嵌合凝血因子的制作方法

专利名称：嵌合凝血因子的制作方法
嵌合凝血因子相关申请该专利申请要求以下美国专利申请的权益:于2010年7月9日提交的美国临时专利申请N0.61/363，183 ;于2010年7月9日提交的美国临时专利申请N0.61/363，186 ；于2011年2月11日提交的美国临时专利申请N0.61/442,029 ;于2011年2月11日提交的美国临时专利申请No，61/442，150;于2011年2月11日提交的美国临时专利申请N0.61/442，055 ;于2011年3月25日提交的美国临时专利申请N0.61/467，880 ;和于2011年3月31日提交的美国临时专利申请N0.61/491，762。上面提及的临时专利申请的全部内容通过引用并入本文。
背景技术：
外源性凝血途径的引发通过由于损伤而暴露于血管壁的组织因子与因子VIIa之间的复合物的形成介导。然后该复合物将因子IX和X转化成其活性形式。在组织因子承受细胞上，因子Xa将有限量的凝血酶原转化成凝血酶。然后，所产生的凝血酶从组织因子承受细胞中扩散开并活化血小板，而因子V和VIII，制备因子Va和Villa。在凝血的增殖阶段，因子IXa由在活化血小板表面上的因子IXa(与因子VIIIa复合)产生。与辅因子Va复合的因子Xa活化凝血酶原变成凝血酶，产生凝血酶爆发。通过凝血酶将纤维蛋白原转化成纤维蛋白终止级联反应，这导致形成纤维蛋白血块。在引发凝血中，因子VII和组织因子是关键成员。因子VII是一种血浆糖蛋白，其在血液中以单链酶原循环。该酶原为催化无活性的。尽管单链因子VII可通过多种因子在体内转化成双链因子Vila，但是因子Xa是因子VII的重要的生理活化剂。通过切割连接在氨基酸152位的精氨酸残基和在氨基酸153位的异亮氨酸残基之间的肽键，将酶原因子VII转化成活化的两条链分子。存在组织因子、磷脂和钙离子时，该双链因子VIIa活化因子X或因子IX。因子VIIa被认为是如下凝血级联反应的生理引发剂:通过作用在组织因子生成细胞(典型地，受损内皮细胞)表面，产生初始量的凝血酶，然后凝血酶扩散到血小板以活化它们，并且对它们初免以用于凝血酶原生成的增殖阶段。治疗上来说，重组体FVIIa通过在活化血小板表面上活化因子X、绕过FIXa或FVIIIa在凝血的增殖阶段过程中产生凝血酶爆发的需要而起作用。由于FVIIa对血小板的亲和力相对较低，所以重组FVIIa以超生理水平给药。该过程被认为是不依赖组织因子的。人因子IX以单链糖蛋白循环(分子量57，000)。其在血浆中以酶原存在，并且在钙离子存在时通过因子XIa(活化的血浆促凝血酶原激酶前体)转化成丝氨酸蛋白酶，因子IXa ^ (更普遍称为FIXa)。在该活化反应中，在因子IX中水解两个内部肽键。这些断裂在特异性精氨酰-丙氨酸肽键和特异性精氨酰-缬氨酸肽键上发生。这造成了从前体分子的内部区域中释放活化肽(分子量约等于11，000)并产生因子IXaP (分子量约等于46，000)。因子IXaP由轻链(分子量约等于18，000)和 重链(分子量约等于28，000)组成，而且这些链由二硫键连在一起。因子X还以单链多肽合成，其含有由精氨酸-赖氨酸-精氨酸三肽连接的轻链和重链。然后该单链分子通过两个(或多个)内部肽键断裂而转化成轻链和重链。在血浆中，这两条链通过二硫键连接，从而形成因子X。活化因子X、因子Xa参与最终的共同路径，通过该路径将凝血酶原转化成凝血酶，凝血酶进而将纤维蛋白原转化成纤维蛋白。给患者施用凝血因子以改善止血达一段时间。重组DNA技术的出现极大地改善了对凝血障碍患者的治疗，从而允许开发安全又稳定的蛋白质治疗剂。例如，将重组活化因子VII广泛用于治疗如在患有血友病A或B、凝血因子XI或VII缺乏、血小板功能缺陷、血小板减少或血管性血友病(von Willebrand's disease)的患者中所发生的严重出血。重组因子IX也是治疗上有用的。尽管这样的重组分子是有效的，仍然需要这样的改进形式，即将治疗剂定位于凝血位点，具有改进的药代动力学性质、具有降低的清除率、具有提高的可制备性、具有降低的凝血活性，或具有增强的活性或具有一种以上的这些特征。发明概述本发明涉及具有增强的活性的嵌合凝血因子。本发明的特征尤其在于:用于制备嵌合凝血因子的方法，使用这些方法制备的嵌合凝血因子，以及使用这些凝血因子改善止血的方法。本发明的嵌合凝血因子具有提高的药代动力学性质、具有降低的清除率、具有提高的可制备性、具有降低的凝血活性、具有增强的活性或具有一种以上的这些特征。在一个实施方案中，本发明的改进的凝血因子在需要之处具有增加的活性，例如，通过将凝血因子靶向血小板或者通过以在血块形成的位点被活化的可活化形式(非天然存在的可活化形式)存在于受:试者中。一方面，本发明涉及嵌合凝血因子，其包含选自FVI1、FIX和FX的凝血因子和与血小板结合的靶向部分以及任选地在凝血因子和靶向部分之间的间隔基部分。在一个实施方案中，凝血因子包含由式A、B和C表示的结构，其中A是凝血因子；其中B是间隔基部分； 以及其中C是至少一个与血小板结合的靶向部分。在一个实施方案中，凝血因子包含由选自A B C、C B A的式表示的从氨基端到羧基端的结构。在一个实施方案中，凝血因子在血小板存在下显示出与缺少至少一个靶向部分的适当的对照相比增加的凝血酶生成。在一个实施方案中，凝血因子包含支架部分和任选地第二间隔基部分。在一个实施方案中，凝血因子还包括D和E，其中D是间隔基部分；且E为支架部分，并且其中嵌合凝血因子包含选自ABCD E、ADEB C、EDAB C、CBAD E、EDCB A和C B E D A的式表示的从氨基端到羧基端的结构。在一个实施方案中，E是二聚体Fe区，其包含第一 Fe部分Fl和第二 Fe部分F2。在一个实施方案中，凝血因子被表达为包含在两个Fe部分之间插入的可切割scFc (cscFc)接头的多肽，其中cscFc接头与至少一个引起cscFc多肽接头切割的酶切位点相邻。在一个实施方案中，cscFc接头与至少一个引起cscFc多肽接头切割的酶切位点相邻。在一个实施方案中，权利要求9所述的嵌合凝血因子，其中至少一个酶切位点是细胞内加工位点。
在一个实施方案中，其中多肽接头的两侧为两个酶切位点，其被相同的或不同的酶识别。在一个实施方案中，多肽接头长度为约10个至约50个氨基酸。在一个实施方案中，多肽接头长度为约20个至30个氨基酸。在一个实施方案中，多肽接头包含gly/ser肽。在一个实施方案中，gly/ser肽具有式(Gly4Ser) n或Ser (Gly4Ser) n,其中n是选自1、2、3、4、5、6、7、8、9和10的正整数。在一个实施方案中，(Gly4Ser)n接头选自(Gly4Ser) 6> Ser (Gly4Ser) 6> (Gly4Ser) 4 和 Ser (Gly4Ser) 4。在一个实施方案中，凝血因子包含两条多肽链。在一个实施方案中，嵌合凝血因子具有选自以下的结构:A通过间隔基部分连接Fl且C与F2连接；A通过间隔基部分连接Fl且C通过间隔基部分连接F2 ；A连接Fl且C通过间隔基部分连接F2 ；A通过间隔基部分连接Fl且C通过间隔基部分连接F2。在一个实施方案中，嵌合凝血因子包含两条多肽链，其中第一条多肽链包含部分AB F1、A B F1、A B Fl 或 A B FlD C，且第二条多肽链包含部分 C F2、C D F2、F2D C 或 F2DC，其中两条多肽链形成Fe区。在一个实施方案中，靶向部分融合Fe区的多肽链中的至少一条。在一个实施方案中，靶向部分直接融合Fl和F2中的至少一个。在一个实施方案中，靶向部分通过间隔基部分融合Fl和F2中的至少一个。在一个实施方案中，靶向部分通过可切割接头融合Fl和F2的至少一个。在一个实施方案中，祀向部分选自:抗体分子、抗体分子的抗原结合片段、scFv分子、受体的受体结合部分、肽。在一个实施方案中，其中靶向部分与静息血小板结合。在一个实施方案中，靶向部分选择 性地与活化血小板结合。在一个实施方案中，靶向部分选择性地与选自以下的靶标结合:GPIba、GPVI，和GPIIb/IIIa的非活性形式。在一个实施方案中，靶向部分选择性地与选自以下的靶标结合:GPIIb/IIIa的活性形式、P选择蛋白、GMP-33、1^1^-1、1^1^-2、^4(^和11 -1。在一个实施方案中，靶向部分与GPIb复合物结合。在一个实施方案中，靶向部分是选自下组的肽:PS4、0S1和0S2。在一个实施方案中，靶向部分包含来自抗体的抗体可变区，其选自SCE5、MB9和AP3。在一个实施方案中，其中凝血因子是因子VII。在一个实施方案中，凝血因子是因子VII的高比活变体。在一个实施方案中，凝血因子是因子IX。在一个实施方案中，凝血因子是因子IX的高比活变体。在一个实施方案中，凝血因子是因子X。在一个实施方案中，凝血因子是因子X的高比活变体。在一个实施方案中，凝血因子由细胞以活性形式分泌。在一个实施方案中，凝血因子在体内活化。在一个实施方案中，嵌合凝血因子包含不是天然存在于凝血因子中的异源性酶切位点。在一个实施方案中，酶切位点与凝血因子的重链部分的氨基端基因融合。在一个实施方案中，支架部分是蛋白质分子，其增加嵌合凝血因子的流体动力学半径。在一个实施方案中，支架部分，如果存在，选自白蛋白和XTEN:\另一方面，本发明涉及包含FVII的多肽，所述FVII包含可被凝血级联的组分活化的异源性酶切位点。
在一个实施方案中，多肽包含支架部分和任选地间隔基部分。在一个实施方案中，支架部分是二聚体Fe区，其包含第一 Fe部分Fl和第二 Fe部分F2。在一个实施方案中，凝血因子包含两条多肽链。在一个实施方案中，嵌合凝血因子具有选自以下的结构:凝血因子通过间隔基部分与第一 Fe部分连接；凝血因子通过间隔基部分与第二 Fe部分连接；凝血因子直接连接Fl ;且凝血因子直接连接F2。在一个实施方案中，嵌合凝血因子还包括靶向部分。在一个实施方案中，嵌合凝血因子以单独的多肽链合成，所述多肽链包含cscFc接头。在一个实施方案中，cscFc接头与至少一个引起接头切割的酶切位点连接(例如，直接连接或相邻)。在一个实施方案中，至少一个酶切位点是细胞内加工位点。在一个实施方案中，cscFc接头的两侧为两个酶切位点，其被相同的或不同的酶识别。在一个实施方案中，cscFc接头的长度为约10个至约50个氨基酸。在一个实施方案中，cscFc接头的长度为约20个至30个氨基酸。在一个实施方案中，cscFc接头包含gly/ser肽。在一个实施方案中，gly/ser肽具有式(Gly4Ser)n,或Ser(Gly4Ser)n,其中n是选自1、2、3、4、5、6、7、8、9和10的正整数。在一个实施方案中，(Gly4Ser)n接头选自(Gly4Ser) 6> Ser (Gly4Ser) 6> (Gly4Ser) 4 和 Ser (Gly4Ser) 4。在一个实施方案中，凝血因子是因子VII的高比活变体。在一个实施方案中，不是天然存在于凝血因子中的异源性酶切位点在血块形成的位点被切割。在一个实施方案中，切割位点选自:因子XIa切割位点、因子Xa切割位点和凝血酶切割位点。在一个实施方案中，酶切位点与凝血因子的重链部分的氨基端基因融合。在一个实施方案中，靶向部分与静息血小板结合。在一个实施方案中，靶向部分选择性地与活化血小板结合。在一个实施方案中，靶向部分选择性地与选自以下的靶标结合:GPIba、GPVI，和GPIIb/IIIa的非活性形式。在一个实施方案中，靶向部分选择性地与选自以下的靶标结合:GPIIb/IIIa 的活性形式、P 选择蛋白、GMP-33、LAMP-1、LAMP-2、CD40L 和 L0X-1。在一个实施方案中，支架部分是蛋白质分子，其增加嵌合凝血因子的流体动力学半径。在一个实施方案中，支架部分，如果存在，选自白蛋白和XTENac,,一方面，本发明涉及选自 A B C、C B A、A B C D E、A D E B C、E D A B C、C B AD E、E D C B A、C B E D A的从氨基端到羧基端的结构，其中A为可活化的凝血因子，B不存在或为接头，C为靶向部分，D不存在或为接头,且E为支架部分。在一个实施方案中，凝血因子包含凝血因子的轻链和重链，并且每条轻链和重链被表达为单独的多肽链。在一个实施方案中，本发明编码本发明的嵌合凝血因子的核酸分子。在一个实施方案中，核酸分子存在于载体中。在一个实施方案中，载体还包括编码酶的核苷酸序列，所述酶切割至少一个酶切位点。

