专利名称：电穿孔电极构造和方法
电穿孔电极构造和方法相关申请参照本申请根据35U. S. C. § 119(e)要求2010年6月3日提交的美国临时专利申请No. 61/351，235和2011年4月I日提交的美国临时专利申请No. 61/470，975的优先权，其公开内容通过引用整体结合于此。
背景技术：
电穿孔是由于电场引起的细胞膜脂双层的透化。尽管未完全理解导致电穿孔的物理机制，但相信电穿孔引发电场显著增加细胞膜处的电势差，导致形成瞬间或永久的孔。孔形成的范围主要取决于脉冲电场的强度和持续时间，导致膜透化可逆或不可逆，作为电穿孔引发电场的强度和时间参数的函数。可逆电穿孔通常用于将诸如蛋白质、DNA和药品之 类大分子的传送到细胞，而不可逆电穿孔的破坏特性使其适用于巴氏杀菌或消毒。可逆电穿孔所需的典型电场强度的范围从约100V/cm至450V/cm。在不可逆电穿孔中，所需的电场范围可从200V/cm至高达60000V/cm。如图I所示，典型的电穿孔设备具有粗略地彼此相对的电极(E)。在典型的电穿孔方法中，目标细胞被置于电极之间，将脉冲电压或电流或交流电压或电流施加在电极上以便在电极之间的体积中弓I发所需的电穿孔电场。产生的相关电穿孔电场粗略地正比于电穿孔电极之间的电势差并且反比于电极(E)之间的距离(d)。在这种典型的电穿孔电极构造中，电极之间的距离受到待电穿孔的细胞的尺寸的数量级或待电穿孔的体积的尺寸限制。当需要高电场时，诸如不可逆电穿孔，传统的设计原理导致需要电穿孔电极两端的高电势差。电极之间的大电势差具有缺点。它们包括需要能够产生这些大电势差并以精确模式传送的电源。这些设备可能制造昂贵并且浪费能源。此外，大电场所需的电势差通常大到足以导致水电解，致使电极耗尽和气泡形成或放电，这些都会不利地影响电穿孔过程。期望开发一种电极构造，该电极构造能够以电极之间的低电势差传送高电场。
发明内容
本文介绍一种新的电极设计原理，该原理能以电极之间的低电势差实现高电场。中心思想是在奇点产生高电场。因此，产生奇点的电极构造能以电极之间的低电势差产生闻电场。本文中提供的概念是“基于奇点的构造”电极设计和方法能以电极之间的低电势差在离子物质中产生局部高电场。本文描述的基于奇点的构造包括阳极电极；阴极电极；以及置于阳极电极和阴极电极之间的绝缘体。基于奇点的电极设计概念涉及其中阳极和阴极彼此相邻、基本共面地放置且由绝缘体分开的电极。基本共面的阳极/绝缘体/阴极构造限制感兴趣的体积的一个表面，并且局部地产生期望的电场，即，在阳极和阴极之间的界面附近。在理想的构造中，阳极和阴极之间的界面尺寸趋向于零，且变为奇点。使用基于奇点的电极构造的一种可能的方法的示例包括用于电穿孔的设备(I)提供包括一系列的共面阳极电极和阴极电极的通道，其中相邻的阳极电极和阴极电极由绝缘体分离；(2)使电解液流过微电穿孔通道；(3)使细胞流过微电穿孔通道；以及(4)在相邻的阳极电极和阴极电极之间施加电势差。使用基于奇点的电极构造的其它电穿孔构造是可能的。对利用基于奇点的电极的局部高电场的其它应用也是可能的。附图简述包含在本文中的附图构成本说明书的一部分。附图与说明书一起还用于解释所介绍的系统和方法的原理，并使本领域的技术人员能够利用所介绍的系统和方法。在附图中，类似的附图标记表示相同或功能相似的元件。图I是典型的电穿孔电极构造的示意图。图2A是具有由小绝缘体分离的相邻电极的微电穿孔构造的电场流线的示意图。图2B是根据本文介绍的一个实施例的电极构造的示意图。
