用于伤口愈合的新型肽的制作方法

专利名称：用于伤口愈合的新型肽的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于伤口愈合的肽，包含所述肽的组合物以及它们在伤口愈合和化妆品应用两者中的用途。
背景技术：
组织的伤口愈合是复杂的修复过程。在正常情况下，急性伤口愈合的过程可以分成三个阶段。初始炎症阶段，其后紧接着稳健的组织重塑和增殖(增殖阶段)，继而是成熟阶段，在成熟阶段中发生再上皮化、皮肤血管生成和伤口闭合。再上皮化涉及上皮组织，主要是角质形成细胞的迁移和增殖。血管生成是新的血管从原有导管的生长，并且其受大量可溶性细胞因子包括生长因子多肽，以及细胞-细胞和细胞-基质相互作用的调节。慢性伤口表现出与通常的急性伤口不同的愈合特点，它们通常长期处于炎症状态。不愈伤口可以最常见于患有糖尿病、静脉停滞疾病的患者以及卧床患者中。鉴于上述情形，需要提供新的生物分子，其能够在急性和慢性伤口愈合两种情形中均安全地和有效地增强上皮和血管伤口愈合机制。近年来已经开发了用于促进伤口愈合的药物，诸如贝卡普勒明(Beclapermin)(来自Johnson&Johnson的一种遗传工程重组TOGF，或包含TOGF和地塞米松的用于哺乳动物组织再生和修复的药物组合物(EP0575484)。US5，981，606公开了一种伤口愈合剂，其包含TGF-β，并且US6, 800，286和US5, 155，214公开了包含FGF的伤口愈合剂。所有已经记载的愈合剂均是生长因子、细胞因子或趋化因子、胶原或透明质酸。这要药剂呈现的缺点是诱发不良 事件，因为它们并不是对一种细胞类型特异的。仍存在着对替代伤口愈合剂的需求，所述伤口愈合剂产生有效和快速的伤口愈合并且不引起不良事件。本发明目标在于提供新型肽作为替代的伤口愈合剂，所述肽对由内皮细胞介导的血管生成是特异的。少于50个氨基酸的肽呈现的优势是由于其小的尺寸而成为用于治疗用途的令人感兴趣的工具:它们提供对其靶标的高亲和性-特异性和低毒特性、室温保存性以及由于其较小的尺寸而更好的组织穿透性。此外，它们呈现的优势是相比于全长蛋白而容易被合成:因此它们的工业生产更容易标准化和控制。它们不显示病毒安全性问题，因为它们可以被化学合成并且不会存在重折叠问题、糖基化问题和活性变异性。

发明内容
本发明的一个目的是一种肽，其包含选自下列组中的序列之一:SEQ ID NO =USEQID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5 和 SEQ ID NO:6，或所述序列的至少 8
个氨基酸的片段。本发明的另一个目的是一种药物组合物，其包含至少一种所述肽，所述肽与药学可接受的赋形剂组合。
本发明的另ー个目的是用于伤ロ愈合的所述药物组合物。本发明的另一目的是包含本发明的至少ー种肽的化妆品组合物。
具体实施例方式伤ロ愈合建立在伤ロ边缘处或附近细胞的迁移和增殖以及新的或原有的血管募集至伤ロ部位的基础上。本发明人发现本发明的肽能够通过增加血管生成来促进伤ロ的愈合；并且特别有效。本发明的肽是蛋白156A的片段。如在专利申请EP1955705中发明人所记载的那样，蛋白156A是具有体内伤ロ愈合活性的217个氨基酸长的蛋白，该申请通过引用合并入本文中。令人惊奇地是，本发明人证实了本发明的肽比全长156A蛋白更有效地促进伤ロ的愈合。此外，本发明人证实了此·增强的有效性并不是全长156A蛋白的所有片段所共有的(參见实施例部分)。本发明的ー个目的是ー种肽，其包含选自下列组中的序列之一:SEQ ID NO =USEQID NO:2, SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5 和 SEQ ID NO:6，或包含所述序列的至少8个氨基酸的片段。本发明的另ー个目的是与SEQ ID NO:USEQ ID N0:2、SEQ ID N0:3、SEQ ID NO:
