专利名称：稳定的因子viii变体的制作方法
技术领域：
本发明涉及修饰的凝血因子。具体地说，本发明涉及与半衰期延长部分缀合的稳定的因子VIII分子。本发明还涉及这类分子的用途。
背景技术：
A型血友病是因凝血因子VIII (FVIII)活性缺乏或功能障碍所引起的一种遗传性出血性疾病。临床表现不在于最初的止血，即血块形成正常发生，而是血块因后继凝血酶形成不足而不稳定。通过静脉内注射从血液中分离的或重组产生的凝血因子FVIII来治疗该病。目前的治疗建议从传统的按需治疗转向预防。与冯维勒布兰德因 子(von WillebrandtFactor)结合的内源FVIII的循环半衰期是12-14小时，因此预防性治疗应一周进行数次，以使患者获得几乎无症状的生活。对于许多人，尤其是儿童和年轻人而言，IV给药伴随明显的不便和/或疼痛。在具有显著延长的循环半衰期的因子VIII变体的开发中已经采用了多种方法。很多这类方法都涉及将因子VIII与亲水聚合物例如PEG (聚乙二醇)缀合在一起。W003031464公开了酶促方法，其中PEG基团可与存在于多肽上的聚糖连接。Blood-2009-11-254755公开了 PEG基团可与之特异性缀合的表面暴露的Cys残基的引入。从W002103024得知FVIII分子的二硫键的引入。然而，包含二硫键的这类FVIII变体却的确不引起体内循环半衰期延长。因此本领域需要具有因子VIII活性和显著延长的体内循环半衰期的FVIII变体。发明概述
本发明涉及具有FVIII活性的重组FVIII变体，其中FVIII变体与半衰期延长部分缀合，且其中在FVIII变体中引入氨基酸变化，以提高变体的体外稳定性。本发明还涉及这类分子在治疗中的用途。与wt因子VIII相比，本发明的分子具有显著延长的体内循环半衰期。附图
简述
图I.在不同浓度的野生型FVIII和变体中获得的凝血酶活性的最高水平。数据是得自5个独立实验的数据的平均值和SEM，其每个数据均归一化至由2. 7 nM野生型FVIII得到的速率。发明详述 定义
冯维勒布兰德因子(vWF) vffF是存在于血浆中并在内皮(在怀布尔-帕拉德体中)、巨核细胞(血小板a-颗粒)和内皮下结缔组织中组成型产生的一种大的单聚/多聚糖蛋白。其主要功能是与其它蛋白质、特别是与因子VIII结合，并且它对血小板粘附于受伤部位是重要的。因子VIII与vWF结合的同时在循环中失活；因子VIII当未与vWF结合时快速降解或被清除。由此断定，降低或消除FVIII的vWF结合能力可被认为是在获取具有延长的循环半衰期的因子FVIII变体中极不理想的方法。然而如果该分子与半衰期延长部分缀合，则可能通过位点定向诱变降低或消除vWF。因子VIII中负责与vWF结合的区域是如EP0319315中公开的跨越残基1670-1684的区域。预期涉及该区域的因子VIII点突变体和/或缺失突变体可改变与vWF结合的能力。本发明特别优选的点突变的实例包括包含一个或多个下列点突变的变体Y1680F、Y1680R、Y1680N、E1682T和Y1680C。因子VIII分子FVIII/因子VIII是主要由肝细胞产生的一种大而复杂糖蛋白。FVIII由2351个氨基酸组成，包括信号肽，并含有由同源性限定的若干不同结构域。有3个A结构域、I个独特的B结构域和2个C结构域。结构域的顺序可列为NH2-A1-A2-B-A3-C1-C2-C00H。FVIII在血浆内作为在B-A3边界处被分隔的2条链而循环。这两条链通过二价金属离子结合而连接。A1-A2-B链称为重链(HC)，而A3-C1-C2称为轻链(LC)。本文所用“因子VIII”或“FVIII”是指作为内在凝血途径的成员并对凝血是至关重要的人血浆糖蛋白。“天然FVIII”是如SEQ ID NO. I (氨基酸1-2332)所示的全长人FVIII分子。B结构域跨越SEQ ID NO I中的氨基酸741-1648。SEQ ID NO I (WtAFVIII) ATRRYYLGWELSWDYMQSDLGELPVDARFPPRVPKSFPFNTSWYKKTLFVEFTDHLFNIAKPRPPWMGLLGPTIQAEVYDTWITLKNMASHPVSLHAVGVSYWKASEGAEYDDQTSQREKEDDKVFPGGSHTYVWQVLKEMGPMASDPLCLirYSYLSHVDLVKDLNSGLIGALLVCREGSLAKEKTQTLHKFILLf AVf DEGKSWHSETKNSLMODRDAASARAWPKIVfHTVNGYVNRSLPGLIGCHRKSVYWHVlGMGITPEVHSlFLEGHTFLVRNHRQASLEISRTFLTAaTLLMDLGQFLLFCHiSSHQHD 義 EAWKVDSCPEEPOl 剛 