图3是根据本文介绍的一个实施例的电极构造的制备的示意图。图4 (a)是微电穿孔通道构造的示意图。图4 (b)示出在不存在细胞的情况下的模型域。图4 (C)示出在存在细胞的情况下的模型域。图5示出在微电穿孔通道中生成的径向改变的电场。图6示出在具有较小高度的微电穿孔通道中存在多大的电场量值。图7示出对于小A值，大的无量纲电场轮廓更加聚焦，并且跨越微电穿孔通道的整个高度。图8示出在存在细胞的情况下，无量纲电场轮廓如何因绝缘细胞膜而被压缩。图9示出当细胞半径增加时，细胞如何经历指数增大的无量纲电场量值。
图10示出模型域中的温度分布。图11示出在模型域中流动电解液速率箭头。图12示出对于电极之间O. IV电势流过O. 6 μ m高微电穿孔通道的肠毒素大肠杆菌(ETEC，一种类型的大肠杆菌)细胞。图13示出对于电极之间O. IV电势流过4. 2 μ m高微电穿孔通道的酵母细胞。图14示出对于减少的无量纲绝缘体长度，作为距绝缘长度的中心线的表面的高度(Y)的函数的电场。图15示出在大肠杆菌流过通道中的100纳米绝缘体时在大肠杆菌上形成的电场。图16示出在酵母细胞流过通道中的100纳米绝缘体时在酵母细胞上形成的电场。图17是示出二次电流分布模型参数的表。图18示出对于各相对绝缘体厚度(I)和域纵横比(A)在X=O. 5, Y=I处无量纲电场(NDE)的量值。图19示出在二次电流分布模型中沿绝缘体正上方的中心线的电场量值。图20示出对奇点引发的微电穿孔构造的功率输入如何取决于施加的电压和水电导率。图21示出直流电穿孔设备。图22示出二次电流分布模型域的示意图。图23示出沿y中心线的电场量值。图24示出作为负载电压的函数的功率密度。
具体实施例方式本文介绍的是基于奇点的电极构造，其能够在电解液中产生局部高强度电场。在本发明的背景下，奇点是其中在感兴趣的域中或周围且与该感兴趣的域接触的电势分布中存在不连续性的点。在设计极限下，这种不连续性具有零几何尺寸。图I与图2A、2B之间的比较分别示出先前的电极设计概念(图I)和当前的概念(图2A和2B)之间的差别。图I示出设计成在电解液的体积中产生电场的典型构造。在典型的构造中，感兴趣的体积被限制在电极之间。电场与电极之间的电压差成正比，并且与电极之间的距离成反比。有可能通过减小电极之间的距离和/或通过增加电极之间的电势差来增加感兴趣的体积中的电场。原则上，在极限条件下，当电极之间的距离接近零时，可由电极之间的有限电势差产生无限电场。然而，由于感兴趣的体积在电极之间，所以电极之间的距离为零的构造没有效用。在图2A和2B中示出的新的设计概念建议两个电极基本上置于同一平面，限定感兴趣的电解液体积的表面。阳极和阴极通过绝缘间隙分离。在该构造中，在电解液与阳极/绝缘体/阴极之间的界面处的局部电场也是绝缘体的尺寸及阳极与阴极之间的电势差的 函数。然而，在该构造中，感兴趣的体积限制在电极的外表面上，而不是限制在电极之间。因此，在理想的构造中当绝缘体尺寸极限接近零时，电极之间的界面变为奇点，并且在电解液中，电极之间的无穷小的最后电势差将在奇点处产生无限高的电场。这种构造因此有助于利用小的电势差在感兴趣的体积中生成非常高的电场。图2A通过示出从两电极之间的奇点起源的恒定电场线说明这种设计的效用。图2A示出受基于奇点的电极影响的体积是真实且可预测的，因此该电极设计可用于以感兴趣的体积中的低电势差产生高电场。微米和纳米技术的进步可用于产生基于奇点的构造。图3示出这种设计。该设计基于电绝缘表面，诸如玻璃。诸如金或钼之类的导体通过气相沉积而沉积在玻璃表面上。所沉积的层的厚度的范围从几纳米至数微米。在所沉积的金属中生成至玻璃表面的切口产生电极之间的绝缘间隙。电解液可置于面对两个电极和间隙的结构的表面上，且在间隙中产生闻电场。聚焦激光束可用于产生切口，其宽度为几微米。