4、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6，或与这些序列的至少8个氨基酸的片段具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 的同一性的肽。肽7:TQECPVRTSLDRELDLQASL(SEQ ID NO:1)肽7B:ELDLQASL(SEQ ID NO:2)肽10:VSKDVCRL(SEQ ID NO:3)肽11:QSQKVPRQVQS(SEQ ID NO:4)肽7A:TQECPVRTSLD(SEQ ID NO:5)肽7C:RRTTQECPVRTSLD(SEQ ID NO:6)本发明的肽可以包含保守序列修饰，保守序列修饰是指不显著地影响或改变本发明的肽的功能的氨基酸修饰。这种保守修饰包括氨基酸置換、添加和缺失。修饰可以通过本领域中已知的标准技术引入至本发明的肽的序列中，诸如定向诱变和PCR-介导的诱变。保守氨基酸置換典型地是其中氨基酸残基被带有具有相似物理化学性质的侧链的氨基酸残基替换的那些。本发明的肽的修饰序列可以包含ー个、两个、三个、四个或更多个氨基酸插入、缺失或置換。在进行置换的时候，优选的置换是保守修饰。带有相似侧链的氨基酸残基的家族在本领域中已被确定。这些家族包括带有碱性侧链的氨基酸(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、带有酸性侧链的氨基酸(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、带有非荷电极性侧链的氨基酸(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、带有非极性侧链的氨基酸(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、带有3 -支链侧链的氨基酸(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和带有芳香族侧链的氨基酸(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此，本发明的肽的序列内的ー个或多个氨基酸残基可以用来自相同侧链家族的其他氨基酸残基代替，并且本发明的修饰肽可以通过与本发明的肽相比较来测试其保留的功能(即，上面提到的特性)。术语“同一性”或“相同的”，当用于两种以上多肽的序列之间的关系时，是指多肽之间的序列相关程度，如通过两个以上氨基酸残基的串之间的匹配数目来确定。“同一性”度量通过特定数学模型或计算机程序(即，“算法”)、采用空位比对(如果有的话)确定的两条以上序列中较小的序列之间相同匹配的百分比。相关多肽的同一性可以通过已知方法容易地进行计算。此类方法包括，但不限于，Computational Molecular Biology(计算分子生物学)，Lesk, A.M.，ed.，Oxford University Press, New York, 1988 ；Biocomputing:Informatics 5 and Genome Projects (生物计算:信息学 5 和基因组计划)，Smith, D.ff.，ed., Academic Press, New York, 1993 ；Computer Analysis of Sequence Data (序列数据的计算机分析)，Part I, Griffin, A.M.,和 Griffin, H.G.，eds.，Humana Press, NewJersey, 1994 ；Sequence Analysis in Molecular Biology (分子生物学中的序列分析),von Heinje, G., Academic Press, 1987 ；Sequence Analysis Primer(序列分析引物)，Gribskov, M.和 Devereux, J., eds., M.Stockton Press, New York, 1991 ;和 Carillo 等，SIAM J.Applied Math.48，1073 (1988)中记述的那些。用于确定同一性的优选方法被设计成在所测试序列之间产生最大匹配。在可公开获得的计算机程序中描述了确定同一性的方法。用于确定两条序列之间的同一性的优选的计算机程序方法包括GCG程序包(其包括GAP (Devereux 等，Nucl.Acid.Res.\2，387(1984) ；Genetics Computer Group, Universityof Wisconsin, Madison, Wis.))、BLASTP、BLASTN 和 FASTA (Altschul 等，J.Mol.Biol.215，403-410(1990))。BLASTX 程序从 National Center for Biotechnology Information (国家生物技术信息中心)(NCBI)和其他来源(BLAST Manual，Altschul等NCB/NLM/NIHBethesda, Md.20894 ；Alts chul等，见上)可公开地获得。众所周知的Smith Waterman算法也可以用来确定同一'I"生。本发明的另一目的是由8至50个氨基酸组成的肽，其包含选自下列组中的序列之一:SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5 和 SEQ ID NO:6，或所述序列的至少8个氨基酸的片段。