在一个实施方案中，本发明涉及包含本发明的表达载体的宿主细胞。在一个实施方案中，宿主细胞表达能够在细胞内加工的酶。在一个实施方案中，所述酶对于该细胞是内源性的。在一个实施方案中，所述酶对于该细胞是外源性的。在另一实施方案中，本发明涉及用于制备嵌合凝血因子的方法，所述方法包含在培养基中培养宿主细胞，并从培养基中回收嵌合凝血因子。在另一实施方案中，本发明涉及包含两条多肽链的加工的、异源二聚体多肽，其中所述加工的、异源二聚体多肽通过在于细胞培养基中培养的细胞中表达载体并且从所述培养基中分离成熟的、异源二聚体多肽来制备。在一个实施方案中，本发明涉及包含嵌合凝血因子和药学上可接受的载体的组合物。在另一实施方案中，本发明涉及包含本发明的核酸分子和药学上可接受的载体的组合物。在另一实施方案中，本发明涉及在受试者中改善止血的方法，其包括施用本发明的组合物。一方面，本发明涉及嵌合凝血因子，其包含凝血因子的轻链部分和重链部分，以及至少一个靶向部分，其中所述靶向部分(i)与血小板特异性结合，(ii)不在凝血因子的轻链和重链之间插入，并且其中所述嵌合凝血因子在血小板存在下显示出与缺少至少一个靶向部分的适当的对照相比增加的凝血酶生成。另一方面，本发明涉及嵌合凝血因子，其包含呈线性序列的部分A-B-C-D-E，其中A为凝血因子、可活化的凝血因 子或活化凝血因子；B不存在或为接头；C为靶向部分；D不存在或为接头；且E不存在或为支架部分。又一方面，本发明涉及嵌合凝血因子，其包含选自A B C、A B⑶E、A D E B C、EDAB C、CBAD E、EDCB A、CBEDA的从氨基端至羧基端部分的线性序列，其中A为凝血因子、可活化的凝血因子或活化凝血因子，B不存在或为接头，C为靶向部分，D不存在或为接头，且E为支架部分。再一方面，本发明涉及嵌合凝血因子，其包含选自ABFl:F2、ABFl:⑶F2、ABFl:F2DC、ABFlDC:F2DC的从氨基端至羧基端部分的线性序列，其中A为凝血因子、可活化的凝血因子或活化凝血因子，B不存在或为接头，C为靶向部分，D不存在或为接头，且Fl和F2各自为Fe部分，并且:表示由两条多肽链的Fl和F2链介导的二聚化。又一方面，本发明涉及嵌合凝血因子，其包含凝血因子的轻链部分和重链部分，以及至少一个靶向部分，其中所述靶向部分与血小板特异性结合，其中所述嵌合凝血因子包含二硫键连接的Fe区，所述Fe区包含两条多肽链。附图简述

图1示出了示例性的嵌合凝血因子构建体，其包括祀向结构域。这些示例性的构建体包含Fe区。图2示出了示例性的嵌合凝血因子构建体,其包括祀向结构域。这些示例性的构建体包含可切割的单链Fe (cscFc)，其中scFc接头由细胞加工，在所述细胞中其被表达形成双链Fe区。图3示出了示例性的嵌合凝血因子构建体，其包含靶向结构域，其中凝血因子部分缺少Gla结构域。这些示例性的构建体包含Fe区。
图4示出了示例性的嵌合凝血因子构建体，其包含靶向结构域，其中凝血因子部分缺少Gla结构域。这些示例性的构建体包含可切割的单链Fe (cscFc),其中scFc接头由细胞加工，在所述细胞中其被表达形成双链Fe区。图5示出了示例性的嵌合凝血因子构建体，其被活化(例如，在体内活化后或者通过单独表达凝血因子的轻链和重链)或者是可活化的，即其包含可在体内的凝块位点切割的部分(参见小图D和E)。这些示例性的构建体包含Fe区。构建体A、B和C在早期实验中没有很好表达。图6示出了示例性的嵌合凝血因子构建体，其被活化(例如，在体内活化后或者通过单独表达凝血因子的轻链和重链)或者可活化的，即其包含可在体内的凝块位点切割的部分。这些示例性的构建体包含可切割的单链Fe (cscFc)，其中scFc接头由细胞加工，在所述细胞中其被表达形成双链Fe区。图7示出了示例性的嵌合凝血因子构建体，其包括靶向结构域。图8示出了示例性的嵌合凝血因子构建体，其包含靶向结构域，其中凝血因子部分缺乏Gla结构域。图9示出了示例性的嵌合凝血因子构建体，其被活化(例如，在体内活化后或者通过单独表达凝血因子的轻链和重链)或者可活化的，即其包含可在体内的凝块位点切割的部分。图10示出了用于纯化和活化FVI1-Oll的SDS PAGE。图11示出了用于纯化活性FVI1-053的SDS PAGE。图12示出了 FVI1-Ol和FVI1-102的示意图，并且示出了通过FACS测定的FVI11-011和FVI1-027与活 化血小板的结合。图13示出了在活化血小板存在下测量FVI1-027、FVI1-Oll和Novoseven的活性的凝血酶生成测定。图14示出了 PAC-1消除与血小板结合的增加以及与FVI1-027有关的凝血酶生成速率的增加。图15示出了在活化血小板存在下测量FVI1-037和Novoseven的活性的凝血酶生成测定中使用的构建体。图16示出了在活化血小板存在下测量FVI1-037和Novoseven的活性的凝血酶生成测定。图17 示出了在活化血小板存在下测量 FVI1-044、FVI1-045、FVI1-046、FVI1-Oll和Novoseven的活性的凝血酶生成测定(如图18所示)中使用的构建体。图18 示出了在活化血小板存在下测量 FVI1-044、FVI1-045、FVI1-046、FVI1-Oll和Novoseven的活性的凝血酶生成测定。图19 示出了在活化血小板存在下测量 FVI1-047、FVI1-048、FVI1-049、FVI1-Oll和Novoseven的活性的凝血酶生成测定(如图20所示)中使用的构建体。图20 示出了在活化血小板存在下测量 FVI1-047、FVI1-048、FVI1-049、FVI1-Oll和Novoseven的活性的凝血酶生成测定。图21示出了在活化血小板存在下测量FVI1-053和FVI1-Oll的活性的凝血酶生成测定(如图22所示)中使用的构建体。
图22示出了在活化血小板存在下测量FVI1-053和FVI1-Oll的活性的凝血酶生成测定。图23示出了 PAC-1消除与FVI1-053有关的凝血酶生成速率的增加。图24示出了短暂转染HEK293细胞和蛋白A pulldown之后，FVIIFc种类的蛋白质印迹分析(如图25所示)中使用的构建体。图25示出了短暂转染HEK293细胞和蛋白A pulldown之后，FVIIFc种类的蛋白质印迹分析。 图26示出了在具有或不具有pSYN-PC5-003下短暂转染pSYN-FVI1-024之后，蛋白A免疫沉淀的蛋白质印迹。泳道1:非还原性pSYN-FVI1-024 ;泳道2，非还原性pSYN-FVI 1-024 ;泳道 3，还原性 pSYN-FVI1-024 ;泳道 4，还原性 pSYN-FVI1-024。图27示出了短暂转染HEK293细胞和蛋白A pulldown之后，FVIIFc种类的蛋白质印迹分析(Fe western)。图28 示出了通过 FXIa 处理的 FVI1-039 和 FVI1-040。图29示出了向GPIIbIIIa的活性形式的FVIIaFc变体靶，其示出了增加的凝血酶生成速率。图30示出了测量A型血友病人血液中的FVI1-088和野生型重组FVIIaFc的活性的Rotation凝血弹性测量法(ROTEM)测定。图中示出了凝血时间、血块形成的时间和a角度参数。图31示出了示例性的切割位点和这种切割位点在可活化的凝血因子构建体中的说明性位置。在该图中 ，FVII用作实例。图32示出了图31中说明的构建体的切割。图33示出了另外的可活化的构建体及说明其切割的蛋白质印迹。图34示出了使用FVI1-062和FVI1-090构建体的凝血酶生成测定的结果。FVI1-062是阴性对照，其缺乏凝血酶切割位点，所以构建体不能被活化。FVI1-090包含ALRPR切割位点，所以被凝血酶活化。图35说明了高比活FVII变体的切割。FVII重链Fe和轻链Fe在带I中折拢，因为重链在插入胰蛋白酶170环后失去了糖基化位点并变得很小。图36说明了使用FVI1-090和FVI1-100的凝血酶生成测定的结果。图37说明了使用FVI1-090和FVI1-115的凝血酶生成测定的结果。图38说明了被凝血酶活化的可活化FVIIFC的氨基酸分解活性。可活化的变体的氨基酸分解活性可在凝血酶活化后被测量，并且与FVI1-090相比，高比活变体的氨基酸分解活性增加。在这些测定中，可活化分子被凝血酶活化后，加入水蛭素以抑制显色底物的凝血酶裂解。以这种方式，凝血酶不干扰检测FVIIa活性的能力。图39说明了使用底物S2765通过FVIIa测量FX活化的测定的结果，所述底物不被FVIIa切割。在该测定中，在37°C下使用FVIIaFc将IOuM FX孵育15分钟。该反应用EDTA淬灭，并加入底物。图39示出了对照实验的结果，其证明了通过FVIIaFc活化的FX能够被检测。图40示出了“可活化的FVIIFc”的FXa生成活性。图40中示出的该实验示出了高比活变体的FX活化活性增加。在该实验中，FVIIFc (IOOnM)被凝血酶(IOOnM)活化，力口入水蛭素以抑制凝血酶。加入FX(IOuM)，接着加入EDTA以抑制反应。通过检测FXa底物来测量FX的活性。图41说明了示例性的可活化的构建体形式，其包括用于FVI1-118、FVI1-119和FVI1-127中的可活化的单体结构。图42说明了与异源二聚体(FVI1-090)相比，可活化的构建体，特别是单体(FVI1-118和FVI1-119)的凝血酶切割的效能。图43说明了将野生型可活化的FVIIFc (FVI1-118)与高比活变体(FVI1-127)比较的凝血酶生成测定的结果。图44A说明了几个靶向构建体。在这种情况下，在该构建体的各种位置上包括与GPIIbIIIa的活性构象结合的SCE5scFv。图44B说明了通过使用这些构建体在富含血小板的缺乏FVIII的血衆中进行的凝血酶生成测定的结果。N7是Novoseven对照。图44C说明了通过FACs进行的重组FVIIaFc变体与血小板的结合。图45A说明了几个靶向FVIIa构建体，其包括AP3，一种对抗存在于静息血小板和活化血小板上的GPIIbIIIa的scFv。图45B示出了在富含血小板的缺乏FVIII的血浆中的凝血酶生成测定的结果。图45C示出了通过FACS进行的rFVIIaFc变体与血小板的结合。图46A示出了几个靶向FVIIa构建体，其使用与该分子结合的肽，特别是PS4、0S1和0S2肽靶向GPIb- a。图46B示出了使用图46A所示的C端肽构建体在富含血小板的缺乏FVIII的血浆中进行的凝血酶生成测定的结果。图47A示出了使用图46A所示的N端肽构建体在富含血小板的缺乏FVIII的血浆中进行的凝血酶生成测定的结果。图47B示出了 FVI1-045与FVI1-048的直接比较。图48示出了通过FACS测定的FVI1-045和FVI1-048以及野生型FVIIaFc与血小板的结合。该图还示出了如Bernard等，Biochemistry2008, 47:4674-4682中报导的革巴向肽的亲和力。图49A示出了示例性的靶向FVIII构建体。图49B示出了在缺乏FVIII的富含血小板的血浆中进行的凝血酶生成测定的结果。在该实验中，用组织因子(上图)或通过血小板活化(下图)活化该测定。图50示出了测量包含gla结构域(FVI1-Oll)而缺乏gla结构域(FVI1-028)的靶向FVII构建体的半衰期的实验的结果。图51A示出了几个FIX构建体，其包含靶部分，在此实例中是SCE5scFv。图51B示出了通过使用图51A的构建体在富含血小板的缺乏FIX的血浆中进行的凝血酶生成测定的结果。图51C说明了如通过凝血酶生成所测量的，FIX-068和FIX-088都具有比FIX-042高至少4倍的活性。图52A示出了通过 比较FIX-090和Benefix进行的凝血酶生成测定的结果。图52B示出了 FIX-090的活性几乎为Benefix活性的四倍。图53A示出了靶向FIX构建体，其包含与在静息血小板和活化血小板上存在的GPIb结合的肽。图53B示出了在富含血小板的缺乏FIX的血浆中进行的凝血酶生成测定的结果。图53C说明了如通过凝血酶生成所测定的，FIX-089比FIX-042大约强4倍，但其具有较低的比活。发明详述
