其能使Ca2 +—肌动蛋白片段片段化，且能防止再聚合，其在肌动蛋白片段的收集和解聚的过程控制中能起到关键作用。凝溶胶蛋白在细胞质萃取物中发现并被确定，其普遍存在以及运动性细胞的种族发育保存揭示了其作为内细胞控制蛋白质的重要作用。稍后仅公开了凝胶溶蛋白还存在于哺乳动物的血浆中，且能解聚肌动蛋白。该所谓的血浆凝胶溶蛋白(pGelsolin，pGS)是细胞质凝胶溶蛋白(cGelsolin, cGS)的异构形式,且与其结构不同，其在N端基末端具有额外的23氨基酸。血浆凝溶胶蛋白的生理功能仍然是大量研究工作的目标(DiNubriu，2007和其中引用的文献)。凝胶溶蛋白调控重要的细胞功能，例如细胞运动性、吞噬、细胞凋亡和血小板激活(Silacci等2004, Trickey等2004)。在患有类风湿性关节炎的患者情况下，凝胶溶蛋白的血浆浓度降低(Osborn等2008).在包括组织变性在其它疾病的情况下，尤其是在败血症的情况下，凝胶溶蛋白的血衆浓度也会降低(Suhler等1997, Osborn等2008,Lee等2007)。现有技术的知识指出了血浆凝胶溶蛋白起到吸收身体过量炎症反应的缓冲液(DiNubile2008)。通过本发明方法制备的蛋白质，尤其是溶胶凝蛋白和细胞因子，能(但不是必须)与直接与容器中的其它液体成分一起重新向患者给药，例如不进一步处理，例如离心、无菌萃取或转移至其它容器。结果，可以避免蛋白质溶液的污染，在蛋白质给药中患者感染的风险被最小化。在根据本发明方法的本发明的变形中，金颗粒可以在体外培养后，从体液，例如血清中移除，并抛弃。其优点是在所述体液，例如所述血清的给药中或之后，金引诱的不利效果可以完全避免。在根据本发明方法的另一优选的本发明变形中，不仅金属颗粒，而且细胞(例如血液细胞)与其它不溶收集物在体外培养后从体液(例如血清)移除并抛弃。制备的内源人体体液，尤其是血清具有出人意料的容忍性，且没有不期望的副作用。该方法中使用的金颗粒具有限定的结构和/或尺寸。具有10纳米 500微米的颗粒尺寸的微粒和/或纳米颗粒是特别适合的。在本发明方法的变形中，金颗粒可以在体外培养后，从体液，例如血清中移除，并抛弃，优选在该方法中使用约Iym尺寸的金颗粒，更优选每IOml存在IO3 — IO4量的金颗粒。对于该用途，实践中，容积为约IOml的容器(例如注射器)已经被确认。在实际使用中已经被验证成功的实施方式中，金颗粒以每Iml体液为O. 3mg的量存在于容器中。每Iml为O.1 — Img的浓度是理论事实并被使用。容器的内部结构优选没有阻凝剂，例如肝素、柠檬酸、EDTA或CPDA，这是由于本发明基于的部分事实，令人惊讶地发现，存在少量该物质的情况下，与没有其相比，会生物合成出少量的蛋白质。尤其是在血液作为体液，肝素作为阻凝剂的情况下，存在肝素，例如涂布在容器内壁上，与没有肝素和其它阻凝剂相比，获得明显少量的细胞因子。作为容器，尤其可以是 注射器，这是由于其不仅可以用作培养容器，还可以同时作为用于收集装置和/或作为用于向患者注射蛋白质的给药装置。作为容器，还可以是密封袋，尤其是在相对大体积的情况下，与具有相同体积的注射器相比，其处理和储存更方便，且由于其能通过技术上简单且安全的方法与注射器连接，且能通过该注射器填充和清空。根据本发明的方法非常适合由血液细胞制备(生物合成)并收集蛋白质。因此，作为体液，可以是血液，尤其是血清。令人惊讶的是，使用根据本发明的方法，可以特别有效地，例如大量地制备治疗性蛋白质凝胶溶蛋白。因此，根据本发明的方法尤其适合获得凝胶溶蛋白。除了装满体液的容器的培养条件以外，实践中还示出了培养时间为12 — 72小时，优选24小时。温度为20°C — 41°C，优选37°C能获得良好的结果。所述任务的解决方法还可以是提供一种用于在体液中进行体外合成和收集(体外诱导)治疗性蛋白质的容器，其中，容器含有金颗粒，且适合收集，储存和再分散体液试样，其能与中空针(插管、注射管)连接，从而其所含物可以通过所述中空针(插管、注射管)注射。使用该容器，尤其适合进行上述蛋白质制造方法，且具有相关的优点。