很多光刻技术能够产生亚-IOOnm特征，且能用于在微电穿孔通道中形成绝缘体。浸入光刻是一种光刻增强技术，这种技术将折射率大于I的液体置于最终透镜与晶片之间。当前的浸入光刻工具能够形成低于45nm的特征尺寸。另外，电子束光刻(使用传播电子束的一种光刻)可形成小于IOnm的特征。可在各种构造下使用图2A、2B和3中描述的设计。典型的构造通常包括在由小绝缘体分离的两个相邻电极上方放置或流动的电解液。如图2A所示，在相邻电极之间施加小的电势差导致从绝缘体起源的径向变化的电场。电场可用于电穿孔悬浮在电解液中的细胞。有很多采用基于奇点的电极设计的可能设计。例如，可用这种材料涂覆搅拌器刀片以保持该刀片的无菌状态。或者，可用这种设计涂覆容器壁以通过产生电场来维持该壁的无菌状态。尽管基于奇点的设计用于电穿孔，然而具有在电解液中以低电势差局部产生高电场的能力的优点可用于深度脑植入、起搏器和其它医疗应用。作为基于奇点的电极的各种可能应用的更详细说明，我们将更详细且作为示例描述“微电穿孔”通道形式的构造。如图4 (a)和5所示，使构造成镜像并且串联地放置形成具有多个电场的微电穿孔通道。流过该通道的细胞将经历脉冲电场。可通过改变通道的高度来调节该电场的量值。此外，调节电解液流速改变悬浮在电解液中的细胞经历电场的持续时间。形成二维稳态一次电流分布模型以理解微电穿孔通道几何和细胞尺寸对流动的电解液中的电场的影响。在没有细胞的情况下，降低微电穿孔通道高度导致通道中心中电场量值的指数增加。另外，细胞在其更接近微电穿孔通道壁时经历指数增加的电场量值。所介绍的微电穿孔通道在若干方面不同于传统的宏观电穿孔设备及微电穿孔设备。在具有相对电极的电穿孔设备中，细胞的接近度与其将经历的电场量值无关。相反，在所介绍的微电穿孔通道中，细胞经历的电场量值由细胞和通道壁之间的间隙规定。因为这样，细胞大小不影响实现期望的电场所需的电势差。所介绍的微电穿孔通道和传统的宏观电穿孔设备和微电穿孔设备之间的另一个差别是需要较少的电设备。传统的宏观电穿孔设备和微电穿孔设备需要脉冲发生器和电 源。然而，在所介绍的微电穿孔通道中，不需要脉冲发生器，因为它包含一系列相邻电极。此夕卜，因为所介绍的微电穿孔通道仅需要小的电势差，所以需要很小的电源(诸如电池)。电穿孔的简单性使其成为强大的技术。所介绍的微电穿孔通道增加电穿孔的可用性，使其可用于广泛的非传统应用。在一个实施例中，提供微电穿孔通道构造。该通道构造通常包括阳极电极；阴极电极；以及置于阳极电极和阴极电极之间的绝缘体。阳极电极、绝缘体和阴极电极沿微电穿孔通道的一侧定位成共面。该构造还可包括在阳极电极、绝缘体和阴极电极上流过通道的电解液。可提供流速控制系统以改变电解液穿过通道的流量。在一个实施例中，绝缘体将阳极电极与阴极电极分离少于200nm或少于lOOnm。在另一个实施例中，绝缘体使阳极电极与阴极电极分离约lOOnm。还可提供电池电源，避免使用脉冲发生器。在另一个实施例中，微电穿孔通道构造包括相对于第一阳极电极定位在通道的相对侧上的第二阳极电极；相对于第一阴极电极定位在通道的相对侧的第二阴极电极；以及置于第二阳极电极和第二阴极电极之间的第二绝缘体。第二阳极电极和第二阴极电极通常彼此相对共面。这样，电极构造形成通道，其中传递用于电穿孔的细胞。在又一个实施例中，提供一种构造，其中离子物质被包含基于奇点的电极构造的构造限定在一侧，该基于奇点的电极构造是离子物质置于其上的平板或基本平板形式的。在另一个实施例中，提供一种构造，其中离子物质被基于奇点的电极构造围绕，该基于奇点的电极构造是离子物质被设置于其中或穿过其中流动的通道或容器形式的。在奇点处的电场可适用于在离子物质的细胞中产生可逆或不可逆电穿孔。