本发明涉及嵌合凝血因子。本发明基于，至少部分基于增强凝血因子的效力、药代动力学性质和/或可制备性的新方法的开发。在一个实施方案中，本发明的改进的凝血因子在需要之处具有增加的活性，例如通过使凝血因子靶向血小板或者通过以在血块形成的位点被活化的可活化形式(非天然存在的可活化形式)存在于受试者中。这可以，例如通过靶向凝血因子或通过以可活化形式制备它们来完成。在一个实施方案中，主题凝血因子靶向凝血位点。通过结合将凝血因子靶向静息血小板或活化血小板的靶向部分，可增强凝血因子的活性。例如，在因子VII的实例下，不像内源性FVII (其有可能通过组织因子(TF)在内皮细胞表面活化以生成活化因子X(FXa))，外源性FVII有可能以不依赖于TF的方式生成FXa/FIXa，在其他凝血因子定位于其中的活化血小板的表面处最有效。然而，生理学上来说，FVIIa在TF生成细胞(如内皮细胞)的表面起作用，并且对于血小板具有低亲和力。据推测，治疗重组体FVIIa通过在活化血小板表面将因子X转化成因子Xa起作用。为了克服低血小板亲和力并且在治疗出血方面有效，以超生理水平给药重组FVIIa。因此，在FVIIa的实例下，靶向血小板表面能显著增加该分子的效力。尽管其他的凝血因子(例如FIX、FVII1、FX)具有高血小板亲和力，但是这些也可通过结合血小板靶向部分而表现出增强的活性。另外，FVIIa在人体内具有相对短的半衰期C2.3小时)。这种短的半衰期可能归因于需要多次给药重组FVIIa以控制出血。因此，将凝血因子，特别是FVIIa靶向至血小板可提高效能。靶向部分可 以位于嵌合凝血因子的许多位置。列出了靶向的嵌合凝血因子的示例性结构，例如在图1_4、7、8、17、19、21、44、46、49、51和53中所示。在另一实施方案中，本发明的嵌合凝血因子以可在凝血位点活化的形式制备。对于在旁路治疗中的应用，只有当以活化形式给予时，外源性凝血因子才是有效的。然而，这种活化的凝血因子通过内源性途径(例如抗凝血酶II1、TFPI)快速失活，导致活性形式的清除以及短的有效半衰期。给予高剂量并没有解决这个问题，因为它可以导致凝血效果。因此，在一个实施方案中，本发明涉及“可活化的”嵌合凝血因子构建体，其包含不是通常存在于凝血因子中的异源性酶切位点，这些分子作为增强的酶原循环，并且由于给药后缺乏失活而具有较长的半衰期，但是其很容易在凝血位点通过酶切割被活化。在一个实施方案中，这样的异源性酶切位点是在凝血级联反应中产生的酶的异源性酶切位点。例如，在一个实施方案中，可活化的构建体的异源切割位点包含因子XIa、Xa或凝血酶切割位点。示例性的FXIa切割位点包括，例如TQSFNDFTR和SVSQTSKLTR。示例性的凝血酶切割位点包括，例如DFLAEGGGVR、TTKIKPR和ALRPR。在一个实施方案中，异源切割位点在凝血因子的轻链和重链之间插入。在另一实施方案中，异源切割位点不在凝血因子的两条链之间插入。在一个实施方案中，异源切割位点是凝血因子重链的氨基端。存在于可切割接头中的异源切割位点能够置于嵌合凝血因子的多个位置。列出了可活化的嵌合凝血因子的示例性结构，例如在图5、6、9、29、27、31和41中所示。典型地,示例性的此类构建体在血块形成存在下被活化，并且以下进行更详细的描述。在一个实施方案中，本发明的嵌合凝血因子包含支架，例如，以增加分子的流体动力学半径。例如，本发明的嵌合凝血因子可以是融合蛋白。示例性的支架包括，例如FcRn结合部分(例如，完整Fe区或者其部分，其结合于FcRn)，单链Fe区(ScFc区，例如，如US2008/0260738、W02008/012543 或 W02008/1439545 中所描述)、可切割 scFc 区(如本文所描述的cscFc区)、不太复杂的蛋白质及其部分，例如XTen多狀 或白蛋白。在一个实施方案中，本发明的嵌合凝血因子使用Fe区或其FcRn结合部分作为支架部分。在一个实施方案中，与嵌合凝血因子融合的Fe部分为天然存在的(或野生型(WT))Fe部分。在另一实施方案中，Fe部分包含序列中的一个或多个变异。在另一实施方案中,Fe部分是scFc部分(例如,包含不可切割的接头或cscFc接头)。在包含cscFc接头的构建体中，未加工的分子包含可切割的单链Fe区，在单链Fe区中组分Fe部分以单个多肽链基因融合，从而形成功能的、单链、二聚体Fe区。scFc多肽接头能够串联连接将包含多肽的二聚体Fe区的Fe部分或可将一个Fe部分与构建体的非Fe部分(例如凝血因子或祀向部分)连接，非Fe部分进而连接第二 Fe部分。该cscFc接头在Fe部分之间插入，所述Fe部分包含scFc区并且两侧具有至少一个酶切位点，例如细胞内酶加工点。在一个实施方案中，scFc接头的两侧为两个酶切位点，当由核酸分子编码的蛋白质在细胞中加工时， 导致接头切除(例如全部或基本上全部的接头)。在另一实施方案中，scFc接头与至少一个酶切位点相邻(该酶切位点允许在多肽被细胞分泌后体外切割接头)或者包含至少一个酶切位点(该酶切位点允许在向受试者施用构建体后体内切割接头)。因此，在一个实施方案中，尽管这种多肽包含在单个开放阅读框(ORF)中编码的scFc区作为未加工形式的一个连续核苷酸序列的部分，但是cscFc接头被酶切割(例如在施用之前或在施用之后体内)，导致为包含Fe区的异源二聚体分子的多肽不以单个氨基酸链融合，即获得的加工的构建体具有Fe区，其包括两条多肽链。在该实施方案中，全部或基本上全部的接头被切除，而在一些实施方案中，切割位点的一部分可以保留，例如RRRR切割位点的四个精氨酸。在一个实施方案中，scFc接头的两侧为用于切割的两个加工位点。这两个加工位点可以相同或不同。在一个实施方案中，至少一个加工位点是碱性氨基酸残基簇，其被精氨酸kex2/弗林蛋白酶识别。所述酶直接切割精氨酸残基的C端。在另一实施方案中，至少一个切割位点为可在体内被切割的切割位点，例如被凝血酶识别的切割位点。在一个实施方案中，本发明的嵌合凝血因子在包含csFc接头的scFc分子的背景下以活性形式制备。例如，因子VII通常作为酶原重组地制备，并在制备期间要求活化以生成用于施用的活性形式。在一个实施方案中，本发明的嵌合凝血因子由细胞分泌，在该细胞中其以活性形式表达从而提高可制备性。正如下文更详细地列出，这种凝血因子能够通过将单链Fe区整合到分子中来制备。单链Fe区通过Fe部分的二聚化来形成，所述Fe部分存在于单个多肽链中。在一个实施方案中，这种构建体包含scFc多肽接头，其连接scFc的两个Fe部分，所述scFc与至少一个内源性加工位点相邻。例如，当蛋白质与在反式高尔基体中的活性加工酶共定位时，这种构建体的切割被延迟直到分泌途径后期。在一个实施方案中，表达编码本发明的多肽的构建体的细胞内源性表达酶，该酶在一个或多个加工位点切割scFc接头，导致嵌合分子包含两条多肽链。在另一实施方案中，表达编码本发明的多肽的构建体的细胞外源性表达酶，该酶在一个或多个加工位点切表I] scFc接头。在一个实施方案中，本发明的嵌合凝血因子能够组合两个或多个这些特征以生成优化的构建体，例如使可活化的融合蛋白构建体靶向静息血小板，以使其能够被有效活化以及在活性凝血位点以较高局部浓度被活化。示例性的这种组合构建体包括都是靶向的嵌合凝血因子并且包含用于增强加工的scFc接头。在另一实施方案中，本发明的构建体是靶向并且可活化的。在所附的附图和序列表中对本发明的示例性构建体进行说明。在一个实施方案中，本发明涉及具有如附图中所示的结构的多肽。在另一实施方案中，本发明涉及具有所附的序列表中列出的序列的多肽，或编码此类多肽的核酸分子。在一个实施方案中，本发明涉及具有所附的序列表中列出的序列的成熟形式的多肽。应理解的是，这些构建体及编码其的核酸分子能够用于在受试者改善止血。为了更加清楚的理解本说明书和权利要求，下面提供了以下定义。1.定义本文中使用的术语“蛋白质”或“多肽”是指两个或两个以上的天然氨基酸或非天然氨基酸的聚合物。术语“氨基酸”包括丙氨酸(Ala或A)、精氨酸(Arg或R)、天冬酰胺(Asn或N)、天冬氨酸(Asp或D)、半胱氨酸(Cys或C)、谷氨酰胺(Gln或Q)、谷氨酸(Glu或E)、甘氨酸(Gly或G)、组氨酸(His或H)、异亮氨酸(lie或I)、亮氨酸(Leu或L)、赖氨酸(Lys或K)、蛋氨酸(Met或M)、苯丙氨酸(Phe或F)，脯氨酸(Pro或P)、丝氨酸(Ser或S)、苏氨酸(Thr或T)、色氨酸(Trp或W)、酪氨酸(Tyr或Y)和缬氨酸(Val或V)。非传统的氨基酸也包括在本发明的范围内，其包括正亮氨酸、鸟氨酸、正缬氨酸、高丝氨酸，以及如Ellman等，Meth.Enzym.202:301-336(1991)所描述的其他氨基酸残基类似物。为了产生这样的非天然存在的氨基酸残基，可以使用Noren等,Science244:182 (1989)和Ellman等，同上。简言之,这些过程涉及化学地活化具有非天然存在的氨基酸残基的抑制子tRNA，接着在体外转录和翻译RNA。同样可以使用本领域已知的肽化学完成非传统氨基酸的引入。本文中使用的术语“极性氨基酸”包括静电荷为零的氨基酸，但在其侧链的不同部分具有非零部分电荷(例如M、F、W、S、Y、N、 Q、C)。这些氨基酸能够参与疏水相互作用和静电相互作用。本文中使用的术语“带电氨基酸”包括氨基酸，其在其侧链上具有非零静电荷H^^BR、K、H、E、D)。这些氨基酸能够参与疏水相互作用和静电相互作用。“氨基酸置换”是指在预定的氨基酸序列(起始多肽的氨基酸序列)中至少一个现有氨基酸残基被第二个不同的“替代”氨基酸残基替代。“氨基酸插入”是指将至少一个另外的氨基酸整合到预定的氨基酸序列中。尽管插入通常由一个或两个氨基酸残基的插入组成，但是可制备目前较大的“肽插入”，例如插入约三到五个、甚至最高约十、十五或二十个氨基酸残基。插入的残基可以天然存在或非天然存在的，如上所公开的。“氨基酸缺失”是指从预定的氨基酸序列中移除至少一个氨基酸残基。多肽可以是单体或者多聚体。例如，在一个实施方案中，本发明的蛋白是二聚体。本发明的二聚体多肽可包含两条多肽链或可由一个多肽链组成(例如，在scFc分子的实例下)。在一个实施方案中，本发明的二聚体是同源二聚体，其包含两个相同的单体亚基或多肽(例如，两个相同的Fe部分或两个相同的生物活性部分)。在另一实施方案中，本发明的二聚体是异源二聚体，其包含两个非相同的单体亚基或多肽(例如，包含两个不同的凝血因子或其部分或仅包含一个凝血因子)。参见，例如，美国专利7404956，其以引用方式并入本文。本文中使用的术语“多肽接头”是指肽或多肽序列(例如，合成肽或多肽序列)，其连接多肽链的线性氨基酸序列的两个结构域。在一个实施方案中，本发明的多肽由核酸分子编码，所述核酸分子编码多肽接头，该多肽接头直接或间接地连接两个组成构建体的Fe部分。本文中使用的这些接头为“scFc接头”，并且scFc接头在多肽的两个Fe部分之间插入，其中多肽包括scFc接头。如果scFc接头连续地连接线性多肽序列中的两个Fe部分，则其为“直接”连接。反之，scFc接头可以连接第一 Fe部分到结合部分，其进而连接第二 Fe部分,从而形成间接连接。这些scFc接头允许形成单链基因构建体。在一个实施方案中，该多肽包含酶切位点，其导致scFc接头可被切割(cscFc接头)，并且在一个实施方案中，基本上被切除(例如，在细胞的加工过程中)。因此，所获得的加工的多肽是嵌合分子，其包含至少两个氨基酸并且基本上缺少外部接头氨基酸序列。在一些实施方案中，切除了所有或基本上所有的接头，而在一些实施方案中，切割位点的一部分可以保留，例如RRRR切割位点的四个精氨酸。在另一实施方案中，多肽接头的另一种类型，此处也称为“间隔基”可以用于连接不同的部分，例如，将凝血因子或靶向部分与多肽上的Fe部分连接。这种接头类型可以提供给多肽分子灵活性。典型地，间隔基不被切割；然而，在某些实施方案中，这种切割是期望的。在附图中示出了间隔基示例性的位置。间隔基可以位于凝血因子、靶向部分和/或支架之间，例如在这些部分的N端或C端。在一个实施方案中，这些接头在加工过程中未被除去。可存在于本发明的嵌合凝血因子的第三种类型的接头在本文也称为“可切割的接头”，其包括异源切割位点(例如，因子XIa、Xa或凝血酶切割位点)，并且其可在切割位点的N端或C端或两端包括另外的间隔基接头。在附图中示出了这种位点的示例性的位置，其包括，例如邻近靶向部分的位置。在另一实施方案中，所述接头可以邻近凝血因子或其部分。例如，在一个实施方案中，可切割的接头可与凝血因子的重链的N端融合以制备凝血因子的可活化的形式。在这种实例下，可切割的接头可在切割位点的N端包括另外的间隔基接头，但要求切割位点的C端与凝血因子的重链的氨基端直接融合。本文中使用的术语“gly-ser多肽接头”是指由甘氨酸和丝氨酸残基组成的肽。示例性的gly/ser多肽接头包含氨基酸序列(Gly4Ser)n(SEQ ID N0:4)。另一示例性的gly/ser多肽接头包含氨基酸序列S (Gly4Ser) n。在一个实施方案中，n=l。在一个实施方案中，n=2。在另一实施方案中，n=3，SP(Gly4Ser) 3o在另一实施方案中，n=4,即(Gly4Ser) 4 (SEQ ID N0:6)。在另一实施方案中，n=5。在又一实施方案中，n=6。在另一实施方案中，n=7。在又一实施方案中，n=8。在另一实施方案中，n=9。在又一实施方案中，n=10。另一示例性的gly/ser多肽接头包含氨基酸序列Ser (Gly4Ser)n(SEQ ID NO:26) 0在一个实施方案中，n=l。在一个实施方案中，n=2。在优选实施方案中，n=3。在另一实施方案中，n=4。在另一实施方案中，n=5。在又一实施方案中，n=6。“源自”指定的多肽或蛋白的多肽或氨基酸序列，是指多肽源。优选地，源自特定序列的多肽或氨基酸序列具有与所述序列或其部分基本上相同的氨基酸序列，其中该部分由至少10-20个氨基酸，优选地至少20-30个氨基酸，更优选地至少30-50个氨基酸组成，或其可被本领域普通技术人员以其它方式鉴定为在序列中具有其来源。