制备的蛋白质可以通过连接的中空针直接在期望的位置给药，尤其是直接导入人体或动物体。金颗粒优选具有规定的结构和/或规定的尺寸。微粒和/或纳米颗粒(颗粒尺寸在10纳米一 500微米)是特别适合的。金颗粒在容器中的合适量是每Iml体液为O.1mg 一IOmg,优选每Iml体液O. 3mg。容器优选为注射器或密封袋。注射器的优点是其不仅可以用作培养容器，同时还能作为用于收集体液的收集装置和/或作为将蛋白质注入患者的给药装置。密封袋的优点是与具有相同体积的注射器相比，其处理和储存更方便，且能与注射器相连以填充和清空。特别适合的容器是市售的在内部没有特别设计的注射器(例如，5 -1OOml注射器)。可以将金颗粒(例如来自Biorad Laboratories,Cat. 165 一 2264的金微载体)引入注射器圆筒中。注射器，尤其是注射器圆筒的内壁和在圆筒中的注射器注射塞，优选由塑料构成，例如聚苯乙烯、聚乙烯、聚偏氯乙烯、聚丙烯(中性S — Monovettes, Sarstedt)或类似物质或其类似物。容器特别适合用于由血液细胞制备(生物合成)和收集蛋白质，尤其是凝胶溶蛋白。因此，作为体液，可以是血液，尤其是血清。根据本发明方法在体液中制备的蛋白质可以与体液和金颗粒，或没有金颗粒，来制备用于治疗疾病的药物。通过本发明方法制备的富蛋白质，尤其是富细胞因子和富凝胶溶蛋白的体液，特别是血液血清能安全、廉价、快速地制备，尤其是在副作用上，能有效代替常规的药剂。因此，本发明还提供了一种富蛋白质体液，尤其是富细胞因子和富凝胶溶蛋白的血液血清，用于药物或用于制备药物，该体液通过如下获得，使用体液，尤其是血液血清，容器含有金颗粒，优选金颗粒尺寸为I μ m, 优选每IOml容器具有IO3 — IO4金颗粒(或每Iml血液/容器为O. 3mg直径为I μ m的金颗粒)，培养该由体液，尤其是血清以及金颗粒组成的混合物(例如培养12 - 72小时，优选24小时，在20°C — 41°C下，优选在37°C下)，接着将金颗粒和优选(例如任选)额外的血液细胞和其它不溶的成分从体液，尤其是血清移除并抛弃(优选通过离心和/或无菌过滤)。本发明还提供了内源或同源血液与金颗粒联用作为药物或制备药物的用途。换句话说本发明还提供了由内源或同源血液与金颗粒组成的物质混合物用作药物，或包含由内源或同源血液与金颗粒组成的物质混合物，其中包括积聚的蛋白质作为活性成分。根据本发明的药物能简单、廉价、低风险和有效的治疗。所述药物特别适合于治疗变形关节疾病，尤其是关节病和肌腱病。尤其是用金颗粒培养，然后将颗粒去除的药物特别适合用于治疗关节病和其它与组织病变和/或与凝胶溶蛋白缺乏相关的疾病。根据本发明的优选实施方式是用金颗粒培养体液(尤其是血液)，在培养后，凝胶溶蛋白的含量至少是相应的凝胶溶蛋白的血液标准值的两倍。在本文中，术语“凝胶溶蛋白的血液标准值”是指在需要用药物治疗的患者群中药物或兽药凝胶溶蛋白的标准值。患者群的特征是动物学种类和种族，性别以及年龄。该富凝胶溶蛋白药物非常适合于治疗与患者血液中凝胶溶蛋白缺乏相关的疾病，例如败血症或中风。培养的血液一金混合物可以整体或分批给药。如果需要，可以在向(动物或人类)患者给药前，进行离心和/或无菌分离，从而例如从血液移除细胞和细胞片段，因此同时可以降低注射体积。
以下本发明通过实施例和附图进行更详细的描述

图1表示在不同患者中，在进行(TO)根据本发明方法和之后(T24)，与对照群的蛋白质特征的MID - FTIR光谱分析。蓝色表示TO时间的蛋白质特征，绿色表示在T24时间，使用根据本发明的方法治疗的患者的蛋白质特征，红色表示在T24时间，对照血清的蛋白质特征。图2表示蛋白质的多成分分析的结果GS =凝胶溶蛋白IL —4=白介素一4IL— 10=白介素一10IL— I3=白介素一I3