可逆电场从50V/cm 至 1000V/cm、100V/cm 至 450V/cm、DC 或 AC。不可逆电场从 50V/cm 至 100，000V/cm、从200V/cm 至 30kV/cm。在又一个实施例中，提供电穿孔的方法。该方法一般包括(I)提供包括一系列的共面阳极电极和阴极电极的微电穿孔通道，其中相邻的阳极电极和阴极电极由绝缘体分离；(2)使电解液流过微电穿孔通道；(3)使细胞流过微电穿孔通道；以及(4)在相邻的阳极电极和阴极电极之间施加电势差。该方法可以进一步包括(5)改变电解液穿过微电穿孔通道的流速；以及(6)将阳极电极和阴极电极耦合到电池电源。每个绝缘体可使阳极电极与阴极电极分离小于200nm或小于IOOnm或约lOOnm。这种方法可用于诸如水消毒或细胞转染的应用。在另一个实施例中，提供微电穿孔通道构造，包括阳极电极；阴极电极；以及置于阳极电极和阴极电极之间的绝缘体，其中阳极电极、绝缘体和阴极电极沿微电穿孔通道的一侧共面定位。然后可提供在阳极电极、绝缘体和阴极电极上流过通道的电解液。绝缘体可使阳极电极与阴极电极分离5纳米至2微米。该微电穿孔通道构造还可包括选自下组的电源脉冲电势、AC电势和涉及电极和离子溶液的电解反应。离子溶液可以是包含细胞、活组织或死组织的生理溶液。在一个实施例中，电源耦合到电极且配置成传递适当的电流供应以便形成适当的电场。可调节电场以满足应用(例如，可逆电穿孔或不可逆电穿孔)。在一个实施例中，施加用于不可逆电穿孔的电场，而不导致对感兴趣的细胞的热损伤。传统的宏观电穿孔或微电穿孔具有缺点，这些缺点可由所介绍的微电穿孔通道解决。由于在宏观电穿孔中处理大量细胞，所以细胞透化的程度贯穿整体变化。尽管微电穿孔解决该问题，但它通常导致较低的通过量。所介绍的微电穿孔通道中的聚焦电场可利用通道几何形状来修改，提供了比宏观电穿孔设备更好的细胞透化控制。另外，通道的流过特 性使其适用于处理大量细胞。由所介绍的微电穿孔通道解决的另一个缺点是在传统宏观电穿孔设备和微电穿孔设备中对大的电解引发的电势差的需求。大多数宏观和微电穿孔设备具有相对电极，这导致与其分离距离成反比的均匀电场。尽管微电穿孔设备中的分离距离显著小于典型的电穿孔设备的分离距离，但它们受到细胞尺寸的限制。因此，需要大的电解引发的电势差来生成期望的电场。所介绍的微电穿孔通道包含由小的绝缘体分离的一系列相邻电极。施加小的非电解引发的电势差导致从小的绝缘体起源的一系列径向变化的电场。因此，仅需要小电源(诸如电池)。减少所选的电设备使得电穿孔可用于广泛的应用。电势应用无量纲模型示出各种尺寸的细胞可通过调节微电穿孔通道高度经历各种电场量值。此外，电解液流速可用于控制暴露时间。这些参数在细胞透化程度上实现大量控制，而不需要复杂的电设备，从而使这种概念能用于很多潜在的应用，包括水消毒和细胞转染。水消毒受污染的水可导致很多疾病，包括痢疾，占全球4%的死亡(220万)。在发展中国家，这些死亡中的大多数发生在5岁以下的儿童中，并且代表该年龄下所有儿童死亡的约15%。估计卫生和清洁干预将减少痢疾感染约四分之一至三分之一；然而，这需要使用消毒水，而消毒水是稀少的，尤其是在发展中国家的农村地区中。肠毒素大肠杆菌(ETEC，一种类型的大肠杆菌)2 μ m长、O. 5 μ m直径、杆状粪大肠菌，且是发展中国家痢疾的主导细菌原因。当前，接种疫苗是预防由ETEC导致的痢疾的最有效方法。然而，在ETEC是地方病的发展中国家，疫苗不可用。利用本文介绍的概念可利用不可逆电穿孔破坏ETEC。一次电流分布模型的尺寸形状的结果示出在流过在相邻电极之间具有O. IV电势差的O. 6 μ m高微电穿孔通道的中心的水中的ETEC细胞经历1000V/cm至10000V/cm间的电场量值，引发不可逆电穿孔(图12)。应注意，这是保守估计，因为与更接近电极流动的细胞相比，流过通道中心的细胞将经历相对低强度的电场。细胞转染