来自另一个肽的多肽相对于起始多肽可具有一个或多个突变，例如，一个或多个氨基酸残基被另外的氨基酸残基置换或者其具有一个或多个氨基酸残基插入或缺失。优选地，多肽包含非天然存在的氨基酸序列。这种变体必然地与起始抗体具有少于100%的序列同一性或相似性。在优选实施方案中，变体，例如在变体分子的长度上，将与起始多肽的氨基酸序列具有约75%至少于100%的氨基酸序列的同一性和相似性，更优选地约80%至少于100%,更优选地约85%至少于100%，更优选地约90%至少于100%(例如，91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%)，最优选地，约95%至少于100%。在一个实施方案中，在起始多肽序列与由此产生的序列之间有一个氨基酸差异。关于该序列的同一丨I"生和相似性在本文被定义为在比对序列并引入缺口(如有必要)以实现最大的序列同一性百分比后，候选序列中与起始氨基酸残基相同的氨基酸残基(即相同的残基)的百分比。本发明优选的多肽包含源自人蛋白序列的氨基酸序列(例如，至少一个凝血因子或Fe部分或结构域)。然而，多肽可包含来自其他哺乳类动物的一个或多个氨基酸。例如，凝血因子，Fe结构域或靶向部分可以源自非人物种，并且包括在主题多肽中。可选地，源自非人物种的多肽中可以存在一个或多个氨基酸。本发明的优选多肽不具有免疫原性。本领域普通技术人员还应该理解的是，本发明的多肽可以变化，以使多肽与其所源自的天然存在或天然的多肽在氨基酸序列方面不同，同时保留天然多肽的期望活性。例如，可以进行核苷酸或氨基酸置换，导致“非必要”氨基酸残基发生保守置换或改变。可通过将一个或多个核苷酸置换、添加或缺失引入免疫球蛋白的核苷酸序列中产生编码源自免疫球蛋白(例如，Fe结构域、部分或抗原结合位点)的多肽的非天然变体的分离的核酸分子，以使将一个或多个氨基酸置换、添加或缺失引入所编码的蛋白中。通过标准技术引入突变体，例如定点突变和PCR介导的诱变。本发明的多肽在一个或多个氨基酸残基处，例如在必需或非必需氨基酸残基处可包含保守的氨基酸置换。“保守的氨基酸置换”是氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基替代。具有相似侧链的氨基酸残基家族在本领域已经确定，其包括碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)，酸性侧链(例如，天冬氨酸、谷氨酸)，未荷电的极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)，非极性侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸 、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)，3 -分支侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)以及芳香族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此，多肽中的非必需氨基酸残基可以被另外的来自相同侧链家族的氨基酸残基替代。在另一实施方案中，氨基酸串可以被结构上类似的顺序不同的串和/或侧链家族成员的组合物替代。可选地，在另一实施方案中，可在编码序列的全部或其部分随机引入突变，例如通过饱和诱变，并且所获得的突变体能够被整合到本发明的多肽中，并筛选其结合所需靶标的能力。在多肽的上下文中，“线性序列”或“序列”是氨基酸在多肽中从氨基端到羧基端方向的顺序，其中序列中彼此紧邻的残基在多肽的初级结构序列中是连续的。本文中使用的术语“连接”，“融合的”或“融合”是指通过肽键(例如，基因融合)、化学连接或其他方式的连接。例如，可以连接分子或部分的一种方式采用通过肽键连接分子或部分的多肽接头。术语“基因融合的”、“基因连接的”或“基因融合”可以互换地使用，并且是指两个或两个以上的蛋白质、多肽及其片段经由其单独的肽骨架共线性、共价连接或连接，通过编码这些蛋白质、多肽或其片段的单个多聚核苷酸分子进行基因表达。这种基因融合导致单个连续基因序列的表达。优选的基因融合在框内，即两个或更多个开放阅读框(ORF)被融合以形成连续的更长的0RF，以保持原始ORF的正确阅读框的方式进行。因此，获得的重组融合蛋白是含有两个或更多个的蛋白片段的单个多肽，所述蛋白片段对应于由原始ORF编码的多肽(所述片段通常并不是天然连接)。在这种情况下，在加工过程中单个多肽被切割以生成包含两条多肽链的嵌合分子。本文中使用的术语“Fe区”被定义为多肽的部分，所述多肽对应于天然免疫球蛋白的Fe区，即通过其两条重链的各自Fe结构域的二聚体缔合形成。天然Fe区是同源二聚的并且包含两条多肽链。相比之下，本文中使用的术语“基因融合的Fe区”或“单链Fe区”(scFc区)是指合成的嵌合Fe区，其由在单个多肽链中基因连接(即在单个连续的基因序列中编码)的Fe结构域组成。本文中使用的术语“Fe结构域”是指单个免疫球蛋白重链的部分，其开始于铰链区(正好位于木瓜蛋白酶切割位点的上游(即在IgG中的残基216，取重链恒定区的第一残基为114位))，并结束于抗体C端。因此，完整Fe结构域包含至少铰链结构域、CH2结构域和CH3结构域。本文中使用的术语“Fe结构域部分”或“Fe部分”包括Fe结构域或源自Fe结构域的氨基酸序列。在某些实施方案中，Fe部分包含以下中的至少一个:铰链(例如，上、中和/或下铰链区 )结构域、CH2结构域、CH3结构域、CH4结构域或其变体、部分及片段。在其他实施方案中，Fe部分包含完整Fe结构域(即铰链结构域、CH2结构域和CH3结构域)。在一个实施方案中，Fe部分包含融合到CH3结构域(或其部分)的铰链结构域(或其部分)。在另一实施方案中，Fe部分包含融合到CH3结构域(或其部分)的CH2结构域(或其部分)。在另一实施方案中，Fe部分由CH3结构域或其部分组成。在另一实施方案中，Fe部分由铰链结构域(或其部分)和CH3结构域(或其部分)组成。在另一实施方案中，Fe部分由CH2结构域(或其部分)和CH3结构域组成。在另一实施方案中，Fe部分由铰链结构域(或其部分)和CH2结构域(或其部分)组成。在一个实施方案中，Fe部分缺少CH2结构域(例如，全部或部分CH2结构域)的至少一部分。本文中使用的术语“半衰期”是指特定多肽在体内的生物半衰期。半衰期可以通过向受试者施用的量的半数在动物的循环和/或其他组织中清除所需的时间表示。当给定多肽的清除曲线构建为时间函数时，该曲线通常是快速a相和更长的P相的双相曲线。典型地，a相表示在血管内和血管外的空间之间施用Fe多肽的平衡，其部分由多肽的大小确定。典型地，P相表示位于血管内空间的多肽的分解代谢。因此，在优选的实施方案中，本文中使用的术语半衰期是指多肽在P相中的半衰期。在人体中的人抗体的典型P相半衰期为21天。本文中使用的术语“部分”是指嵌合多肽的组成部分或组分。本文中使用的术语“靶向部分”是指多肽的分子、其部分及其片段的组成，其定位或定向本发明的多肽到所需位点或细胞。在一个实施方案中，本发明的构建体包含“靶向部分”，其例如，通过将分子定位在所需位点增强多肽的活性。这样的部分可以例如使抗体及其变体(例如，和scFv)或肽。在另一实施方案中，这种靶向部分可以是多肽、配体的受体结合部分或受体的配体结合部分，其连接本发明的多肽并与所需靶标(例如，在细胞或组织中的靶标)结合。靶向部分可以与构建体基因融合，与构建体化学缀合或通过间隔基与构建体连接。例如，靶向部分可以通过形成位于构建体的靶向部分和Fe部分之间的键与本发明的构建体连接，其中靶向部分包含第一官能团并且Fe部分包含第二官能团，其中第一官能团和第二官能团能够彼此相互反应以形成化学键(参见，例如，美国专利7381408)。在一个实施方案中，靶向部分结合血小板。以下将更详细地描述示例性的靶向部分。在一个实施方案中，用于本发明构建体中的靶向部分包含抗体变体。术语“抗体变体”或“修饰的抗体”包括不是天然存在的抗体，其的氨基酸序列或氨基酸侧链化学与天然获得的抗体的氨基酸序列或氨基酸侧链化学的不同之处在于如本文所述的至少一个氨基酸或氨基酸修饰。本文中使用的术语“抗体变体”包括抗体的合成形式，所述抗体改变以使其不是天然存在的，例如，包含至少两条重链部分但是两条不完整的重链(例如，结构域缺失抗体或小体)的抗体；抗体的多特异性形式(例如，双特异性、三特异性等)，其被改变以结合到两个或两个以上的不同抗原上或在单个抗原的不同表位上)；与scFv分子连接的重链分子；单链抗体；双抗体；三抗体；以及具有改变的效应子功能的抗体及其类似物。本文中使用的术语“scFv分子”包括结合分子，其由一条轻链可变结构域(VL)或其部分及一条重链可变结构域(VH)或其部分组成，其中每个可变结构域(或其部分)来自相同或不同的抗体。scFv分子优选地包含scFv接头,其在VH结构域和VL结构域之间插入。scFv分子在本领域已知，并在例如，美国专利5，892，019，Ho等，1989.Gene77:51 ；Bird等，1988Science242:423 ；Pantoliano 等，1991.Biochemistry30:10117 ；Milenic 等，1991.Cancer Research51:6363 ;Takkinen 等，1991.Protein Engineering4:837 中描述。本文中使用的“scFv接头”是指在scFv的VL和VH结构域之间插入的部分。scFv接头优选地将scFv分子以抗原结合构象维持。在一个实施方案中，scFv接头包含scFv接头肽或由scFv接头肽组成。在某些实施方案中，sc`v接头肽包含gly/ser多肽接头或由gly/ser多肽接头组成。其他实施方案中，scFv接头包含二硫键。术语“糖基化”是指一个或多个碳水化合物与多肽的共价连接。典型地，糖基化是翻译后发生的事件，其发生在细胞的细胞内环境或其提取物中。术语糖基化包括，例如，N-连接糖基化(其中一个或多个糖连接到天冬酰胺残基)和/或0-连接糖基化(其中一个或多个糖连接到具有羟基(例如，丝氨酸或苏氨酸)的氨基酸残基)。在一个实施方案中，本发明的分子是糖基化的。在另一实施方案中，本发明的分子是无糖基化的。在又一实施方案中，本发明的分子与野生型Fe区相比具有还原的糖基化。本文中使用的术语“二硫键”包括在两个硫原子之间形成的共价键。氨基酸半胱氨酸包含巯基，其能够形成二硫键或与第二个巯基形成桥。在大多数天然存在的IgG分子中，CHl和CL区通过天然二硫键连接，并且两条重链通过两个天然二硫键在使用Kabat编号系统对应于239和242位(EU编号系统，则为226或229位)的位置连接。本文中使用的术语“载体”或“表达载体”是指根据本文中所使用的载体作为引入并在细胞中表达所需多核苷酸的媒介物。