IL -1Ra =白介素一I受体拮抗剂IL— 1β=白介素一1βTNF — α =肿瘤坏死因子αG - CSF =粒细胞菌群刺激因子GM - GSF =粒细胞巨噬细胞菌群刺激因子IFN — g =干扰素 YSCGF - β =造血干细胞成长因子MIP -1a =巨噬细胞炎症蛋白质一 IaMIP — 1β =巨噬细胞炎症蛋白质一1βVEGF =血管内皮成长因子IL— I8=白介素一I8MCP - 3 =巨噬细胞趋药性蛋白质SDF — a =基质衍生因子Basic FGF =成纤维细胞GRoa =成长调节致癌基因α在血液中培养TO时间(“Τ0”)和培养24小时后，没有进一步的处理(“Kontrolle”)，以及根据W09909051 (“StdT”)或通过根据本发明的方法(“Erfindung”)。图3表示所有测试马匹在根据本发明的治疗前和治疗后，在特定的再测试时间的膨胀程度的图示。图4表示所有测试马匹在根据本发明的治疗前和治疗后，在特定的再测试时间的残疾程度的图示。图5表不在患有膝关节病的患者治疗如或后的KOOS值。图6表示患有膝关节病的患者在如下时间段的滑液中的积液和凝胶溶蛋白浓度在第一次(Tl)、第二次(T2)、第三次(T3)注射后。图7表不在冲击治疗后外植体/软骨制剂的蛋白多糖释放。实施例1 :在根据本发明的方法后，以及在根据本发明的容器中，通过MID - FTIR光谱方法和多成分分析，检测血样中的蛋白质制备在根据本发明的容器中，从11个不同的患者(Nr.1 — 11)收集两份9ml血样，该容器是实现填充了 2.7mg金颗粒(直径为Ιμπι)的9ml注射器。在没有金颗粒作为含有物的同样的9ml注射器中收集来自同样来源(患者)的同样量的血样。在不同的时间分析试样，即在血液去除后的TO时间立刻进行和在37°C下培养24小时的T24时间。通过傅立叶转换红外光谱，在中红外范围(光谱范围从4000CHT1 - 400CHT1)分析试样，通过短 MID — FTIR 光谱分析(例如 Firma Micro — BiolyticsGmbH/Esslingen 的AquaSpec法)分析试样。傅立叶转换红外光谱的测定原则是基于具有电磁波的物质的辐射，其在特定范围内被吸收。由于红外线辐射在分子间振动程度的范围内具有能量，吸收会刺激键的振动。使在测量范围(表格)中，以偏离的形式可见。由于每一种键的能量或频率是特定的，因此还可以鉴定出物质和明确的结构。TFIR光谱特别适合于分析生物大分子中的结构，反应引诱变形。使用该方法，能研究生物系统，由于是含蛋白质的含水液体。该试样既不能改性，也不能被破坏，且需要在生物分子的天然条件下进行，即可以测定“实际状态”，这是由于需要既不是固定，也没有各种种类的试样。 由于蛋白质所有的分子组成在红外光谱范围内具有吸收带，实际上蛋白质所有的区域都可以观察到，且能获得关于蛋白质结构的详细信息。MID - FTIR光谱法可以自动和重复地定性和定量蛋白质构造中的改变，并确定蛋白质浓度。即使非常低的蛋白质浓度(低至O. lmg/ml)和非常小的构造改变，也能够测定。当在本发明的文字描述中进行该方法时，具有或没有金颗粒的血样可以在“实际”状态下，在光谱测定细胞(转移细胞)中进行分析，该分析非常准确，生物可兼容，且适合用于含水试样。使用内部校准，对于每一测量试样，可溶蛋白质的浓度及其第二结构(α —螺旋，β —片)均能自动测定。该测定的结果在图1中进行图示。其表示在金颗粒存在下，根据本发明进行培养的试样的生物特性与对照试样不同。所有试样在TO时间下的测量值用蓝色显示，且主要集中在左上象限。在根据本发明的方法，培养24小时后的测量值用绿色显示，且主要集中或靠近左下象限。这表示在血液培养中生理蛋白质的老化被添加的金已知。对照试样培养24小时后的测量值用红色显示，且主要集中在右上象限。偏右表示蛋白质结构老化。