细胞转染是将大分子，主要是核酸和蛋白质引入到细胞的过程。这些大分子通常穿过由诸如电穿孔之类的化学和物理方法在细胞膜中形成的瞬间孔进入细胞。然而，由于该过程的体积性质，很难确定高转染效率和最小细胞死亡的最优电穿孔参数。传统的微电穿孔可解决该问题；然而，传统的微电穿孔不适于处理大量细胞。相反，本文介绍的微电穿孔通道的流过特性使其成为处理很多细胞同时维持对它们经历的电场的控制的理想选择。酵母是广泛用于基因研究的4 μ m直径细胞，因为它是用作代表性的真核模型的简单细胞。一次电流分布模型的尺寸形状示出流过具有电极之间O. IV电势的4. 2μπι高通道的酵母细胞经历可逆电穿孔引发电场量值，形成细胞转染所需的瞬间孔(图13)。通过使多个微电穿孔通道在彼此上面层叠，可增加吞吐量同时维持一致电场。示例以下段落用作上述系统的示例实施例。所提供的示例是预言的示例，除非明确另 外陈述。示例 I示例I的命名φ =电势(K=阳极电势Φ c=阴极电势Φ diff=电极之间的电势差L=有效电极长度H=微电穿孔通道高度的一半r=细胞半径Φ=无量纲电势Φ a=无量纲阳极电势
Φ。=无量纲阴极电势X=无量纲X坐标Y=无量纲y坐标A=通道纵横比R=相对细胞半径E=无量纲电场T=温度Qgen=体积热生成k=热导率P=密度Cp=恒压比热U=X-速度σ =电导率μ=动力粘度P=压力
图4 (a)是微电穿孔通道构造的示意图。图4 (b)示出在不存在细胞的情况下的模型域。图4 (c)示出在存在细胞的情况下的模型域。图5示出在微电穿孔通道中生成的径向改变的电场。形成二维稳态一次电流分布模型以理解微电穿孔通道几何和细胞尺寸对流动的电解液中的电场的影响。一次电流分布模型忽视电极表面处的表面和浓度损耗，仅考虑来自电解液的欧姆损耗的电场效应。因此，一次电流分布模型由拉普拉斯等式控制Ψφ = 0其中φ是电势。此外，假设电极表面处于恒定电势，形成相邻电极表面处的边界条件Φ a= Φ diff 对于{0〈x < L/2 y=0}φε=0 对于{L/2〈x 彡 L y=0}
其中(^和分别是阳极和阴极处的电势，Φ —是它们之间的电势差，且L是有
效电极长度。剩余的对称边界由以下控制
X = O O < y < H'
V<j) = 0 对于 < X = L 0<y<H >
O< X < L y 二 H其中H是微电穿孔通道的高度的一半。由于细胞膜的绝缘性质，流过微电穿孔通道的细胞被建模为电绝缘边界，等于对称边界。一次电流分布模型的无量纲化一次电流分布模型被无量纲化以分析微电穿孔通道几何和细胞尺寸对电解液中的电场的影响。在二维笛卡尔坐标中的拉普拉斯等式为
Γ Α—γ + —7 = 0
Sc4广将无量纲变量φ= Φ / Φ diffX=x/LY=y/H代入拉普拉斯等式得到无量纲形式刍+ [￡丫尝=0
3K2 KHJ m-定义无量纲几何参数(通道纵横比)
HA =—
L无量纲拉普拉斯等式变为
Γ IΛ~~- = 0
说2 A 2 cTT 2将无量纲变量代入边界条件得到Oa=I 对于{0〈X 彡 O. 5 Y=O}Oc=O 对于{O. 5<X ( I Y=0}
权利要求
1.一种基于奇点的电极构造，包括 阳极电极； 阴极电极；以及 置于阳极电极和阴极电极之间的绝缘体，其中阳极电极、绝缘体和阴极电极相对于彼此共面定位。
2.如权利要求I所述的基于奇点的电极构造，其特征在于，还包括 与阳极电极、绝缘体和阴极电极接触的离子物质。