如本领域技术人员已知，这种载体可以容易地选自质粒、噬菌体、病毒和逆转录病毒中。一般来说，与本发明相容的载体将包含选择标记、适当的利于克隆所需基因的限制位点并进入原核或真核细胞中和/或在其中复制的能力。可以采用许多表达载体系统以生成本发明的嵌合凝血因子。例如，一类载体利用DNA元件，所述DNA元件源自动物病毒，例如牛乳头状瘤病毒、多瘤病毒、腺病毒、痘苗病毒、杆状病毒、逆转录酶病毒(RSV、MMTV或M0MLV)或SV40病毒。此外，将DNA整合到其染色体中的细胞可以通过引入一个或多个标记进行选择，所述标记允许选择转染的宿主细胞。标记可以为营养缺陷型宿主提供原养型，提供生物杀灭剂抗性(例如，抗生素)或对重金属(例如铜)的抗性。可选择的标记基因可以直接连接待表达的DNA序列或通过共转化引入到相同的细胞中。在一个实施方案中，可以采用可诱导的表达系统。需要另外的元件以优化mRNA的合成。这些元素可以包括信号序列、剪接信号以及转录启动子、增强子和终止信号。在一个实施方案中，分泌信号例如数个熟知的细菌前导肽中的任一个(例如，pelB、phoA或ompA)能够框内融合到本发明多肽的N末端以获得多肽的最佳分泌(Lei等，(1988), Nature, 331:543 ;Better 等,(1988) Science, 240:1041 ;Mullinax 等，(1990).PNAS,87:8095)。术语“宿主细胞”是指用使用重组DNA技术构建的载体转化的细胞并且编码至少一个异源基因。在从重组宿主中分离蛋白的过程的描述中，除非另有明确说明，否则使用的术语“细胞”或“细胞培养”可互换地表示蛋白质源。换句话说，蛋白质从“细胞”中的回收可以指从下旋的整个细胞中或从含培养基和悬浮细胞的细胞培养物中回收。用于蛋白质表达的宿主细胞系最优选地为哺乳动物源的；本领域技术人员具有优先确定最适于在其中表达的所需基因产物的特定宿主细胞系的能力。示例性的宿主细胞系包括，但不限于，DG44和DUXBlU中国仓鼠卵巢细胞系，DHFR-)、HELA(人宫颈癌)、CVI (猴肾细胞系)、C0S(CVI与SV40T抗原的衍生物)、R1610(中国仓鼠成纤维细胞)、BALBC/3T3(小鼠成纤维细胞)、PerC6细胞、HAK(仓鼠肾细胞系)、SP2/0(小鼠骨髓瘤)、P3x63-Ag3.653(小鼠骨髓瘤)、BFA-lclBPT (牛内皮细胞)、RAJI (人淋巴细胞)以及293 (人肾)。典型地，宿主细胞系可以从商业服务、美国组织培养物保藏中心或从公开的文献中获得。本发明的多肽可以也在非哺乳动物细胞中表达，例如细菌或酵母或植物细胞。在这方面，将会理解的是各种单细胞非哺乳动物微生物，如细菌也可以被转化；即那些可以在培养物或发酵中生长的细胞。易于转化的细菌包括肠杆菌科的成员，如大肠杆菌或沙门氏菌属的菌株；芽胞杆菌科，如枯草芽孢杆菌、肺炎球菌、链球菌和 流感嗜血杆菌。将进一步理解的是，当在细菌中表达时，多肽通常变成内含体的一部分。该多肽必须被分离、纯化然后组装成功能性分子。除了原核生物之外，也可以使用真核微生物。在所有的真核微生物中，最常使用的是酿酒酵母或普通的面包酵母，虽然一些其他的菌株也通常容易获得，包括毕赤酵母(Pichia pastoris)。为了在酵母属中表达,通常使用质粒YRp7,例如(Stinchcom等，(1979)，Nature, 282:39 ；Kingsman 等，(1979)，Gene, 7:141 ；Tschemper 等，(1980)，Gene,10:157)。该质粒已经含有TRPl基因，其为酵母的突变株提供选择标记，所述酵母的突变株不能在色氨酸中生长，例如 ATCC N0.44076 或 PEP4-1 (Jones, (1977)，Genetics, 85:12)。然后作为酵母宿主细胞基因组特性的trpl损伤的存在提供用于检测在不存在色氨酸下的生长产生的转化。本文中使用的术语“内源性的”是指分子(例如，核酸和/或蛋白质分子)不是天然存在于细胞中的。相反，术语“外源性的”或“异源的”是指这种分子在给定条件下(例如，在细胞中或在多肽中)通常不被发现。例如，外源性的或异源的分子可以被引入到细胞中，并仅在对细胞进行操作(例如通过转染或其他基因工程形式)后存在，或者异源氨基酸序列可以存在于蛋白质中，其不是天然存在于该蛋白质中。本文中使用的术语“切割位点”或“酶切位点”是指由酶识别的位点。某些酶切位点包含细胞内加工位点。在一个实施方案中，多肽具有被在凝血级联中被活化的酶切割的酶切位点，以使这种位点的切割发生在血块形成的位点。示例性的这种位点包括例如，被凝血酶、因子XIa或因子Xa识别的位点。示例性的FXIa切割位点包括，例如TQSFNDFTR和SVSQTSKLTR。示例性的凝血酶切割位点包括，例如DFLAEGGGVR、ITKIKPR、LVPRG (SEQ IDNO:35)和ALRPR。其他酶切位点在本领域已知。本文中使用的术语“加工位点”或“细胞内加工位点”是指酶切位点在多肽中的一种类型，其是在翻译多肽后起作用的酶的靶。在一个实施方案中，这种酶在从高尔基体到反式高尔基体部分的转运中起作用。细胞内加工酶在蛋白质从细胞中分泌之前切割多肽。这种加工位点的实例包括，例如，被内肽酶类家族的PACE/弗林蛋白酶(其中PACE是成对碱性氨基酸切割酶的首字母简称)靶向的位点。这些酶定位在高尔基体膜上，并且序列在基序Arg-[任何残基]-(Lys或Arg)_Arg的羧基端切割蛋白质。本文中使用的“弗林蛋白酶”酶家族包括，例如，弗林蛋白酶、PC2、PCl/Pc3、PC4、PACE4、PC5/PC6 和 LPC/PC7/PC8/SPC7。其他加工位点在本领域已知。在包括一个以上的加工或切割位点的构建体中，应该理解的是这种位点可以是相同的或者不同的。体外制备允许放大以获得大量所需的本发明的改变的多肽。在组织培养条件下用于培养哺乳动物细胞培养的技术在本领域已知，其包括均质悬浮培养，例如，在气升式反应器或在连续搅拌反应器中，或固定的或包埋的细胞培养，例如，在中空纤维、微胶囊中，在琼脂糖微珠上或在陶瓷筒内培养。如果有必要和/或如果需要，多肽溶液可以通过常规的色谱方法纯化，例如凝胶过滤、离子交换色谱。疏水相互作用色谱仪(HIC，DEAE-纤维素色谱或亲和色谱)。本文中使用的短语“将受益于多肽的施用的受试者”包括受试者，如哺乳动物受试者，将受益于本发明的多肽的施用，例如，以改善止血。本文中所使用的“嵌合蛋白”或“融合蛋白”是指任何蛋白质，其由来自第一来源的第一氨基酸序列与来 自第二来源的氨基酸序列共价或非共价结合，其中第一来源和第二来源不同。不同的第一来源和第二来源能包括两个不同的生物实体，或来自相同生物实体的两个不同的蛋白，或生物实体或非生物实体。嵌合蛋白可能包括例如，来自至少2个不同生物源的蛋白质。生物源可能包括任何非合成地制备的核酸或氨基酸序列(如本发明中所进一步说明的以上任一个的基因组或cDNA序列、质粒或病毒载体、天然病毒粒子或突变体或类似物)。合成源可能包括化学产生而不是由生物系统产生的蛋白质或核酸序列(例如，氨基酸序列的固相合成)。嵌合蛋白同样也可包括源自至少2个合成源的蛋白质或源自至少一个生物源和至少一个合成源的蛋白质。嵌合蛋白可还包含共价地或非共价地连接核酸的源自第一来源的第一氨基酸序列，所述核酸源自任何来源或小的源自任何来源的有机或无机分子。嵌合蛋白可包含接头分子，其位于第一和第二氨基酸序列之间或位于第一氨基酸序列和核酸之间，或位于第一氨基酸序列和小的有机或无机分子之间。本文中使用的术语“凝血因子”是指分子、或其类似物，天然存在或重组产生，其阻止或降低受试者体内出血事件的持续时间。换句话说，它是指具有原凝血活性即负责成纤维蛋白原转化成不溶性纤维蛋白的网，引起血液凝血或凝固的分子。本文中所使用的凝血活性指的是参与生化反应级联的能力，其导致纤维蛋白凝血的形成和/或降低严重度、流血或出血事件的持续时间或频率。本文中所使用的止血是指使出血或者流血停止或者减慢；或者使血流通过血管或身体部分停止或减慢。本文中所使用的止血障碍是指基因遗传或后天获得的疾患，其特征在于具有流血倾向，或者自发地，或作为创伤的结果，由于能力损伤或者不能够形成血蛋白纤维凝块。三种主要的形式是甲型血友病(缺乏因子VIII)、乙型血友病(缺乏因子IX或“克雷司马斯病(Christmas disease)”)以及丙型血友病(缺乏因子XI,中度出血倾向)、血管性血友病、缺乏因子Xi (缺乏PTA)、缺乏因子XI1、纤维蛋白原、凝血酶原、因子V、因子VI1、因子X或因子XIII的缺乏或结构异常、伯纳德-苏利耶综合征是GPIb缺陷或缺乏GPIb。GPIb (vWF受体)可以具有缺陷并导致缺少初级凝血形成(初级止血)和增加出血倾向,Glanzman和Naegeli的血小板机能不全(血小板无力症)。在肝功能衰竭(急性或慢性形式)中，由于肝脏凝血因子的产量不足，可能会增加出血的危险。本文中所使用的嵌合分子可以预防地使用。本文中使用的术语“预防治疗”是指分子的施用先于出血事件。在一个实施方案中，需要一般止血剂的受试者经历或将要经历手术。本发明的嵌合蛋白能够在手术之前或之后作为预防进行施用。本发明的嵌合蛋白能够在手术之前或之后施用以控制急性出血事件。手术可能包括，但不限于，肝移植、肝切除或干细胞移植。按需治疗包括出血事件、关节积血、肌肉出血、口腔出血、流血、流血到肌肉、口腔流血、创伤、头部创伤(头创伤)、消化道出血、颅内流血、腹腔内流血、胸内出流、骨折、中枢神经系统出血、咽后区出血、腹膜后隙出血或骼腰肌鞘出血的治疗。受试者可需要预防手术，围手术期的管理或手术治疗。所述手术包括，例如小手术、大手术、拔牙、扁桃体切除术、腹股沟疝切开术、滑 膜切除术、全膝关节置换术、开颅术、骨缝合术、创伤手术、颅内手术、腹腔内手术、胸内手术或关节置换手术。本文中使用的术语〃急性失血〃是指不管根本原因的出血事件。例如，受试者可具有外伤、尿毒症、遗传性出血性障碍(例如，缺乏因子VII)、血小板障碍或由于针对凝血因子的抗体形成而产生的抗性。本文中使用的治疗(treat、treatment、treating)是指,例如减少疾病或疾患的严重度；减少病程的持续时间；改善与疾病或疾患相关的一个或多个症状；向受试者提供关于疾病或疾患的有益效果，而不一定治愈疾病或疾患，预防与疾病或疾患有关的一个或多个症状。I1.凝血闵子特别地，本发明涉及因子VI1、IX和X的改进的形式。所有这些因子在结构上相关，因为轻链的每个氨基端不适于额外部分的整合。相似地，这三个凝血因子的重链的氨基端不适于额外部分的整合，除了切割部分之外，即通过切割位点或由切割位点组成的部分连接的部分。本发明的嵌合凝血因子构建体的设计基于那些共有性质，应当理解的是尽管通常示出因子VII用于说明本发明示例性的实施方案，主题构建体可以使用因子VI1、IX或X来制备。例如，本领域技术人员将会理解的是本发明构建体的FVII部分可能被FVII1、FIX或FX部分取代以制备这些凝血因子之一的增强的形式。本发明的示例性嵌合凝血因子构建体在附图中列出。尽管附图通常说明了作为单链(以其酶原形式)的凝血因子，应当理解的是这些凝血因子可同样以其活性形式存在于本发明的构建体中，例如以双链、二硫键的形式。在一个实施方案中，本发明的嵌合凝血因子被细胞以活性形式表达。在另一实施方案中，嵌合凝血因子以非活性形式表达并且随后在体外在适当的条件下被活化，以使凝血因子的活性形式存在于构建体中。在另一实施方案中，本发明的嵌合凝血因子包含非活性形式的凝血因子并且凝血因子在施用后在体内活化。在一个实施方案中，scFc支架可用于产生分子的活性形式。凝血因子通常作为酶原重组产生，因此要求在制备过程中活化。因子VI1、IX和X的活性形式由二聚体分子组成，其中重链和轻链仅通过二硫键连接。在一个实施方案中，嵌合凝血因子在向受试者施用之前被活化以改善止血。用于活化凝血因子的方法在本领域已知。例如，在一个实施方案中，本发明的嵌合凝血因子与含有浓度为约5mM的CaCl2的培养基接触。在另一实施方案中，本发明的嵌合凝血因子被细胞(在该细胞中其被表达)以活性形式分泌。在一个实施方案中，活性嵌合凝血因子通过将凝血因子的重链和轻链表达成单独的多肽制备。在另一实施方案中，凝血因子的重链的N末端被修饰，以包含细胞内加工位点，其在合成过程中延缓凝血因子的活化直到后来在分泌途径中(即，直到蛋白质与活性加工酶在反式高尔基体网络中共定位)，导致更多的产量。示例性的这种细胞内加工位点包括那些被弗林蛋白酶识别的位点。示例性的该酶家族的切割位点包括基序Arg-Xaa-Lys/Arg-Arg的氨基酸序列。在优选的实施方案中，本发明的活性构建体在Fe融合蛋白的背景下制备，例如使用scFc接头(cscFc接头)。示例性构建体 在附图中示出。在一个实施方案中，本发明涉及加工的(例如，成熟的)多肽，其中至少一个邻近scFc多肽接头的切割位点被切割，以使分子不再是单个多肽链，从而该多肽由至少两条多肽链组成(归因于在酶切位点Pl和/或P2处的切割)。在一个实施方案中，这种加工的多肽包含凝血因子或其连接到第二 Fe部分(即，在多肽接头切割之前从氨基端到羧基端计数时的第二 Fe部分)的部分，其在多肽接头切割后具有游离的氨基端。在一个实施方案中，连接到第二 Fe部分的N末端的凝血因子具有催化活性，例如具有酶活性。在另一实施方案中，连接到第二 Fe部分的N末端的凝血因子被细胞作为酶原分泌，所述酶原需要凝血因子的进一步酶加工以便被完全活化。在一个实施方案中，本发明涉及以活性或非活性形式从细胞中分泌，而不需要在加工过程中进一步活化的凝血因子。例如，因子VII通常作为酶原重组地产生，并在制备期间要求活化以产生用于施用的活性形式。在一个实施方案中，本发明的多肽由细胞分泌，在该细胞中其以活性形式表达从而提高可制备性。正如下文中所详细描述的，这种凝血因子可通过在包含cscFc接头的scFc分子的背景下分别表达凝血因子的轻链和凝血因子的重链而制备。当延迟这种构建体的活化直到在加工过程中分泌途径的后期，例如蛋白质与活性加工酶在反式高尔基体中共定位时。