本发明的另一目的是由8至40个氨基酸组成的肽，其包含选自下列组中的序列之一:SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5 和 SEQ ID NO:6，或所述序列的至少8个氨基酸的片段。本发明的另一目的是由8至30个氨基酸组成的肽，其包含选自下列组中的序列之一:SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5 和 SEQ ID NO:6，或所述序列的至少8个氨基酸的片段。本发明的另一目的是由8至25个氨基酸组成的肽，其包含选自下列组中的序列之一:SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5 和 SEQ ID NO:6，或所述序列的至少8个氨基酸的片段。本发明的另一目的是由8至20个氨基酸组成的肽，其包含选自下列组中的序列之一:SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5 和 SEQ ID NO:6，或所述序列的至少8个氨基酸的片段。 本发明的另一目的是由8至18个氨基酸组成的肽，其包含选自下列组中的序列之一:SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5 和 SEQ ID NO:6，或所述序列的至少8个氨基酸的片段。本发明的另ー目的是由8至16个氨基酸组成的肽，其包含选自下列组中的序列之一:SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5 和 SEQ ID NO:6，或所述序列的至少8个氨基酸的片段。本发明的另一目的是由8至14个氨基酸组成的肽，其包含选自下列组中的序列之一:SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5 和 SEQ ID NO:6，或所述序列的至少8个氨基酸的片段。本发明的另一目的是由8至12个氨基酸组成的肽，其包含选自下列组中的序列之一:SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4 和 SEQ ID NO:5，或所述序列的至少 8 个氨基酸的片段。在本发明的一个实施方案中，由8至30个氨基酸组成的包含SEQ ID NO:2的肽是SEQ ID NO: 14至SEQ ID NO:36中之ー或是包含SEQ ID NO:2的所述序列的9至29个氨基酸的片段。SEQ ID NO:14:TVCQSVLRRTTQECPVRTSLDRELDLQASLSEQ ID NO:15:VCQSVLRRTTQECPVRTSLDRELDLQASLTSEQ ID NO:16:CQSVLRRTTQECPVRTSLDRELDLQASLTRSEQ ID NO:17:QSVLRRTTQECPVRTSLDRELDLQASLTRQSEQ ID NO:18:SVLRRTTQECPVRTSLDRELDLQASLTRQS`
SEQ ID NO:19:VLRRTTQECPVRTSLDRELDLQASLTRQSRSEQ ID NO:20:LRRTTQECPVRTSLDRELDLQASLTRQSRLSEQ ID NO:21:RRTTQECPVRTSLDRELDLQASLTRQSRLNSEQ ID NO:22:RTTQECPVRTSLDRELDLQASLTRQSRLNDSEQ ID NO:23:TTQECPVRTSLDRELDLQASLTRQSRLNDESEQ ID NO:24:TQECPVRTSLDRELDLQASLTRQSRLNDELSEQ ID NO:25:QECPVRTSLDRELDLQASLTRQSRLNDELQSEQ ID NO:26:ECPVRTSLDRELDLQASLTRQSRLNDELQASEQ ID NO:27:CPVRTSLDRELDLQASLTRQSRLNDELQALSEQ ID NO:28:PVRTSLDRELDLQASLTRQSRLNDELQALRSEQ ID NO:29:VRTSLDRELDLQASLTRQSRLNDELQALRDSEQ ID NO:30:RTSLDRELDLQASLTRQSRLNDELQALRDLSEQ ID NO:31:TSLDRELDLQASLTRQSRLNDELQALRDLRSEQ ID NO:32:SLDRELDLQASLTRQSRLNDELQALRDLRQSEQ ID NO:33:LDRELDLQASLTRQSRLNDELQALRDLRQKSEQ ID NO:34:DRELDLQASLTRQSRLNDELQALRDLRQKLSEQ ID NO:35:RELDLQASLTRQSRLNDELQALRDLRQKLESEQ ID NO:36:ELDLQASLTRQSRLNDELQALRDLRQKLEE本发明的另ー个目的是基本上由选自下列组中的氨基酸序列组成的肽:SEQ IDNO:U SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5 和 SEQ ID NO:6。“基本上由......组成”如在本文中使用意指肽的序列可以在该序列的N-末端和/或C-末端中进一步包含I至5个氨基酸。所述添加的氨基酸可以是任意的氨基酸并且不会改变所述肽的生物学活性。“肽”如在本文中使用，是指其中单体是通过酰胺键连接在一起的α氨基酸的聚合物。肽为两个或经常更多个氨基酸单体长，并且优选不长于50个氨基酸。肽中的氨基酸残基如下缩写:苯丙氨酸是Phe或F ;亮氨酸是Leu或L ;异亮氨酸是Ile或I ;甲硫氨酸是Met或M ;缬氨酸是Val或V ;丝氨酸是Ser或S ;脯氨酸是Pro或P ;苏氨酸是Thr或T ;丙氨酸是Ala或A ;酪氨酸是Tyr或Y ;组氨酸是His或H ;谷氨酰胺是Gln或Q ;天冬酰胺是Asn或N ;赖氨酸Lys或K ;天冬氨酸是Asp或D ;谷氨酸是Glu或E ;半胱氨酸是Cys或C ;色氨酸是Trp或W ;精氨酸是Arg或R ;且甘氨酸是Gly或G。20个常规氨基酸的立体异构体(例如，D-氨基酸)、非天然氨基酸诸如α、α - 二取代的氨基酸、N-烷基氨基酸、乳酸和其他非常规氨基酸也可以是用于本文提供的技术的化合物的合适组分。非常规氨基酸的实例包括:β -丙氨酸、1-萘基丙氨酸，2-萘基丙氨酸、3-吡啶丙氨酸、4-羟脯氨酸、O-磷酸丝氨酸、N-乙酰丝氨酸、N-甲酰甲硫氨酸、3-甲基组氨酸、5-羟赖氨酸、正亮氨酸以及其它相似的氨基酸和亚氨基酸(例如，4-羟脯氨酸)。本文所述的肽可以通过化学合成或酶促合成通过合成产生，因为这在本领域中是公知的。可选地，编码本发明的肽的核苷酸序列可以引入至蛋白表达载体中并在合适的宿主生物体(例如，细菌、昆虫细胞等)中产生，然后纯化。可附加额外的多肽("标签")用于纯化或鉴定所述肽的目的。蛋白标签使得以下成为可能，例如，以高的亲和性将所述多肽吸附到基质上，然后用合适的缓冲液严格地洗涤所述基质而复合物不以任何显著的程度被洗脱，并且随后将吸附的复合物选择性地洗脱。技术人员已知的蛋白标签的实例是(His)6标签、Myc标签、FLAG标签、血凝集素标签、谷胱甘肽转移酶(GST)标签、具有亲和性几丁质结合标签或麦芽糖结合蛋白(MB P)标签的内含肽。这些蛋白标签可以位于N-末端、C-末端和/或内部。本发明的一个目的是如以上所述的肽，所述肽被修饰。本文提供的肽可以通过本领域公知的方式修饰。例如，肽可以通过添加一个或多个官能团诸如磷酸盐、乙酸盐或各种脂质和碳水化合物来修饰。本发明的肽也可以作为肽衍生物存在。术语“肽衍生物”是指具有氨基(--NH--)，并且更特别地，具有肽键的化合物。肽可以被认为是取代的酰胺。如酰胺基一样，肽键显示高度的共振稳定。肽键中的C-N单键典型地具有约40%的双键性质且C = O双键具有约40%的单键性质。“保护基”是防止涉及未受保护的官能团的不期望反应(诸如蛋白水解)的那些基团。氨基保护基的具体实例包括甲酰基；三氟乙酰基；苄氧羰基；取代的苄氧羰基诸如(邻位或对位)氯苄氧羰基和(邻位或对位)溴苄氧羰基；和脂族氧基羰基诸如叔丁氧基羰基和叔戊氧基羰基。氨基酸的羧基可以通过转化成酯基进行保护。酯基包括苄酯、取代的苄酯诸如甲氧基苄酯；烷基酯诸如环己基酯、环庚基酯或叔丁酯。