使用基于不同代码微颗粒(例如来自BioRad Laboratories, Munich的BioPlex 2200系统)的多参数分析方法(同义词多成分分析)，在时间TO和T24，在与根据本发明(“Erfindung”)相关的试样，与根据W09909051 (“StdT”和)相关的试样和没有处理的相应对照群中，测定下述蛋白质凝胶溶蛋白(GS)、白介素一 4 (IL 一 4)、白介素一 10 (IL 一 10)、白介素-13(IL-13)、白介素-1受体拮抗剂(IL_41Ra)、肿瘤坏死因子a (TNF - α )、粒细胞菌群刺激因子(G — CSF)、粒细胞巨噬细胞菌群刺激因子(GM — GSF)、干扰素Y (IFN — g)、造血干细胞成长因子(SCGF — β )、巨噬细胞炎症蛋白质一 la(MIP — la)、巨噬细胞炎症蛋白质一1β (MIP — 1β )、血管内皮成长因子(VEGF)、白介素一 18 (IL — 18)、巨噬细胞趋药性蛋白质(MCP - 3)、基质衍生因子(SDF - a)、成纤维细胞(Basic FGF)、成长调节致癌基因α(GRoa)。这些蛋白质在组织繁殖和组织修补中扮演着重要的角色。该分析的结果在表I中示出，并在图2中进行图示。
其显示出根据本发明处理的试样(“Erfindung”)在处理24小时后，凝胶溶蛋白浓度(因子10)明显增加，然而在对比试样(“KontiOlle-T24”和“StdT T24”)中，发现凝胶溶蛋白消失而不是凝胶溶蛋白积聚。根据本发明处理试样中的肿瘤坏死因子a(TNF — α)、巨噬细胞趋药性蛋白质(MCP — 3)、成长调节致癌基因a (GRoa)也基本上(TNF-α :因子30-40，MCP-3 :因子 20-30)或明显高于对比试样(“Kontrolle_T24” 和 “StdT T24”)。实施例2 :在动物中的药效研究A)软组织肿胀作为预期的临床研究的一部分，用根据本发明的药物对8匹由于肌腱(在于骨骼相连的部分进行变性改变)导致软组织肿胀的马进行治疗。为了制备该药物，根据本发明的容器是含有金颗粒的注射器形式，其装满了来自动物的血液，并在37°C范围的温度下培养24小时。在培养期的末期，药物以在注射器中的血液形式完成，含有在该期间合成和积聚的蛋白质，尤其是细胞因子和凝胶溶蛋白，以及金颗粒，其可以直接并立刻使用。由于药物在注射器中制备，其可以通过注射向动物给药，而无需转移，因此没有污染的风险和物质损失。对于目前的研究，对于每匹马，在时间TO制备四份该药剂，即将四个含金颗粒的注射器装满来自动物的血液，并在37°C范围的温度下培养24小时。在每个案例中，该药物注射剂每隔一星期就向每匹马给药。第一次给药在时间T24进行，第二、三、四次在I周 、2周、3周后进行。用于第二、三和四次给药的含药物的注射器在零下20°C下储存直至使用。在I周、2周、3周、3个月、6个月和I年后检查肿胀的状态，并用0_5的等级鉴定(0=完全没有肿胀，5=大量肿胀)。在全部8个案例中，在仅3周后发现肿胀明显减少，在6个月，甚至I年后，所有的马匹完全没有肿胀。在治疗中，完全没有发现副作用。该研究的结果在图3中图示。B)残疾在进一步的马匹研究中，对存在残疾临床症状的11匹马(12个影响的末端)用根据本发明的药物进行治疗。残疾的医学原因是，在6个案例中，在关节中存在变性软骨改变(η = 6)，在6个案例中，存在软组织疾病(η = 6)。为了制备该药物，对于每匹马，将四个含有金颗粒的注射器形式的根据本发明的容器再次装满来自动物的血液，并在37°C范围的温度下培养24小时。在培养期的末期，药物基本以在注射器中的血液形式完成，含有在该期间合成和积聚的蛋白质，尤其是细胞因子和凝胶溶蛋白，以及金颗粒。为了最小化注射体积，通过在接下来的离心方法中，通过在5000rpm下离心10分钟以移除细胞成分。仅将各自的上清液用于注射。在每个案例中，该药物注射剂每隔一星期就向每匹马给药。第一次给药在时间T24进行，第二、三、四次在I周、2周、3周后进行。用于第二、三和四次给药的含药物的注射器在零下20°C下储存直至使用。在1、2、3周、3个月、6个月和I年后检查残疾的状态，并用0_4的等级鉴定(0=完全没有残疾，5=大量残疾)。
在全部12个案例中，在仅3周后发现残疾明显减少，在6个月，甚至I年后，所有的马匹完全没有症状。在治疗中，完全没有发现副作用。该研究的结果在图4中图示。实施例3 :制备根据本发明的含金颗粒的容器使用的金颗粒是金粉末(颗粒尺寸lym, Bio-Rad Laboratories, Munich)。仅可以首先进行无菌化，如制造商推荐的将需要量的金颗粒/金粉末，例如是30mg，与lml70%乙醇混合，在缓慢搅拌(混合器，涡流器)下培养10分钟，在沉淀后简单地离心I分钟，接着移出上清液。然后，在每个案例中，用Iml无菌两次蒸馏水洗涤金颗粒三次。在最后一次洗涤过程后，通过之后的离心和倾析上清液，将金颗粒在无菌PBS中再次悬浮，并调整成期望的浓度，例如60mg/ml。在连续搅拌下，使用移液管移出10 μ I金颗粒溶液，并转移至S-Monovette-来自 Sarstedt (REF02. 1726. 001)的 neutral/9ml (92X 16mm)η 先在无菌工作台(screw cap)中打开该monovettes,向内注射器壁中加入10 μ I金颗粒溶液,接着再次关上。填充的monovettes在室温下储存直至使用。在进行根据本发明的方法需要使用时,将9ml体液(例如血液)注入准备好的monovettes,并与金颗粒/PBS溶液混合。实施例4 :在人体中的药效研究作为预期的长期研究的一部分，将患有放射学检测的膝关节疾病的九个患者或十三个关节由注册医师治疗。关节病的程度用根据Kellgren-Lawrence-Klassifkation(Kellgren J. H. and Lawrence J. S. RadiologicalAssessment ofOsteo-Arthrosis”，Ann. rheum. Dis. (1957), 16, 494-501)的等级 3-4 鉴定。所有的患者均每隔一周，接受向四次关节内注射根据本发明的内源血清，其先用金进行处理，然后去除颗粒。如果存在关节内积水，在每个案例中，均需在注射前排出，对排出量进行记录，将Iml等分试样在零下20°C冷冻以做进一步的处理。对在治疗前以及使用确认点评价体系(同义词:分数)“K00S” (Roos E. M. , Roos H. P. , Lohmander L. S. , Ekdahl C. , BeynnonB.D. : “Knee Injury andOsteoarthritis Outcome Score (KOOS - development of aself-administered outcomemeasure，，，J. Orthop. Sports Phys. Ther. 1998, 28:88-96)进行治疗后1、3、6、12个月的治疗临床结果进行记录。最大的可得点数量为100。点的数量越多，获得的结果就越好。结果在图5中图示。对参数“症状”和“活动能力”的K00S分数的评估显示，在3和6个月后，临床症状得到明显改进(参见图5)。在一个患者中，开始存在大量积水。在每次注射治疗前均将积水排除，对积水量进行记录，并对滑液析出物测试其凝胶溶蛋白浓度。由于凝胶溶蛋白浓度取决于积水系统的程度，因此凝胶溶蛋白浓度基于脲浓度(Kraus et al. :Urea asa PassiveTransport Marker for Arthritis Biomarker Studies, ARTHRITIS&RHEUMATISMVol. 46, No. 2, February 2002，pp. 420-427)。结果在图 6 中图示。通过关节内给药根据本发明制备的血清，即在用金颗粒培养，然后移除(所有的)颗粒的血清，可以明显提高关节内凝胶溶蛋白浓度(参见图6)。同时，积水的量减少(参见图6 )，在临床症状上也得到明显改进。因此，该研究提供了用于治疗关节病，通常是与凝胶溶蛋白缺失有关的疾病的药物用途。