在一个实施方案中，本发明的凝血因子是因子VII的成熟形式或其变体。因子VII (FVII, F7也被称为因子7、凝血因子VI1、血清因子VI1、血清凝血酶原转换加速器、SPCA、转变素原和依他凝血素a)是丝氨酸蛋白酶类，其是凝血级联的部分。FVII包括Gla结构域，两个EGF结构域(EGF-1和EGF-2)和丝氨酸蛋白酶结构域(或肽酶SI结构域)，其在丝氨酸蛋白酶的肽酶SI家族的所有成员中高度保守，例如具有糜蛋白酶。FVII以单链酶原形式、活化的酶原样双链多肽和完全活化的双链形式存在。本文中使用的“酶原样”蛋白质或多肽是指这样的蛋白质，其被蛋白分解切割活化，但是仍然显示与酶原有关的性质(例如低活性或没有活性)，或与蛋白质的酶原形式的构象类似的构象。例如，当不结合组织因子时，FVII的双链活性形式是酶原类蛋白；它保留了类似于未切割的FVII酶原的构象，并因此展示出极低的活性。一旦结合组织因子，FVII的双链活性形式经历构象改变并获得其作为稳定因子的全部活性。示例性FVII变体包括具有增加的比活的变体，例如通过增加其酶活性(Kcat或Km)而增加FVII活性的突变。这种变体在本领域已被描述，并且包括，例如Persson等，2001.PNAS98:13583 ；Petrovan 和 Ruf.2001.J.Biol.Chem.276:6616 ；Persson 等，2001J.Biol.Chem.276:29195 ；Soejima 等，2001.J.Biol.Chem.276:17229 ；Soejima 等，2002.J.Biol.Chem.247 :49027中描述的分子的突变体形式。在一个实施方案中，FVII的变体形式包括突变，示例性的突变包括V158D-E296V-M298Q。在另一实施方案中，FVII的变体形式包括用来自胰蛋白酶的170环的具有氨基酸EASYPGK取代来自FVII成熟序列的氨基酸608-619 (LQQSRKVGDSPN，对应于170-环)。FIX的高比活变体也在本领域已知。例如，Simioni 等(2009N.E.Journal of Medicine361:1671)描述了 R338L 突变。Chang 等，(1988JBC273:12089)和 Pierri 等，(2009Human Gene Therapy20:479)描述了 R338A 突变。其他的突变体在本领域已知，并且包括在例如Zogg和Brandstetter.2009Structurel7:1669 ;Sichler等2003.J.Biol.Chem.278:4121 ;和Sturzebecher等，1997.FEBS Lett412:295中描述的突变。这些参考文献的全部内容通过引用并入本文。在从酶原样形式构象改变时存在的全活化在与辅因子组织因子结合时存在。同样，可引入在不存在组织因子时引起构象改变的突变。因此，提到的FVIIa包括其双链形式，酶原样形式和全活化的双链形式。在一个实施方案中，本发明的凝血因子是因子VIII或其变体的成熟形式。FVIII在血液凝血的内源性途径中作为辅因子起作用以加速通过因子IXa对因子X的活化(存在钙离子FVIII时在带负电荷的磷脂表面上发生的一个反应)。FVIII以2351个氨基酸的单链多肽合成，所述单链多肽具有结构域结构A1-A2-B-A3-C1-C2。ffehar, G.A.等，Nature312:337-342 (1984)和 Toole, J.J.等，Nature312:342-347 (1984)。FVIII 的结构域结构与同源凝血因子(因子 V(FV))相同。Kane, ff.H.等，PNAS(USA)83:6800-6804(1986)和 Jenny，R.J.等，PNAS (USA) 84:4846-4850 (1987)。FVIII A-结构域具有 330 个氨基酸并且彼此之间和与FV的A结合域以及血浆铜结合蛋白血清铜蓝蛋白具有40%的氨基酸同一性。Takahashi, N.等，PNAS (USA) 81:390-394 (1984)。每个 C-结构域具有 150 个氨基酸，并示出了与FV的C-结构域和结合糖缀合物和带负电荷的磷脂的蛋白质具有40%的同一性。StubbsJ.D.等，PNAS (USA) 87:8417-8421 (1990)。FVIII B-结构域由单个外显子编码并显示与任何已知的蛋白质(包括FV B结构域)具有很少的同源性。Gitschier, J.等，Nature312:326-330(1984)和 Cripe, L.D.等，Biochemistry31:3777-3785 (1992)。FVIII作为重链(结构域A1-A2-B)和轻链(结构域A3_C1_C2)的异源二聚体分泌到血浆中，该重链和轻链通过位于Al-和A3-结构域之间的非共价的二价金属离子键合而缔合。在血浆中，FVIII通过与VonWillebrand因子结合而被稳定化。更具体地说，FVIII轻链通过非共价键相互作用与von Willebrand因子的氨基端的主要结合位点结合。一旦被凝血酶蛋白水解活化，FVIII被活化成2条重链片段(Al，50kDa片段和A2，43kDa片段)和I条轻链(A3-Cl-C2，73kDa链)的异源三聚体。因此，FVIII的活性形式(FVIIIa)由通过二价金属离子键合与凝血酶-切割的A3-C1-C2轻链缔合的Al亚基，和通过离子键合与Al 结构域缔合的游离 A2 亚基组成。Eaton, D.等，Biochemistry25:505 (1986) ；Lollar, P.等，J.Biol.Chem.266:12481 (1991);和 Fay, P.J.等，J.Biol.Chem.266:8957 (1991)。该FVIIIa异源三聚体是不稳定的，并且通过在生理条件下解离A2亚基而经受快速失活。在一个实施方案中，凝血因子包含因子VIII的B-结构域缺失的形式。本文中使用的因子VIII的“B-结构域”与本领域已知的B-结构域相同，其被内部氨基酸序列同一性和蛋白水解切割位点所限定，例如全长人因子VIII的残基丝氨酸Ser741-Argl648。其他的人因子VIII结构域被以下氨基酸残基所限定:A1,残基Alal-Arg372 ；A2,残基丝氨酸 373-Arg740 ；A3,残基丝氨酸 Serl690_Asn2019 ;C1，残基 Lys2020_Asn2172 ；C2,残基丝氨酸Ser2173-Tyr2332。A3-C1-C2序列包括残基Serl690_Tyr2332。剩余的序列(残基Glul649-Argl689)通常被称为a3酸性区。对于猪科动物、鼠和犬科动物因子VIII，所有结构域(包括B结构域)的边界的位置也在本领域已知。在一个实施方案中，因子VIII的B结构域是缺失的(“B-结构域缺失的因子VIII”或“BDD FVIII”)。BDD FVIII的实例是REFACTO (具有S743/Q1638融合的重组BDD FVIII)，其在本领域已知。“B-结构域缺失的因子VIII”可以具有在美国专利号6，316，226,6, 346，513、7，041，635,5, 789，203,6, 060，447,5, 595，886,6, 228，620,5, 972，885,6, 048，720、5，543，502,5, 610，278,5, 171，844,5, 112，950,4, 868，112 和 6，458，563 中公开的全部或部分缺失，其每一个通过引用 整体并入本文。在一些实施方案中，本发明的B-结构域缺失的因子VIII序列包含任何一个在美国专利号6，316，226 (也在US6，346，513)的第4栏第4行到第5栏第28行和实施例1至5中公开的缺失中的任一种。在另一实施方案中，B-结构域缺失的因子VIII是S743/Q1638B-结构域缺失的因子VIII (SQ形式因子VIII)(例如，因子VIII具有从氨基酸744到氨基酸1637的缺失，例如，因子VIII具有SEQ ID NO:6的氨基酸1-743和氨基酸的1638-2332，即SEQ ID NO:2)。在一些实施方案中，本发明的B-结构域缺失的因子VIII具有在美国专利号5，789，203(同样US6，060，447、US5, 595, 886和US6, 228，620)中的第2栏第26至51行和实施例5至8中公开的缺失。在一些实施方案中，B-结构域缺失的因子VIII具有在美国专利号5，972，885的第I栏第25行至第2栏第40行；美国专利号6，048，720的第6栏第I至22行和实施例1 ;美国专利号5，543，502的第2栏第17至46行；美国专利号5，171，844的第4栏22行至第5栏第36行；美国专利号5，112，950的第2栏第55至第68行、图2和实施例1 ;美国专利号4，868，112的第2栏第2行至第19栏第21行和表2 ;美国专利号7，041，635的第2栏第I行至第3栏第19行、第3栏第40行至第4栏第67行、第7栏43行至第8栏第26行、第11栏第5行至第13栏第39行；或者美国专利号6，458，563的第4栏第25至53行。在一些实施方案中，B-结构域缺失的因子VIII缺失大部分B结构域，但仍然含有B结构域的氨基端序列，其对于将初级翻译产物体内蛋白水解加工成两条多肽链是必不可少的蛋白水解过程，如W091/09122(其通过引用整体并入本文)所公开。在一些实施方案中，B-结构域缺失的因子VIII用氨基酸747-1638缺失构建，即实际上是B结构域的完全缺失。Hoeben R.C.等，J.Biol.Chem.265(13):7318-7323 (1990)，其通过引用整体并入本文。B-结构域缺失的因子VIII也可含有因子VIII的氨基酸771-1666或氨基酸868-1562的缺失。MeulienP.等，Protein Eng.2 (4): 301-6 (1988),其通过引用整体并入本文。另外的B结构域也是本发明的部分，其包括:氨基酸982至1562或760至1639的缺失(Toole等，Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A.(1986) 83，5939-5942))，氨基酸 797 至 1562 的缺失(Eaton 等，Biochemistry (1986) 25:8343-8347))，氨基酸 741 至 1646 的缺失(Kaufman (PCT 公布申请号W087/04187))，氨基酸 747-1560 的缺失(Sarver 等，DNA (1987) 6:553-564))，氨基酸 741 至1648的缺失(Pasek (PCT申请N0.88/00831))或氨基酸816至1598或741至1648的缺失(Lagner (Behring Inst.Mitt.(1988)No82:16-25，EP295597))，其通过引用整体并入本文。每种上述缺失可以在任何因子VIII序列中制备。在一个实施方案中，本发明涉及FVIII的靶向形式，其中靶向(i)特异性结合血小板，(ii)未在凝血因子的轻链和重链之间插入，并且其中所述嵌合凝血因子在血小板存在时展示出与缺乏至少一个靶向部分的适当的对照相比增加的凝血酶生成。在一个实施方案中，本发明的凝血因子是因子IX或其变体的成熟形式。因子IX以415个氨基酸的单链血浆酶原循环(A.Vysotchin等，J.Biol.Chem.268，8436 (1993))。FIX的酶原被FXIa活化或被组织因子/FVIIa复合物活化。精氨酸-丙氨酸145-146和精氨酸-缬氨酸180-181之间的特异性切割产生通过半胱氨酸132和半胱氨酸289连接之间的单个二硫键连接的轻链和重链(S.Bajaj等，Biochemistry22，4047 (1983))。FIX的结构组织类似于维生素K依赖型凝血蛋白FVI1、FX和蛋白C(B.Furie和B.Furie,同上)。氨基端的大约45个氨基酸包含Y-羧基谷氨酸或gla结构域。其后面是两个表皮生长因子同源结构域(EGF)，活化肽和催化“重链”，其是丝氨酸蛋白酶家族的成员(A.Vysotchin等，J.Biol.Chem.268, 8436 (1993) ；S.Spitzer 等，Biochemical Journal265, 219(1990)；H.Brandstetter 等，Proc.Natl.Acad Sc1.USA92, 9796 (1995))。