胍基部分可以通过硝基；或芳基磺酰基诸如甲苯磺酰基、甲氧基苯磺酰基或均三甲苯磺酰基保护，即使它不需要保护基。咪唑的保护基包括甲苯磺酰基、苄基和二硝基苯基。色氨酸的吲哚基可以通过甲酰基保护或可以不受保护。肽的修饰的目的特别地是改善它们在体内的寿命。一种类型的修饰是向肽的N或C末端添加聚乙二醇(PEG)。本领域技术人员已知PEG具有许多使其成为肽的理想载体的性质，诸如高水溶性、溶液中的高迁移率和低免疫原性。该修饰也保护肽免受外肽酶降解并且因此増加其在体内的总体稳定性。用来防止肽被内肽酶或外肽酶降解的其他修饰包括N-末端修饰诸如こ酰化或糖基化、C-末端修饰诸如酰胺化和在肽内的特定位点处利用非天然氨基酸-氨基和a -三氟甲基氨基酸)。增加肽分子大小的另一可选方式是肽与人Y免疫球蛋白的Fe结构域的基因融合或肽与白蛋白的融合。本发明的另一目的是包含至少ー种如以上所述的肽与药学可接受的赋形剂组合的药物组合物。本发明的另一目的是用于伤ロ愈合的方法，该方法包括向需要所述方法的受试者施用治疗有效量的本发明的至少ー种肽。 根据本发明，所述受试者可以是任何哺乳动物，优选是人。在本发明的一个实施方案中，所述受试者可以受糖尿病影响。在本发明的ー个实施方案中，所述受试者可以被诊断患有糖尿病。“治疗有效剂量或治疗有效量”是指足以引起所需的生物学结果的剂量水平。该结果可以是体征、症状或病因的缓解，或生物系统的任何其他所需的改变。优选地，此剂量或量将足以刺激或增强上皮和/或内皮伤ロ愈合反应并且，因此诱导或加强伤ロ愈合。

术语“药学可接受的”是指可以施用给哺乳动物而没有过度毒性的化合物和组合物。合适的赋形剂包括水、盐水、林格氏溶液、右旋糖(dextrose)溶液，和こ醇、葡萄糖、蔗糖、葡聚糖、甘露糖、甘露醇、山梨醇、聚こニ醇(PEG)、磷酸盐、こ酸盐、明胶、胶原、卡波姆 ( Carbopol )、植物油等的溶液。可以另外地包含合适的防腐剤、稳定剂、抗氧化剂、抗微生物剂和缓冲剂，例如，BHA, BHT、柠檬酸、抗坏血酸、四环素等。在一个实施方案中，组合物可以包含肽的药学可接受的盐。药学可接受的盐的实例包括与无机碱的盐、与有机碱的盐、与无机酸的盐、与有机酸的盐、与碱性或酸性氨基酸的盐等。与无机碱的盐的实例包括碱金属盐，诸如钠盐和钾盐；碱土金属盐诸如钙盐和镁盐；铝盐；和铵盐。与有机碱的盐的实例包括与三甲胺、三こ胺、吡唆、甲基吡啶、2，6_ ニ甲基吡唆、こ醇胺、ニこ醇胺、三こ醇胺、环己胺、ニ环己胺和N，N' - ニ苄基こニ胺的盐。与无机酸的盐的实例包括与盐酸、硼酸、硝酸、硫酸和磷酸的盐。与有机酸的盐的实例包括与甲酸、こ酸、三氟こ酸、邻苯ニ甲酸、富马酸、草酸、酒石酸、马来酸、柠檬酸、琥珀酸、苹果酸、甲磺酸、苯磺酸和对甲苯磺酸的盐。与碱性氨基酸的盐的实例包括与精氨酸、赖氨酸和鸟氨酸的盐。与酸性氨基酸的盐的实例包括与天冬氨酸和谷氨酸的盐。合适的盐的列举记载在Remington' s Pharmaceutical Sciences (雷明顿药物科学)，17th ed., Mack Publishing Company, Easton, Pa., pl418,1985 中，该书的全部公开内容通过引用合并于本文中。如在本文中使用，术语“伤ロ愈合”是指增强、改善、提高或诱导伤ロ的闭合、愈合或修复。例如，如果用本发明的肽治疗的伤ロ的愈合时间比不用本发明的肽治疗的伤ロ的愈合时间减少了约10%，优选减少了约20%、25%、30%、40%，更优选减少了约50%，且最优选減少了约75%，则认为伤ロ愈合被促进。相反，瘢痕形成的程度可以用来确定伤ロ愈合是否被促迸。
伤口可以是在哺乳动物的任何部位发现的内部伤口或外部伤口。伤口是一类物理创伤，在该创伤处皮肤或组织的完整性由于例如，外力、不佳的健康状况、衰老、暴露于日光、热或化学反应或由于内部生理过程的损害而被破坏。如果组织的外层被破坏，则伤口被认为是开放性伤口。伤口也可由于外科手术操作引起，诸如心脏直视手术、器官移植、截肢术和假体的植入，诸如关节和髋关节置换等。伤口可以是开放性伤口或闭合性伤口。开放性伤口是指其中皮肤破损的伤口。开放性伤口包括，例如，切割伤(即，其中皮肤被例如切割器械(例如，刀子、剃刀等)破损的伤口)、撕裂伤(即，其中皮肤典型地被钝器破损的伤口)、擦伤(例如，通常是其中皮肤的最上层被擦掉的表面伤口)、刺伤(典型地由刺穿皮肤的物体导致，诸如钉子或针)、贯通伤(例如，由诸如刀子的物体导致)和枪伤。闭合性伤口典型地是其中皮肤未破损的伤口。