专利名称：产生四连蛋白-载脂蛋白a-i颗粒的方法，由此获得的脂质颗粒及其应用的制作方法
产生四连蛋白-载脂蛋白A-1颗粒的方法，由此获得的脂质颗粒及其应用本发明涉及脂蛋白和脂质颗粒领域。本文报道了产生包含载脂蛋白、磷脂酰胆碱和脂质的脂质颗粒的方法，其中在存在合成洗漆剂两性洗漆剂(Zwittergent)时形成脂质颗粒。
背景技术：
血浆脂蛋白是可溶性的蛋白-脂质复合物，其在血液中进行脂质运输和代谢。基于它们的密度、尺寸、化学组成和功能，对数种主要种类的脂蛋白进行了区分。在它们之中，也被称为高密度脂质颗粒的高密度脂蛋白(HDL)颗粒由平均分子量从180kD变化到360kDa的数个亚类组成。它们的平均脂质和蛋白含量分别是50重量％。磷脂酰胆碱(PC)占总脂质的38%，其次是胆固醇酯和小量的其他极性和非极性脂质，包括游离的胆固醇。主要的蛋白成分是载脂蛋白A-1 (Apo A-1)，代表人HDL中约60%的总蛋白重量。在人体中的胆固醇，尤其是在循环的体液如血液中的胆固醇，不以分离的分子形式存在，而是以与某些蛋 白的复合物(脂蛋白)形式存在。胆固醇的主要级分与低密度脂蛋白(LDL)或与高密度脂蛋白(HDL)复合。LDL颗粒包含载脂蛋白B作为主要的蛋白质化合物，而HDL颗粒包含载脂蛋白A-1作为主要的蛋白质化合物。由HDL颗粒吸收的胆固醇被酶卵磷脂胆固醇酰基转移酶(LCAT)酯化。胆固醇酯具有增加的疏水性并朝向HDL颗粒的核心扩散。HDL-胆固醇-酯颗粒可以被递送到肝脏并从循环中去除。HDL颗粒和其主要的多肽载脂蛋白A-1参与反向胆固醇运输(RCT)。其中载脂蛋白A-1增加胆固醇从细胞中的流出(例如从血管壁的细胞中流出)，脂质的结合和卵磷脂胆固醇乙酰转移酶的激活，并由此通过肝脏经血浆流动清除胆固醇。这是主动运输过程，涉及细胞膜蛋白ATP-结合-盒式-转运蛋白-A-1 (ABCA-1)。基于载脂蛋白A-1和载脂蛋白的治疗剂，例如重构的HDL颗粒已经在上世纪的70年代晚期和80年代早期进行了鉴定。对于包含脂质颗粒的载脂蛋白A-1-Mi Iano，可以显示临床证据(意味着在动脉硬化患者中显著的斑块减少)。载脂蛋白A-1-Milano是一种野生型载脂蛋白A-1的二聚体形式，根据载脂蛋白A-1分子天然存在的突变体进行设计。通过将氨基酸残基173 (精氨酸)改变为半胱氨酸从而允许形成二硫键能够形成二聚体。在W02009/131704中，报道了适合螯合胆固醇和其他分子的包含含有无机材料核心的纳米结构。在W02009/097587中报道了用于产生纳米级别的界面双层的方法，包括在获得混合物的约I小时内从中间体混合物中消除洗涤剂。在W02006/125304中，报道了治疗或预防冠状动脉疾病的药物组合物。在US2002/10142953中报道了涉及脂质代谢和心血管疾病的编码载脂蛋白的组合物。在W02005/084642中，报道了脱辅基蛋白质-共螯合剂(apoprotein-cochelate)组合物。在W02007/137400中，报道了治疗瓣膜狭窄的方法和化合物。在W02005/041866中报道了用于治疗和预防急性冠状动脉综合征的药物制剂、方法和给药方案。在W02009/097587中，报道了纳米级别的界面双层、应用和产生方法。在W02005/065708中报道了具有提高的耐受性的在免疫原性组合物中的疏水蛋白制剂。在W02006/069371中，报道了预防、抑制和/或逆转动脉粥样硬化的血浆脂质化方法。在US4, 608，347中报道了产生反胶束(reverse micelle)的组合物、应用和方法,所述反胶束用于澄清生物流体以获得澄清后分析物的不失真的测定。发明概述本文报道了一种用于产生脂质颗粒的方法，其中所述脂质颗粒在存在合成的洗涤剂时形成。已经发现，脂质颗粒可以在存在合成的洗涤剂如两性洗涤剂时形成。应用合成的洗涤剂，例如避免了使用动物来源的成分。本文报道的一个方面是产生脂质颗粒的方法，其中所述脂质颗粒在存在合成的洗涤剂时形成。在一个实施方案中，合成的洗涤剂是两性洗涤剂。在另一个实施方案中，两性洗涤剂是两性洗涤剂3-8或两性洗涤剂3-10。在一个实施方案中，所述方法包括下述步骤i)提供包含变性多肽的第一溶液，ii)将第一溶液加入包含至少一种脂质和合成洗涤剂的第二溶液，所述第二溶液不包含所述多肽，即无所述多肽，和iii)从在步骤ii)中获得的溶液中去除洗涤剂，并且由此产生脂质颗粒。