实施例5 :根据本发明的药物在体内软骨冲击模型中的软骨保护效果的证据在关节病发展期间，在关节软骨中施加过量的机械负荷的影响是众所周知的。也已经建立和确定了体外模型，其能测试在软骨骨骼组织上施加机械负荷的影响，例如来自 Huser 和 Davies 的模型(Huser C. A. and Davies Μ. Ε. : ^Validationof an in vitrosingle-1mpact load model of the initiation of osteoarthritis-like changesinarticular cartilage”，J Orthop Res·，Apr 2006; 24 (4) : 725-732)。在该模型中，开始软骨变性的良好指示是测量用于测试的软骨骨骼试样的培养介质中的蛋白多糖。在完成本发明的研究过程中，在迷你猪“O'lllmgCT Minipig”的动物实验研究中，在6头动物中，通过分别包含IO3金颗粒的9ml注射器，在每头动物中收集(9ml)血液，并根据本发明的方法，在37°C下培养24小时。在培养期后，在注射器圆通中离心血液试样，对于每一个注射器(或注射器圆筒)，通过无菌过滤器，将上清液移至清洁/新的无金颗粒的注射器圆筒中。在收集血液试样的同时，在无菌条件下，从各个股骨头收集软骨骨头试样并切割成8X8X8mm (长/宽/高)的块。在所有的组织中，软骨肉眼观察均是完好无损的。在冲击实验以前，将软骨骨头试样块放置在补充了 10%人类血清(HS)，100U/ml盘尼西林，100 μ g/ml庆大霉素和1. 25U/ml两性霉素的DMEM介质中。在试样收集的当 天进行冲击试验。出于该目的，将软骨骨头试样块/组织在无菌条件下排列在由聚甲基丙烯酸甲酯构成的圆形自由脱体管(滴下管)中，并高度为33cm，轴向在冲击盘下方4cm。冲击盘为如下形式高度为5cm，直径为3. 94cm，重量为493g。冲击盘(冲击塞)通过线与实际冲击盘(冲击单元)相同，该盘重量为7g，高度/厚度为1cm，且直径为0. 6cm。冲击在每一个软骨骨头试样块放置在“滴下管”后进行，其中，具有冲击塞的冲击盘(冲击器)的自由壁离试样的高度为15cm。冲击在28. 3mm2的软骨表面上佳佳0. 736J。软骨骨头试样块/组织分成如下三部分·没有进行冲击处理的组织=“非冲击对照” =“O对照”·进行了冲击处理的组织=“冲击过的对照”=“冲击对照” 进行了冲击处理，然后用根据本发明制备的富蛋白质血液血清进行培养的组织。在冲击处理后，处理的软骨产物以及O对照用PBS清洗三次，并移送至12颈培养盘中。每一个组织均提供3ml个字的处理介质，并在标准条件(37°C，5%C02)下，在培养期中培养。培养介质每72小时进行更换。根据本发明制备的富蛋白质血液血清在培养器中，在第O天和第7天添加组织群。在第2、7和14天时，对所有的测量标本测量培养介质中的蛋白多糖含量。因此使用来自 Biocolor Ltd. (Carrickfergus, UK)的 Blyscan GlycosaminoglycanAssay。结果在图7中图示。蛋白多糖释放的分析示出，在所有三个组中，即O对照和两个冲击处理/冲击组织/软骨产物，蛋白多糖量在一定时间后增加。然而，在使用根据本发明的富蛋白血液血清处理的组织/软骨产物中，该提高仅比非冲击对照(O对照)稍高，然而，没有响应血清处理的冲击处理/冲击组织(软骨产物)显不出非常闻的提升。
因此，该试验提供了根据本发明药物的软骨保护效果的证据。表1:多参数分析方法
权利要求
1.一种在容器中制备至少一种治疗性蛋白质或蛋白质混合物的方法，其中装有体液，并进行培养，且在体液中形成治疗性蛋白质，其特征在于，容器含有金颗粒。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，金颗粒在体外培养后，从体液移除并抛弃。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，金颗粒和身体细胞以及其他不溶的积聚物在体外培养后，从体液移除并抛弃。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于，金颗粒具有规定的尺寸，尤其是微粒和/或纳米颗粒。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其特征在于，在容器中，金颗粒的量是每Iml体液为O.1mg-1Omg,优选每Iml体液为O. 3mg。