闭合性伤口包括例如，由钝力创伤导致的挫伤(或瘀伤)，其损伤皮肤下的组织；由血管的损伤(其反过来引起血液积聚在皮肤下)所导致的血肿；由长时间施加的巨大或极大的力量所导致的挤压伤；急性和慢性伤□。伤口的非限制性实例为:-烧伤，其是由 于暴露于热、电、辐射(例如，日晒和激光外科手术)、或腐蚀性化学物质所引起的损伤，-由于衰老或环境引起的皮肤伤口，这包括例如，裂口、干性皮肤、皮肤粗糙等，-由于外力损伤组织引起的伤口，-溃疡(皮肤表面或黏性表面上的损害)，-糖尿病中的伤口，其典型是由于神经损害导致的麻木(糖尿病神经病变)和至腿部和足部的血流少引起的足部损伤。最严重的损伤是足溃疡。糖尿病足溃疡处于被感染的非常高的风险中，并且有时它们不能愈合。不愈合的足溃疡是糖尿病患者截肢的常见原因，-褥疮伤口，褥疮(压疮)，即由于身体任何部分上的压力无法减轻所导致的病变，特别是骨骼或软骨区域上方的部分。在本发明的一个实施方案中，如上所述的药物组合物用于伤口愈合。在本发明的一个实施方案中，本发明的组合物用于治疗急性或慢性伤口。急性伤口由完整皮肤的外部损伤所导致并且可以根据导致伤口的物体分类成不同的类型:例如，切口或切割的伤口、撕裂伤、磨损伤(abrasion)和擦伤(graze)、烧伤、由刺穿皮肤的物体诸如钉子或针导致的刺伤、由进入身体物体例如刀子导致的贯通伤、由子弹或类似的抛射体打入或贯通身体所导致的枪伤。急性伤口也可以是闭合性伤口，诸如挫伤或瘀伤、血肿、由长时间施加的巨大或极大的力量所导致的挤压伤。其他急性伤口归因于皮肤病诸如银屑病、痤疮和湿疹。慢性伤口最常由与最终削弱皮肤或上皮组织的完整性的发病条件相关的内源性机制导致。常见的慢性伤口是静脉溃疡，其通常发生在腿部并且主要累及老年人；糖尿病溃疡，其是慢性伤口的另一主要病因；压力性溃疡，其通常发生在具有例如麻痹状况的人中，所述状况限制通常经受压力的身体部分(诸如足跟、肩胛骨和骶骨)的移动；角膜溃疡，最常由细菌、病毒、真菌或阿米巴感染所导致；和消化性溃疡。其他类型的慢性伤ロ可以归因于诸如缺血和辐射中毒。所有慢性伤ロ缓慢地以无法预测的方式愈合。伤ロ可能与任何组织有关，诸如例如眼、粘膜、肺、肾、心脏、肠、肌腱、肝或血管组织，诸如例如静脉、微静脉、动脉和毛细血管。根据本发明，本发明的肽呈现的优势是激活血管生成并且由此促进伤ロ的愈合。在本发明的一个实施方案中，所述组合物用于糖尿病患者中的伤ロ愈合。糖尿病的最使人衰弱的并发症之一是发生慢性不愈合的溃疡。特别地，不愈合的足溃疡发生在15%的糖尿病中。糖尿病足溃疡导致约20%的受累个体的截肢，并且是美国和欧洲非创伤性下肢截肢的主要病因。本发明人在本文中显示了本发明的肽有效地減少糖尿病小鼠的伤ロ面积(參见实施例)。在一个实施方案中，本发明的组合物用于促进和/或加速糖尿病患者的伤ロ愈合。本发明的另一目的是包含本发明的至少ー种肽的化妆品组合物。此组合物用于化妆品应用:例如，防止皮肤的衰老，蜂窝组织炎、干性皮肤、裂ロ，或治疗口腔阿弗他病变(oral aphtous lesion)、烧ロ综合征根据本发明，本发明的肽可以经ロ、局部给药，或经肠胃外方式给药，包括皮下、经皮或肌内注射、持续释放的长效药剂(depot)的植入、静脉内注射、鼻内给药等。根据本发明，包含本发明的肽的组合物可以是水性溶液、乳液、乳膏、软膏、混悬液、凝胶、脂质体混悬液等。用于局部给药的组合物的实例包括，但不限于，包含本发明的至少ー种肽的洗剤、油膏齐U、凝胶剂、乳膏齐U、香膏剂(balsam)、酉丁剂、巴布剂(cataplasm)、酏剂、糊剂、喷雾剂、洗眼剂、滴剂、混悬剂、分散剂、水凝胶、软膏剂、乳剂或散剂。
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其他局部制剂包括气雾剂、绷带、敷料材料、藻酸盐敷料和其他伤ロ敷料。ロ服制剂包括，但不限于，可饮用的混悬剂或溶液剂、糖浆剂、片剂、胶囊剂、丸剂…可选地，可以将本发明的肽掺入或包封至合适的医用装置中，用于植入至待局部治疗的部位附近。根据本发明，医用装置可以是透皮医用装置、药物可控释放的医用装置或药物洗脱支架的形式。透皮医用装置是指用于经由透皮过程缓慢释放本发明的肽的装置(例如贴片(adhesive patch))。药物洗脱支架是指已经由本发明的肽包被的支架。在本发明的具体实施方案中，本发明的肽包含在医用装置诸如吸收剂或吸附剂产品中。合适的吸收剂或吸附剂产品，例如，当应用于伤ロ部位处时能够吸收或吸附伤ロ的液体。所述产品的实例包括，例如，绷带、纱布、伤ロ或溃疡敷料、皮肤贴片和胶带。