在另一个实施方案中，所述方法包括下述步骤i)提供包含天然多肽的溶液，ii)将脂质和合成洗涤剂加入i)的溶液,和iii)从在步骤ii)中获得的溶液中去除洗涤剂并由此产生脂质颗粒。在一个实施方案中，多肽是重组产生的多肽。在一个实施方案中，多肽是载脂蛋白。在另一个实施方案中，载脂蛋白是纯化的载脂蛋白。在一个实施方案中，载脂蛋白具有选自氨基酸序列SEQ ID NO :01，02，04_52，66和67的氨基酸序列或包含至少一个含有氨基酸序列SEQ ID NO :01,02,04-52,66和67的至少80%的连续片段。在一个实施方案中，载脂蛋白具有氨基酸序列或是选自SEQ ID NO =01,02,04-52,66或67的氨基酸序列的至少80%的连续片段。在一个实施方案中，载脂蛋白是载脂蛋白A-1。在一个实施方案中，载脂蛋白A-1是人载脂蛋白A-1。在另一个实施方案中，载脂蛋白是四连蛋白-载脂蛋白A-1，其具有氨基酸序列 SEQ ID NO 01 或 SEQ ID NO 02 或 SEQ ID NO 66 或 SEQ ID NO :67。在一个实施方案中，载脂蛋白具有带有选自R151C和R197C的突变的SEQ ID NO 06的氨基酸序列。在一个实施方案中，至少一种脂质选自磷脂、脂肪酸和类固醇脂质。在一个实施方案中，至少一种脂质是任选地彼此独立地选自磷脂、脂肪酸和类固醇脂质的至少两种脂质。在另一个实施方案中，至少一种脂质来自1-4种脂质，即选自包括一种脂质、两种脂质、三种脂质和四种脂质的组。在一个实施方案中，第二溶液包含磷脂、脂质和洗涤剂。
在一个实施方案中，第二溶液由磷脂、脂质、洗涤剂和缓冲盐组成。在一个实施方案中，脂质是两种不同的磷脂。在另一种实施方案中，脂质是两种不同的磷脂酰胆碱。在另一个实施方案中，第一磷脂酰胆碱和第二磷脂酰胆碱的不同之处在于一个或两个脂肪酸残基或脂肪酸残基衍生物，其被酯化为磷脂酰胆碱的甘油主链。在一个实施方案中，第一磷脂酰胆碱是P0PC，第二磷脂酰胆碱是DPPC。在本文报道的方法的一个实施方案中，第一溶液基本不含脂质颗粒。在一个实施方案中，所述方法在步骤ii)之后和步骤iii)之前包括下述步骤iia):温育在步骤ii)中获得的溶液。在一个实施方案中，温育和/或去除在从4°C-45°C的温度进行。在一个实施方案中，用合成洗涤剂(两性洗涤剂)温育多肽约O. 5小时到约60小时。在一个实施方案中，用合成洗涤剂(两性洗涤剂)温育多肽约O. 5小时到约20小时。在一个实施方案中，用合成洗涤剂(两性洗涤剂)温育多肽约2小时到约60小时。在一个实施方案中，用合成洗涤剂(两性洗涤剂)温育多肽约12小时到约20小时。在一个实施方案中，用合成洗涤剂(两性洗涤剂)温育多肽约16小时。在一个实施方案中，洗涤剂是具有高CMC的洗涤剂。在另一个实施方案中，洗涤剂是具有至少5mM的CMC的洗涤剂。在一个实施方案中，通过渗滤或透析或吸附来进行去除。在一个实施方案中，吸附选自亲`和色谱法或疏水色谱法。在一个实施方案中，去除通过透析进行。在一个实施方案中，第一溶液具有第一体积，第二溶液具有第二体积，在第一溶液中的载脂蛋白以限定的浓度存在，并且在第二溶液中的脂质和洗涤剂各以限定的浓度存在，其中在步骤ii)中，载脂蛋白的浓度，脂质的浓度和洗涤剂的浓度被改变/减少，允许形成脂质颗粒。在一个实施方案中，所述方法包括下述步骤iv)纯化脂质颗粒并由此产生脂质颗粒。在一个实施方案中，第二方法包括下述步骤ii)ii)将至少一种脂质和合成洗涤剂加入i)的溶液中并调节脂质、洗涤剂和载脂蛋白的浓度和浓度比率。本文报道的一个方面是通过如本文报道的方法获得的脂质颗粒。本文报道的一个方面是药物组合物，所述药物组合物包含用本文报道的方法获得的含有载脂蛋白的脂质颗粒，以及将本文报道的脂质颗粒用于制备治疗动脉粥样硬化的药物的应用。发明详述术语“载脂蛋白”指分别在脂质或脂蛋白颗粒中包含的蛋白。术语“载脂蛋白A-Ι”指具有蛋白-脂质和蛋白-蛋白相互作用性质的两亲性螺旋多肽。载脂蛋白A-1作为267个氨基酸残基的前载脂蛋白原(prepro-apoliprotein)由肝脏和小肠合成，所述前载脂蛋白原作为载脂蛋白原(pro-apolipoprotein)被分泌,其被切割为具有243个氨基酸残基的成熟多肽。