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其特征在于，金颗粒的尺寸为Iμ m，每IOml的金颗粒量为103-104。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其特征在于，容器是注射器。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其特征在于，容器是密封袋。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其特征在于，体液是血液。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其特征在于，装有体液的容器在200C -41°C，优选37°C的温度下，培养12-72小时，优选24小时。
11.根据权利要求ι- ο中任一项所述的方法，其特征在于，治疗性蛋白质是凝胶溶蛋白。
12.—种在体液中体外生物合成和积聚(体外诱导)治疗性蛋白质的容器，其特征在于，容器含有金颗粒，其适于收集、储存和再分散体液试样，并能与中空针管相连，使得其所含物能够通过中空针管进行注射。
13.根据权利要求12所述的容器，其中，金颗粒具有规定的尺寸，尤其是微粒和/或纳米颗粒。
14.根据权利要求12或13所述的容器，其特征在于，在容器中，金颗粒的量是每Iml体液为O.1mg-1Omg,优选每Iml体液为O. 3mg。
15.根据权利要求12-14中任一项所述的容器，其特征在于，容器是注射器。
16.根据权利要求12-14中任一项所述的容器，其特征在于，容器是密封袋。
17.根据权利要求12-16中任一项所述的容器，其特征在于，体液是内源或同源血液。
18.根据权利要求12-17中任一项所述的容器，其特征在于，治疗性蛋白质是凝胶溶蛋白。
19.一种用作药物的物质混合物,其由内源或同源血液和金颗粒组成。
20.根据权利要求19所述的物质混合物，其特征在于，凝胶溶蛋白的含量至少是相应的凝胶溶蛋白的血液标准值的两倍。
21.根据权利要求19或20所述的物质混合物，其特征在于，该药物适合并认为能够用于治疗与凝胶溶蛋白相关的疾病。
22.根据权利要求19或20所述的物质混合物，其特征在于，该药物适合并认为能够用于治疗与组织变性有关的疾病。
23.根据权利要求22所述的物质混合物，其特征在于，疾病是关节病，且该药物适合并认为能够用于治疗关节病。
24.用作药物的富细胞因子和富凝胶溶蛋白血液血清，其特征在于，在含有金颗粒的容器中收集血液血清，培养该血液血清与金颗粒组成的混合物，接着将金颗粒由血清移除并抛弃。
25.根据权利要求24所述的血液血清，其特征在于，凝胶溶蛋白的含量至少是相应的凝胶溶蛋白的血液标准值的两倍。
26.根据权利要求24或25所述的血液血清，其特征在于，金颗粒和血液细胞以及其他不溶成分从血清移除并抛弃。
27.根据权利要求24-26中任一项所述的血液血清，其特征在于，金颗粒尺寸为约I μ m0
28.根据权利要求24-27中任一项所述的血液血清，其特征在于，-每IOml容器的金颗粒量为IO3-1O4,或每Iml血液/容器存在O. 3mg具有I μ m直径的金颗粒。
29.根据权利要求24-28中任一项所述的血液血清，其特征在于，该药物适合并认为能够用于治疗与组织变性有关的疾病。
30.根据权利要求29所述的血液血清，其特征在于，疾病是关节病，且该药物适合并认为能够用于治疗关节病。
31.根据权利要求24-28中任一项所述的血液血清，其特征在于，该药物适合并认为能够用于治疗与凝胶溶蛋白缺失相关的疾病。
全文摘要
本发明涉及一种在容器中制备至少一种治疗性蛋白质或蛋白质混合物的方法。在该方法中，容器装有体液和金颗粒，并进行培养，且在体液中形成治疗性蛋白质。
文档编号A61P19/02GK103037873SQ201180033707
公开日2013年4月10日 申请日期2011年6月21日 优先权日2010年7月7日
发明者尤里奇·施耐德 申请人:阿尔特罗根股份有限公司, 尤里奇·施耐德