大量类型的敷料是市售的，包括薄膜(例如，聚氨酯薄膜)、水状胶体(与聚氨酯泡沫结合的亲水胶体粒子)、水凝胶(含有约至少60%水的交联聚合物)、泡沫(亲水的或疏水的)、基于壳聚糖的敷料、藻酸钙(来自藻酸钙的纤维的无纺复合材料)、和赛璐玢(具有增塑剂的纤维素)。具体考虑的是使用液体吸收剂产品，其中本发明的肽浸入产品的表面中或(共价或以其他的方式)附着在产品的表面上。根据本发明，所述组合物包含的本发明的肽的量为约0.0001至500mg肽每毫升或克组合物，优选约0.001至50mg,更优选0.01至5mg且甚至更优选0.1至Img肽姆毫升或克组合物。根据本发明，所述组合物包含的本发明的肽的量为约0.0I重量％至90重量％，优选0.1至10重量更优选I至5重量％。在本发明的另一实施方案中，包含本发明的至少一种肽的组合物可以进一步包含至少一种其他的伤口愈合剂。在本发明的另一实施方案中，包含本发明的至少一种肽的组合物可以与至少一种其他的伤口愈合剂组合使用。此类其他伤口愈合剂包括，·但不限于，生长因子、细胞因子、酶和细胞外基质组分。例如，内皮下细胞外基质的胶原酶处理联合本发明的肽可以协同地加速内皮迁移和增殖至高于缺少肽时胶原酶处理的诱导性影响的水平。实现伤口修复的试剂也可以包含在此类组合物中以加快伤口愈合过程。此类试剂包括生长因子家族成员，诸如胰岛素样生长因子(IGF-1)、血小板衍生生长因子(TOGF)、表皮生长因子(EGF)、转化生长因子β (TGF-β)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、胸腺素a I(Tal)和血管内皮细胞生长因子(VEGF)。更优选地，所述药剂是转化生长因子β (TGF- β )或TGF- β超家族的其他成员。在本发明的另一实施方案中，本发明的组合物进一步包含止血物质、生长因子、抗感染物质、止痛物质、抗炎物质或它们的组合成。本文提供的技术不限于所述的特定方法学、实验方案、构建体、配方和试剂，而是进一步包括技术人员已知的那些。还要理解的是本文使用的术语仅用于描述具体实施方案，并且不意在限制本文提供的技术的范围。


图1:在肽7、10和11的存在下体外血管生成测定的代表性图像(图像摄于孵育后6h时)。图2:载体治疗的伤口、156A蛋白治疗的伤口和肽7治疗的伤口的伤口愈合时程。图3:载体治疗的伤口、156A蛋白治疗的伤口和肽10治疗的伤口的伤口愈合时程。图4:载体治疗的伤口、156A蛋白治疗的伤口和肽11治疗的伤口的伤口愈合时程。图5:载体治疗的伤口、156A蛋白治疗的伤口和肽7B治疗的伤口的伤口愈合时程。图6:载体治疗的伤口和肽2治疗的伤口的伤口愈合时程。图7:载体治疗的伤口和肽6治疗的伤口的伤口愈合时程。图8:载体治疗的伤口和肽9治疗的伤口的伤口愈合时程。图9: (A)在肽7或肽10的存在下通过QPCR对VEGF的测量。(B)在肽7的存在下通过ELISA对VEGF的测量。图10: (A)肽7 (400 μ g/ml)和肽10 (400 μ g/ml)对pAkt激活的影响。使用抗激活pAkt单克隆抗体和作为内对照的抗-GAPDH mAb的免疫印迹。(B)肽7和肽10对MAPK激活的影响。A)使用抗激活MAPK(pErkl/2)单克隆抗体和作为内对照的抗-GAPDH mAb的免疫印迹。图11:肽7(2mg/ml或5mg/ml)对糖尿病小鼠中伤口愈合的影响。实施例
材料和方法材料培养基和试剂培养基EGM-2MV 来自 Lonza (Verviers，Belgium)。无 丐和无镇 PBS、膜蛋白酶-EDTA(Versene)、IPTG (异丙基-1_B_D-硫代-1-半乳糖吡喃糖苷)、卡那霉素和氯霉素购自 Eurobio (Les Ulis，France)。基质胶(Matrigel)购自Becton Dickinson(Le Pont de Claix，France)。细菌培养基LB、耐热(Thermoscript)和高保真钼HIFI酶获自Invitrogen (CergyPontoise, France)。Rneasy mini I式ガ盒、QiaquicK 才ロ Qiaprep miniprep 犾自 Qiagen (Courtaboeuf，France)、获自 Roche Applied Science,且 RACE5’ 3’ RACE 试剂盒获自 Roche Appliedbcience。