3.如权利要求I所述的基于奇点的电极构造，其特征在于，所述绝缘体使阳极电极与阴极电极分离5纳米至5微米。
4.如权利要求I所述的基于奇点的电极构造，其特征在于，所述绝缘体使阳极电极与阴极电极分离50纳米至2微米。
5.如权利要求I所述的基于奇点的电极构造，其特征在于，所述绝缘体使阳极电极与阴极电极分离约100纳米。
6.如权利要求I所述的基于奇点的电极构造，其特征在于，所述绝缘体使阳极电极与阴极电极分离小于100纳米。
7.如权利要求I所述的基于奇点的电极构造，其特征在于，还包括 从下组选择的电源DC电源、AC电源、脉冲电势电源、电流脉冲电源和涉及电极和离子物质的电解液反应； 其中所述电源连接到电极。
8.如权利要求I所述的基于奇点的电极构造，其特征在于，还包括 从下组选择的感兴趣的物质包含细胞、体外组织以及体内组织的离子溶液。
9.一种微电穿孔通道构造，包括 阳极电极； 阴极电极；以及 置于阳极电极和阴极电极之间的绝缘体，其中阳极电极、绝缘体和阴极电极沿微电穿孔通道的一侧共面定位。
10.如权利要求9所述的微电穿孔通道构造，其特征在于，还包括在阳极电极、绝缘体和阴极电极上流过通道的电解液。
11.如权利要求9所述的微电穿孔通道构造，其特征在于，所述绝缘体使阳极电极与阴极电极分离50纳米至2微米。
12.如权利要求9所述的微电穿孔通道构造，其特征在于，还包括从下组选择的电源脉冲电势、AC电势和涉及电极和离子溶液的电解反应。
13.如权利要求12所述的微电穿孔通道构造，其特征在于，所述离子溶液是包含细胞、活组织或死组织的生理溶液。
14.如权利要求9所述的微电穿孔通道构造，其特征在于，还包括 相对于第一阳极电极定位在通道的相对侧的第二阳极电极； 相对于第一阴极电极定位在通道的相对侧的第二阴极电极； 置于第二阳极电极和第二阴极电极之间的第二绝缘体，其中第二阳极电极和第二阴极电极相对于彼此共面。
15.—种微电穿孔的方法，所述方法包括 提供包括一系列共面的阳极电极和阴极电极的微电穿孔通道，其中相邻的阳极电极和阴极电极由绝缘体分离； 使电解液流过微电穿孔通道； 使细胞流过微电穿孔通道；以及 在相邻的阳极电极和阴极电极之间施加电势差。
16.如权利要求15所述的方法，其特征在于，还包括 改变流过微电穿孔通道的电解液的流速。
17.如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述绝缘体使阳极电极与相邻的阴极电极分离50纳米至2微米。
18.如权利要求15所述的方法，其特征在于，还包括 将阳极电极和阴极电极耦合到电源，所述电源选自下组DC电源、AC电源、脉冲电势电源、电流脉冲电源和涉及电极和离子物质的电解液反应；
19.包括权利要求15所述的方法的水消毒方法。
20.包括权利要求15所述的方法的细胞转染方法。
全文摘要
本文中提供的概念是“基于奇点的构造”电极设计和方法能以电极之间的低电势差在离子物质中产生局部高电场。本文描述的基于奇点的构造包括阳极电极；阴极电极；以及置于阳极电极和阴极电极之间的绝缘体。基于奇点的电极设计概念涉及其中阳极和阴极彼此相邻、基本共面地放置且由绝缘体分开的电极。基本共面的阳极/绝缘体/阴极构造限制感兴趣的体积的一个表面，并且局部地产生期望的电场，即，在阳极和阴极之间的界面附近。在理想的构造中，阳极和阴极之间的界面尺寸趋向于零，且变为奇点。
文档编号A61N1/00GK102985132SQ201180034876
公开日2013年3月20日 申请日期2011年5月31日 优先权日2010年6月3日
发明者B·鲁宾斯基, G·D·特罗斯扎克 申请人:加利福尼亚大学董事会