在一个实施方案中，本发明的凝血因子是因子X的成熟形式。因子X是分子量为
58.5kDa的维生素K依赖型糖蛋白，其作为酶原形式从肝细胞分泌到血浆。最初，因子X作为具有信号肽的前肽原制备，该信号肽由总计488个氨基酸组成。信号肽在输出到内质网中时被信号肽酶切割，Y羧基化在成熟的N末端链的N末端的第一 11谷氨酸残基处发生后前肽原序列被切除。进一步的加工步骤通过在Argl82和Serl83之间的切割发生。该加工步骤同样附随地导致三肽Argl80-Lysl81-Argl82的缺失。所得的分泌因子X酶原由139个氨基酸(M，16，200)的N末端轻链和306氨基酸(M，42，000)的C末端重链组成，其通过Cysl72和Cys342之间的二硫桥共价地连接。进一步的翻译后加工步骤包括Aspl03的3羟化以及N和0型糖基化。应当理解的是，除了这些凝血因子或其生物活性部分的野生型(WT)形式，本发明也可采用具有活性的前体截短形式、等位基因变体和种类变体、由剪接变体编码的变体以及其他变体，包括与凝血因子的成熟形式具有至少40%、45%、50%、55%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更多的序列同一性并保留促进血块形式的能力的多肽。例如，保留FVII的至少一种活性，例如FVII的TF结合、因子X结合、磷脂结合和/或促凝活性的修饰FVII多肽及其变体可以被采用。通过保留活性，所述活性可以改变，例如与野生型凝血因子相比降低或增加活性，只要所保留的活性水平足以生成可检测的效应。可用于本发明构建体的凝血因子的示例性序列可以在随附的序列表中找到。示例性的修饰多肽包括但不限于组织特异性同工型及其等位基因变体，通过核酸的翻译制备的合成分子，通过化学合成(如包括较短多肽通过重组方法的连接反应的合成)产生的蛋白质，从人和非人组织和细胞分离的蛋白质，嵌合多肽及其修饰形式。本发明的凝血因子可由野生型分子的片段或部分组成，所述野生(WT)型分子具有足够长度或包括合适的区域以保留全长成熟多肽的至少一种活性(如果有需要在活化时)。示例性的凝血因子变体在本领域已知。本文中使用的术语“Gla结构域”是指保守膜结合基序，其存在于维生素K依赖型蛋白，如作为凝血酶原、凝血因子VI1、IX和X，蛋白C、S和Z。这些蛋白质需要用于翻译后合成G-羧基谷氨酸(一种聚集在这些蛋白质的N末端Gla结构域的氨基酸)的维生素K。所有存在于结构域中的谷氨酸残基都是潜在的羧基化位点，因此其中许多被羧基化修饰。在存在钙离子时，Gla结构域与包括磷脂酰丝氨酸的磷脂膜相互作用。Gla结构域也在结合FVIIa辅因子、组织因子(TF)中起作用。与TF复合，FVIIa的Gla结构域负载有7个Ca2+离子，在细胞表面与磷脂相互作用的细胞膜方向上伸出三个疏水性侧链，并且与TF的C末端结构域明显接触。因子VII的Gla结构域包含罕有的氨基酸-羧基谷氨酸(Gla)，其在凝血因子与带负电的磷脂表面的结合中起作用。GLA结构域负责钙离子的高亲和力结合。它起始于蛋白质的成熟形式的N末端终点并且以保守的芳族残基结束。在结构域中部发现保守的Gla-x (3)-Gla-X-Cys基序，其似乎对于羧化酶的底物识别而言是重要的。使用停流荧光动力学测量结合表面等离子体共振分析，发现Gla结构域在事件的序列中很重要，据此，FVIIa的蛋白酶结构域启动与sTF的接触(Biochemical andBiophysical Research Communications.2005.337:1276)。另外，凝血因子的清除可通过例如在肝细胞和清除受体(例如，EPCR)上的Gla相互作用显著地介导。在一个实施方案中，对靶向的凝血因子进行修饰以缺乏Gla结构域。Gla结构域负责通过多条途径介导凝血因子的清除，如结合肝细胞，清除受体如EPCR等。因此，去除Gla结构域对凝血因子的半衰期具有有益作用。虽然Gla结构域通常也通过将凝血因子定位于凝血位点而需要活性，但是靶向结构域部分的血小板的内含物使Gla缺失的凝血因子靶向血小板。在一个实施方案中，本发明的凝血因子包含靶向部分并缺少Gla结构域。例如，在因子VII的情况下，Gla结构域存在于轻链的氨基端并由氨基酸1-35组成。示例性的凝血因子的Gla结构域在随附的序列表中示出。该结构域可能通过使用标准的分子生物学技术来去除，用靶向结构域进行替换，并且修饰的轻链结合到本发明的构建体中。在一个实施方案中，切割位点可以结合到缺少Gla结构域的构建体中以促进分子的活化。例如，在一个实施方案中，这种切割位点可以在氨基酸之间引入 ，当凝血因子被活化时该氨基酸被切割(例如，对于因子VII，在氨基酸152与153之间)。在附图中示出了示例性的缺少Gla结构域的凝血因子。在一个实施方案中，切割位点可以被引入到构建体中，所述构建体缺少Gla结构域以促进分子的活化。例如，在一个实施方案中，这种切割位点可以被引入到氨基酸之间，当凝血因子被活化时该氨基酸被切割(例如，对于因子VII，位于氨基酸152和153之间)。在附图中示出了示例性的缺少Gla结构域的凝血因子。示例性的凝血因子是哺乳动物(例如人)来源的凝血因子。示例性的凝血因子的序列在随附的序列表中示出，例如，单独或在嵌合凝血因子构建体的上下文中。II1.靶向部分在一个实施方案中，本发明的凝血因子通过使用“靶向部分”将凝血因子定位在凝血位点而被靶向到血小板中以增强其效力，所述“靶向部分”结合在血小板上表达的靶分子。优选地，靶向分子不在除血小板之外的细胞或组织上表达，即靶向部分特异性与血小板
彡口口 在一个实施方案中，在静息血小板上发现的受体/构象被靶向。这样做，凝血位点可能为增强的效力做好准备。靶向这样的分子也可延长凝血因子的半衰期和/或预防清除。这种靶标的实例包括GpIb/V/IX复合物的Gplb，GpVI和GPIIb/IIIa的非活性形式。在一个实施方案中，为了将凝血因子定位在活性凝血位点，仅在活化血小板上发现的受体/构象被靶向。这种靶标的实例包括，例如，GpIIb/IIIa以及⑶62P的活性形式。在一个实施方案中，本发明的多肽包含“靶向部分”，其具有对血小板的亲和性并结合血小板。例如，在一个实施方案中`，靶向部分结合GPIb复合物，例如GPIb-a。这种靶向部分的实例包括肽PS4、OSl和0S2，其结合活性和非活性的血小板(Benard等，2008Biochemistry47:4674);在另一实施方案中，祀向部分结合GPIIbIIIa的活性构象。这种靶向部分的实例包括SCE5和MB9可变区，其仅结合活性血小板(Schwarz等，2004FASEBJournal express articlel0.1096/fj.04-1513fje ；Schwarz 等，2006CirculationResearch.99:25-33 ;美国公开20070218067)。在另一实施方案中，靶向部分结合GPIIbIIIa的活性/非活性构象。这种祀向部分的实例是AP3抗体的可变区(Peterson等，2003.Hemostasis, Thrombosis 和 Vascular BiologylOl: 937 ;W02010115866)。其他的革巴标和靶向部分在本领域已知。具有增加的凝血活性的因子IX的另一形式(三倍突变体V86A/E277A/R338A)已由 Lin 等人 2010.Journal of Thrombosis and Haemostasis8:1773 描述。这些参考文献的内容通过该参考文献并入本文。本发明的嵌合凝血因子可能包含一个或多于一个的靶向部分。在附图中列出了示例性的构象。此外，两个或更多个靶向部分可以彼此连续地连接(例如，通过间隔基)，并且串联排列可操作地连接本发明的构建体。当两个或更多个靶向部分存在于本发明的嵌合凝血因子中时，它们可以是相同的或不同的。在一个实施方案中，靶向部分通过可切割接头融合本发明的嵌合凝血因子，所述接头可被切割以在血块位点去除靶向部分。在另一实施方案中，靶向部分不通过可切割接头连接，因此，不在血块位点被切割。在一个实施方案中，靶向部分定位在因子VIII的N末端或C末端。在另一实施方案中，靶向部分定位在FVI1、FIX、FX的C末端，或在FVIIa、FIXa中的任一链或双链、FXa的C末端。在其中采用Fe区或其部分的实施方案中，靶向部分可位于第二 Fe链的N末端或C末端，或者在Fe链的任一链或双链的C末端。在一个实施方案中，靶向部分不与构建体基因融合，而是经由间隔基或化学键与构建体连接。例如，祀向部分通过在构建体的祀向部分和Fe部分之间形成的键连接到本发明的构建体上，其中靶向部分包含第一官能团，Fe部分包含第二官能团，其中第一和第二官能团能够彼此相互反应形成化学键(参见，例如，美国专利7381408)。在一个实施方案中，本发明的多肽包含至少一个抗原结合位点(例如，抗体的抗原结合位点、抗体变体或抗体片段)、多肽、配体的受体结合部分或受体的配体结合部分，其与血小板特异性结合，例如，静息血小板或活化血小板。示例性的靶向部分包括scFv分子或结合待靶向分子的肽。在本实施例和附图中示出了靶向部分的实例。本领域技术人员通过本文的教义可以容易地选择用作靶向分子的其他分子。A.与血小板结合的抗原结合位点在某些实施方案中，本发明的多肽包含抗体的至少一个抗原结合部分(例如，结合位点)。在一个实施方案中，抗原结合部分使多肽靶向血小板。在其他实施方案中，本发明的多肽可包含抗原结合部分。术语“抗原结合部分”是指免疫球蛋白的多肽片段、抗体或抗体变体，其结合抗原或与完整抗体(即与它们所源自的完整抗体)竞争抗原结合(即特异性结合)。例如，所述抗原结合部分可源自上述抗体或抗体变体的任一种。抗原结合部分可通过本领域众所周知的重组或生物化学方法制备。示例性的抗原结合部分包括Fv、Fab、Fab’和(Fab’ )2以及scFv分子。在其他实施方案中，本发明的嵌合凝血因子可包含来自单链结合分子(例如单链可变区或scFv)的结合位点。所述用于制备单链抗体的技术(美国专利N0.4，694，778 ；Bird, Scienc e242:423-442 (1988) ；Huston 等人，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA85:5879-5883 (1988)和 Ward 等人，Nature334:544-554 (1989))可适用于制备单链结合分子。单链抗体通过经由氨基酸桥连接Fv区域的重链和轻链片段而形成，从而导致单链抗体。还可以使用在大肠杆菌中装配功能Fv片段的技术(Skerra等人，Science242:1038-1041(1988))。在某些实施方案中，本发明的多肽包含一个或多个结合位点或区，所述区包含或由单链可变区序列(scFv)组成。单链可变区序列包含具有一个或多个抗原结合位点的单肽，例如，由柔性接头连接到Vh结构域的\结构域。