血管内皮細胞生长因子(VEGF)、成纤维细胞生长因子-2(FGF2)和干扰素Y (INF Y)购自 R&D (Abingdon，UK) 克隆载体 pGEM-T easy 载体和表达载体 pCi neovector购自 Promega (Charbonnigres-les-bains，France),而载体 pET30 获自 Novagen-Merckbioscience (Nottingham，英国由 VWR INTERNATIONAL S.A.S 分销，Fontenay sous Bois，France)。人VEGFA 夹心 ELISA 试剂盒购自 Cell Signaling technology。肽肽7、10、11、7B、7A、7C、2(SEQ ID N0:11)、6(SEQ ID NO:12)和 9(SEQ ID NO:13)由GeneCust化学合成，其N-末端乙酰化和C-末端酰胺化作为化学修饰。所有肽进行HPLC-纯化步骤，并且以纯度为至少95%的冻干粉末提供。蛋白156A如EP1955705中所述获得。动物5周龄无特定病原体的 雌性瑞士裸鼠(Swiss Nude mice)(体重19至22g)购自Charles River laboratories (69592L’Arbresle，France)。动物图养在我们的动物看护设施中直至处死。动物看护设施(CERFE，Evry, France)由法国农业和研究部(FrenchMinistry of Agriculture and Research)认证合格。根据动物实验伦理准则(指导性n° 86/609CEE)和用于实验性肿瘤形成中动物福利的英国准则(English guidelines forwelfare of animals in experimental neoplasiaノ(United Kingdom co-coordmatmgcommittee on cancer research guidelines for welfare of animals in experimentalneoplasia (关于实验性肿瘤形成中动物福利的癌症研究准则的英国协调委员会)(1998).Br.J.Cancer.77:1_10)实施动物实验。方法肽合成所有肽通过化学合成，然后进行HPLC纯化步骤，确保纯化肽的纯度为至少90%。
权利要求
1.于50个氨基酸的肽，其包含选自下列组中的序列之一:SEQID NO:2、SEQ ID NO:USEQ ID NO:3, SEQ ID N0:4、SEQ ID NO:5 和 SEQ ID NO:6，或包含所述序列的具有至少8个氨基酸的片段。
2.根据权利要求1的肽，其中所述肽由8至30个氨基酸组成。
3.根据权利要求1至2中任一项的肽，其中所述肽通过こ酰化和/或酰胺化被化学修饰。
4.一种药物组合物，其包含至少ー种根据权利要求1至3中任一项的肽与药学可接受的赋形剂的组合。
5.根据权利要求4的药物组合物，其用于伤ロ愈合。
6.根据权利要求4至5中任一项的药物组合物，其进ー步包含止血物质、生长因子、抗感染物质、止痛物质、抗炎物质或其组合。
7.一种化妆品组合物，其包含至少ー种根据权利要求1至3中任ー项的肽。
8.根据权利要求4至6中任一项的药物组合物或根据权利要求7的化妆品组合物，其为适于局部给药、可注射给药、ロ服给药或肠胃外给药的形式。
9.根据权利要求8的药物组合物或化妆品组合物，其中所述适于局部给药的形式为洗齐U、油膏剂、凝胶剂、乳膏剂、香膏剂、酊剂、巴布剂、酏剂、糊剂、喷雾剂、洗眼剂、滴剂、混悬剂、分散剂、水凝胶、软膏剂、乳剂或散剂。
10.根据权利要求4至9中任一项的药物组合物或化妆品组合物，其中所述肽将在伤ロ部位施用。
11.根据权利要求4至6和8至9中任一项的药物组合物，其中所述伤ロ是开放性伤□。
12.根据权利要求4至6和8至9中任一项的药物组合物，其中所述伤ロ是闭合性伤□。
13.根据权利要求12的药物组合物，其中所述伤ロ是急性伤ロ或慢性伤ロ。
14.用装置，其包含根据权利要求1至3中任一项的肽或根据权利要求4至6中任一项所述的药物组合物。
15.根据权利要求14的医用装置，其为绷带、纱布、伤ロ敷料或溃疡敷料、皮肤贴片或胶带的形式。
全文摘要
本发明涉及新的肽、包含它们的药物组合物和化妆品组合物以及它们用于伤口愈合的用途。
文档编号A61K38/17GK103097405SQ201180041225
公开日2013年5月8日 申请日期2011年6月14日 优先权日2010年6月14日
发明者S·阿尔·玛穆德, S·科兰 申请人:基因信号国际公司