KMWEEAEDYDDOITDSEWWVRFDDDNSPSF1QIRSVAKKHFKTWVHTIAAEEEDWOYAPLVLAPDDRSYKSQYLMNGPQRIGRKYKKVRFMAYTDETFKTREAIQHESG1LGPLLYGEVGDTLL1IFKNQASRPTMIYPHGITDVRPLYSRRLPKGVKHLKDFPIIPGEIFKYKWTVTVEDGPTKSDPRCURYYSSFVNMERDLASGUGPLLICYKESVDQRGNQIMSDKRNVILFSVFDENRSWYLTENIQRFLPNPAGVQLEDPEFQASNIMHSIMGYVFOSLQLSVCLHEVAYWYILSiGAQTD-FlSVFFSGYTFKHKMVTEDTLTLFPFSGETVFMSMENPGLWlLGCHMSDFRNRGMTALLKVSSCDKfSlTGDYYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFSQNSRHPSTRQKQFNATTtPENDIEKTDPWFAHRTPMPKIQNVSSSDiLMLLRQSFTWGLSLSDLQEAKYETFSDDPSPGAIDSNNSLSEMWRPQLHHSGDMWTPESGLQLRLNEKLGTTAAm 眺 DFKVSSTSNNUS 了 PSDNLMGTONTSSLGPPSMPVHYDSQLDTTLFGKKSSPITESGGPLSLSEENNDSKLLESGLMMSQESSWGK_SSTCSGRLFKGKRAHGPALLTKDNALFKVSiSLLKTNKTSNNSATJMRKTHIDGPSLLlENSPSVWQNILESDTEFKKVTPLIHDRMLMDKfSIATALRLNHMSNKTTSSKNMEMVQQKKEGPIPPDAQNPDMSFFKMLFLPESARWIQRTHGKNSLNSGQGPSPKQLVSLGPEKSVEGQNFLSEKNKVWGKGEFTKDVGLKEMWPSS 刚 LFLTNLDNLHENNTHNOEK^OEEIEICKETltOENVVLPOIHTVTCmNFMKNLFLLSTRQNVEGSYDGAYAPVLQDFRSLNDSTORTKKHTAHFSKKGEEENLEGLGMQTKQiVEKYACTTRISPNTSOCWFVTOFISKRALKCIFRLPLEETrELEKRHVDDTSTaWSKNMKHLTPSTLTQlDYNEKEKGAITQSPLSDCLTRSHSIPQA.NRSPLPIAKVSSFPSfRPiYLTRVLFQDNSSHLPAASYRKKDSGVQESSHFLQGAKK_LSUMlTLEI\rrGDQREW3SLGTSAJMSVTYKK/EMTVtPKPDLPKTSGKVELLPKVHSYQKDLfPTETSNGSPGHLDlVEGSlLQGTEGAlKWNEANRPGKVPFlRWTESSAKTPSKllDPLAWOWWGTOIPKEEWKSCIEKSPEKmFKKKDinLSLNACESNHAWWNEGQNKPBEVTWAKQGRTERLCSQNPPVIKRHQREITRTTLQSDQEE 靈 D
权利要求
1.具有FVIII活性和增加的体外稳定性的重组FVIII变体，其中所述FVIII变体与半衰期延长部分缀合，且其中已将导致体外稳定性增加的氨基酸变化引入所述FVIII变体中。
2.权利要求I中任一项的重组FVIII变体，其中所述变体包含二硫键。
3.权利要求2的重组FVIII变体，其中所述二硫键与FVIII变体的两个结构域共价连接。
4.权利要求2的重组FVIII变体，其中所述二硫键将重链与轻链连接在一起。
5.权利要求1-4中任一项的重组FVIII变体，其中所述FVIII变体包含用疏水氨基酸残基进行的氨基酸取代，且其中所引入的疏水氨基酸残基提高疏水相互作用和FVIII变体 的体外稳定性。
6.权利要求1-5中任一项的重组FVIII变体，其中所述变体包含呈带正电荷和带负电荷的氨基酸残基形式的氨基酸取代，且其中所引入的带电荷残基提高静电相互作用和FVIII变体的体外稳定性。
7.权利要求1-6中任一项的重组FVIII变体，其中所述变体是B结构域截短的变体。
8.权利要求7的重组FVIII变体，其中侧基与位于截短的B结构域中的O-聚糖连接，且其中所述侧基在所述FVIII变体激活时被去除。
9.权利要求7-8中任一项的重组FVIII变体，其中在所述FVIII中，其中B结构域的序列如SEQ ID NO 2所示。
10.权利要求1-9中任一项的重组FVIII变体，其中所述半衰期延长部分选自亲水聚合物、抗体或其抗原结合片段、Fe结构域、多肽和脂肪酸或脂肪酸衍生物。
11.权利要求1-10中任一项的重组FVIII变体，其中所述变体包含SEQID NO 3的氨基酸序列。
12.权利要求1-11中任一项的重组FVIII变体，其中所述变体包含以下取代S149C和E1969C。
13.权利要求1-11中任一项的重组FVIII变体，其中所述变体包含以下取代D666C和S1788C。
14.药物组合物，其包含权利要求1-13中任一项的FVIII变体。
15.权利要求1-13中任一项的FVIII变体或权利要求14的组合物用于治疗血友病的用途。
全文摘要
本发明涉及修饰的凝血因子。具体来讲，本发明涉及与半衰期延长部分缀合的稳定的因子VIII分子以及所述分子的用途。
文档编号A61K47/48GK102971006SQ201180034829
公开日2013年3月13日 申请日期2011年7月6日 优先权日2010年7月15日
发明者H.奥斯特加尔德, M.克贾尔克, O.H.奥尔森, L.蒂姆, H.R.施滕尼克 申请人:诺沃—诺迪斯克有限公司