载脂蛋白A-1由被接头部分分隔的6-8个不同的氨基酸重复序列组成，所述氨基酸重复序列分别由22个氨基酸残基组成，所述接头部分通常是脯氨酸，并且在某些情形中，由数个残基组成的片段组成。示例性的人载脂蛋白A-1氨基酸序列在GenPept数据库登录号NM-000039或数据库登录号X00566 ；GenBankNP-000030.1(gi4557321)中报道。人载脂蛋白A-1 (SEQ ID NO 06)存在天然存在的变体，如 P27H, P27R, P28R, R34L, G50R, L84R, D113E, A-A119D， D127N,缺失 K131, K131M,W132R, E133K，R151C(氨基酸残基 151 由 Arg 变化为 Cys，载脂蛋白 A-1-Paris)，E160K，E163G，P167R，L168R，E171V，P189R，R197C(氨基酸残基 173 由 Arg 改变为 Cys，载脂蛋白A-1-Milano)和E222K。还包括具有保守氨基酸修饰的变体。在一个实施方案中，四连蛋白-载脂蛋白A-1包含免疫球蛋白A蛋白酶(IgA蛋白酶)的切割位点的片段。从IgA蛋白酶已知的识别位点包含下述序列，其中“丨”表示切割键的位置
权利要求
1.用于产生包含多肽的脂质颗粒的方法，所述方法特征在于在两性洗涤剂3-8或两性洗涤剂3-10的存在下形成所述脂质颗粒。
2.根据前述权利要求中任一项的方法，其特征在于所述多肽用所述两性洗涤剂温育约2小时到约60小时。
3.根据前述权利要求中任一项的方法，其特征在于，所述方法包括下述步骤 i)提供包含变性多肽的第一溶液， )将所述第一溶液加入第二溶液中，所述第二溶液包含至少一种脂质和两性洗涤剂3-8或两性洗涤剂3-10，但是不含所述多肽，和 iii)从步骤ii)获得的溶液中去除所述两性洗涤剂并且由此产生脂质颗粒。
4.根据权利要求1或2中任一项所述的方法，其特征在于所述方法包括下述步骤 i)提供包含天然多肽的溶液， )将至少一种脂质和两性洗涤剂3-8或两性洗涤剂3-10加入i)的溶液，和 iii)从在步骤ii)中获得的溶液去除所述两性洗涤剂并由此产生脂质颗粒。
5.根据前述权利要求中任一项的方法，其特征在于所述多肽具有选自SEQID NO 01,02，04-52，66或67的氨基酸序列的氨基酸序列，或包含至少一种包含SEQ ID NO =01,02,04-52，66或67的氨基酸序列的至少80%的连续片段。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于所述多肽是具有SEQID N0:01或SEQ IDNO 02或SEQ ID NO 66或SEQ ID NO 67的氨基酸序列的四连蛋白-载脂蛋白A-1。
7.根据权利要求3-6中任一项所述的方法，其特征在于所述至少一种脂质是两种脂质。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于所述两种脂质是两种不同的磷脂。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于第一磷脂是POPC，第二磷脂是DPPC。
10.根据前述权利要求中任一项的方法，其特征在于所述洗涤剂是具有高CMC的洗涤剂。
11.根据前述权利要求中任一项的方法，其特征在于所述去除是通过渗滤或透析或吸附进行的。
12.通过权利要求1-3和5-11任一项的方法获得的脂质颗粒。
13.通过权利要求1、2和4-11任一项的方法获得的脂质颗粒。
14.药物组合物，其包含权利要求12或13任一项的脂质颗粒。
全文摘要
本文报道一种用于产生脂质颗粒的方法，所述方法包括下述步骤i)提供包含变性载脂蛋白的第一溶液，ii)将所述第一溶液加入第二溶液中，所述第二溶液包含至少两种脂质和洗涤剂，但是不含载脂蛋白，和iii)从步骤ii)获得的溶液中去除所述洗涤剂并且由此产生脂质颗粒。
文档编号A61K9/127GK103068369SQ201180038704
公开日2013年4月24日 申请日期2011年8月25日 优先权日2010年8月30日
发明者马丁·巴德尔, 莫妮卡·贝纳, 安东·约赫内尔, 休伯特·藤贝尔格, 西尔克·莫尔 申请人:霍夫曼-拉罗奇有限公司