VL和/或VH结构域可源自上述抗体或抗体变体的任一种。ScFv分子可能以Vh-接头-Vlj方向或Vir接头-Vh方向构建。连接弥补抗原结合位点的\和Vh结构域的柔性接头优选地包含约10至50个氨基酸。在一个实施方案中，多肽接头是gly-ser多肽接头。示例性的gly/ser多肽接头具有式(Gly4Ser)n，其中n是正整数(例如，1、2、3、4、5或6)。其他的多肽在本领域已知。具有单链可变区序列(例如，单链Fv抗体)的抗体和制备所述单链抗体的方法在本领域众所周知(参见例如，Ho 等，1989.Gene77:51 ；Bird 等，1988Science242:423 ；Pantoliano 等，1991.Biochemistry30:10117 ；Milenic 等，1991.CancerResearch51:6363 ;Takkinen 等，1991.Protein Engineering4:837)。在某些实施方案中，本发明的多肽采用的scFv分子是稳定的scFv分子。在一个实施方案中，稳定的cFv分子可包含在￥11结构域和 '结构域之间插入的scFv接头，其中Vh和\结构域通过Vh结构域的氨基酸和\结构域的氨基酸之间形成的二硫键连接。在其他实施方案中，稳定的scFv分子可包含scFv接头,其具有优化的长度或组成。在又一实施方案中，稳定的scFv分子可包含Vh或'结构域，其具有至少一个稳定的氨基酸置换。在又一实施方案中，稳定的scFv分子可以具有至少两个上述列出的稳定化特征。稳定化scFv分子具有改进的蛋白质稳定性或给予可操作连接的多肽改进的蛋白质稳定性，与常规多肽相比，本发明优选的scFv接头使本发明的多肽的热稳定性提高至少约2°C或3°C。比较可能例如在本发明的scFv分子之间进行。在某些优选的实施方案中，稳定化scFv分子包含(Gly4Ser) 4scFv接头和二硫键，其连接Vh氨基酸44和\氨基酸100。可用于本发明的多肽的其他示例性的稳定化scFv分子在2006年12月8日提交的美国临时专利申请号60/873，996或2007年3月19日提交的美国专利申请号11/725，970中描述，其每一个通过引用整体并入本文。本发明的多肽可包含源自使用本领域公认的抗体的可变区或其部分(例如，VL和/或VH结构域)，例如可变结构域可源自非人哺乳动物例如小鼠、豚鼠、灵长类、兔或大鼠中通过用抗原或其片段对该哺乳动物进行免疫而制备的抗体。参见，Harlow&Lane，同上，其为了所有目的通过引用并入。免疫球蛋白可通过相关抗原(例如，纯化的肿瘤相关抗原或细胞或包含所述抗原的细胞提取 物)和佐剂的多次皮下注射或静脉注射制备。典型地，该免疫诱发免疫应答，其包括从活化的脾细胞或淋巴细胞产生抗原反应抗体。尽管可变区可源自从免疫的哺乳动物的血清收获的多克隆抗体，它通常从脾脏、淋巴结或外周血分离单独的脾淋巴细胞以提供获期望可变区所源自的单克隆抗体(MAb)的均匀制剂。典型地，使用兔和豚鼠制备多克隆抗体。典型地，使用小鼠制备单克隆抗体。针对抗原的单克隆抗体可通过将抗原片段注射到小鼠中制备，制备“杂交瘤”并且筛选杂交瘤的特异性结合抗原的抗体。在该众所周知的过程(Kohler等，(1975)，Nature, 256:495)中，来自已用抗原注射小鼠的相对短寿命或致死的淋巴细胞与永生的瘤细胞系(例如，骨髓瘤细胞系)融合，因此，制备均为永生的并且能够产生通过B细胞基因编码的抗体的杂交细胞或“杂交瘤”。通过用各个单独的包含用于单个抗体形成的特定基因的菌株选择、稀释和再生，获得的杂合物分离成单独的遗传品系。它们产生同源的针对所需抗原的抗体，并且根据它们的纯的遗传百分比，将其称为“单克隆”。接种由此制备的杂交瘤细胞并在合适的培养基中生长，所述培养基优选地含有一种或多种抑制非融合的亲本骨髓瘤细胞的生长或存活的物质。本领域技术人员将会理解，用于形成、选择和生长杂交瘤的试剂、细胞系和培养基可从许多来源商业购得，并且标准化方案是成熟的。一般来说，测定杂交瘤细胞生长的培养基的针对所需抗原的单克隆抗体的产生。优选地，通过杂交瘤细胞产生的单克隆抗体的结合特异性通过免疫沉淀法或通过体外测定来确定，如放射免疫分析(RIA)或酶联免疫吸附测定(ELISA)。鉴定制备具有所需特异性、亲和力和/或活性的抗体的杂交瘤细胞后，通过有限的稀释程序可将克隆体进行亚克隆，并通过标准方法生长(Goding, Monoclonal antibody !Principles andPractice, pp59-103 (Academic Press, 1986))。还应进一步理解，由亚克隆分泌的单克隆抗体可通过常规纯化程序从培养基、腹水或血清分离，例如，亲和色谱(例如，蛋白A、蛋白G或蛋白L亲和色谱)、羟基磷灰石色谱、凝胶电泳或透析。任选地，可筛选这样的抗体，其结合特定活化状态的血小板上或结合到抗原的特定区域或所需片段，而不结合抗原的其他非重叠片段。后者的筛选可以通过确定抗体到抗原缺失突变体的收集物的结合并确定哪个缺失突变体结合抗体而完成。例如，通过蛋白质印迹或ELISA可评估结合。示出特异性结合抗体的最小片段限定抗体的表位。可选地，表位特异性能够通过竞争测定来确定，所述竞争测定是参考抗体竞争结合抗原的试验。如果该试验和参考抗体竞争，那么它们结合相同的表位或表位充分接近，以使一个抗体的结合干扰其他抗体的结合。编码所需单克隆抗体或其结合位点的DNA可被容易地分离并使用任一种上述的用于分离恒定区结构域序列(例如，通过使用能够特异性结合编码鼠抗体的重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)的常规程序进行测序。分离的和亚克隆的杂交瘤细胞用作所述DNA的优选来源。尤其是，分离的DNA(其可以如本文所描述地合成)可以用于克隆用于结合到本发明的多肽中的所需可变区序列。在其他实施方案中，结合位点源自全人抗体。人或基本上人抗体可以在转基因动物(例如，小鼠)中产生，其不能进行内源性免疫球蛋白的制备(参见例如，美国专利号6，075，181,5, 939，598,5, 591，669和5，589，369，其每一个通过引用整体并入本文)。例如，据描述，在嵌合和种系突变型小鼠中的抗体重链联结区的纯合子缺失导致完全抑制内源性的抗体产生。人免疫球蛋白基因阵列向这种种系突变型小鼠的转移将在抗原攻击时导致产生人抗体。另外优选的使用SCID小鼠产生人抗体的方法在美国专利号5，811，524中公开，其通过引用并入本文。应当理解的是，与这些人抗体相关的遗传物质也可如本发明所述地被分离或操作。在其他方面，本发明的多肽可包含抗原结合位点或其部分，其源自抗体的修饰形式。示例性的这种形式包括，例如，微型抗体、双抗、三抗体、纳米抗体、camelids、Dabs、四价抗体、内双抗(例如，Jendreyko等,2003.J.Biol.Chem.278:47813)、融合蛋白(例如，抗体细胞因子融合蛋白、融合Fe受体至少一部分的蛋白)以及双特异性抗体。其他修饰的抗体在例如，美国专利号 4，745，055 ；EP256, 654 ；FauIkner 等，Nature298:286 (1982)；EP120, 694 ；EP125, 023 ；Morrison, J.Tmmun.123:793 (1979) ；Kohler 等，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA77: 2197 (1980) ；Raso 等，Cancer Res.41:2073(1981) ；Morrison 等，Ann.Rev.1mmunol.2:239(1984) ；Morrison, Science229:1202 (1985) ；Morrison 等，Proc.Natl.Acad.Sc1 .USA81:6851 (1984) ;EP255, 694 ;EP266, 663 和 W088/03559 中描述。重新组合的免疫球蛋白链也是已知的。参见，例如，美国专利号4，444，878、W088/03565和EP68，763以及在其中所述的参考文献。在另一实施方案中，本发明的嵌合凝血因子包含抗原结合位点或区，其是双抗体或由此衍生的抗原结合位点。双抗体是二聚四价分子，每个分子具有类似于scFv分子的多肽，但通常具有短的(例如，少于10，优选I至5)个氨基酸残基接头，该接头连接两个可变结构域，以使在同一多肽上的\和Vh结构域不能相互作用。可替代地，一个多肽链的\和Vh结构域与第二多肽链上的Vl和Vh结构域(分别地)相互作用(参见，例如W002/02781)。在一个实施方案中，本发明的多肽包含双抗体，其可操作地连接至少一个基因融合的Fe区(即scFc区)的N末端和/或C末端。在某些实施方案中，本发明的多肽包含单结构域结合分子(例如，单结构域抗体)作为靶向部分。示例性的单结构域分子包括抗体的分离的重链可变结构域(Vh)，即重链可变结构域，而没有轻链可变结构域，和抗体的分离的轻链可变结构域(')，即轻链可变结构域，而没有重链可变结构域。用于本发明的结合分子的示例性的单结构域抗体包括，例如，Camelid重链可变结构域(约118至136个氨基酸残基)，如在Hamers-Casterman，等，Nature363:446-448 (1993)和 Dumoulin，等，Protein Sciencell: 500-515 (2002)中所描述。其他示例性的单结构域抗体包括单VH或VL结构域，也被称为Date8 (DomantisLtd.，Cambridge, UK)。其他单结构域抗体包括鲨鱼抗体(例如，鲨鱼Ig-NAR)。鲨鱼Ig-NAR包含一个可变结构域(V-NAR)的同源二聚体和5个C样恒定结构域(C-NAR)，其中多样性集中在延长的CDR3地区中，所述区长度从5至23个残基变化。在骆驼科动物物种(例如，羊驼类)中，称为VHH的重链可变区形成整个抗原结合结构域。骆驼科动物VHH可变区和源自常规抗体(VH)的VHH区之间的主要差异包括(a)与相应的VHH区相比，在VH的轻链接触表面有更多的疏水性氨基酸，(b)VHH中更长的CDR3，以及(c) VHH中的CDRl和CDR3之间频繁出现二硫键。用于制备单结构域结合分子的方法在美国专利号6.005, 079和6，765，087中描述，其两者通过引用并入本文。示例性的包含VHH结构域的单结构域抗体包 NanobodiesK' (Ablynx NV, Ghent, Belgium)。用于本发明的结合分子的示例性的抗体(结合位点可源自该抗体)在本领域已知。此类靶向部分的实例包括SCE5和MB9可变区，其仅结合活性血小板(Schwarz等人 2004FASEB Journal express articlel0.1096/fj.04-1513fje ；Schwarz 等人2006Circulation Research.99:25-33 ;美国专利公布 20070218067)。在另一实施方案中，靶向部分结合GPIIbIIIa的活性/非活性构象两者。此类靶向部分的实例是AP3抗体的可变区(Peterson 等人 2003.Hemostasis, Thrombosis 和 Vascular BiologylOl:937 ；W02010115866)。B.非免疫球蛋白血小板结合分子 在某些其它实施方案中，本发明的多肽包含一个或多个源自非免疫球蛋白结合分子的血小板结合位点。本文中使用的术语“非免疫球蛋白结合分子”是结合位点包含来自多肽而不是免疫球蛋白的部 分(例如，支架或框架)，但是可被工程化(例如，诱变)以赋予所需的对于血小板靶标的结合特异性的结合分子。包含不源自抗体分子的结合位点的结合分子的其他实例包括受体结合位点和结合血小板的配体结合位点。可通过从来自结合分子文库中选择或分离靶标结合变体来鉴定非免疫球蛋白结合分子，所述结合分子具有人工的多样化结合位点。使用完全随机的方法(例如，错配PCR、外显子改组、或定向进化)或借助于本领域公认的设计策略能够产生多样化文库。例如，能够通过在编码结合位点的核苷酸内相应的位置中插入简并密码子、三核苷酸、随机肽或整个环来随机化当结合位点与其同源靶标分子相互作用时通常涉及的氨基酸位置(参见例如，美国公开号20040132028)。氨基酸位置的定位能够通过具有靶向分子的复合物的结合位点的晶体结构的研究而鉴定。随机化的候选位置包括环、平面、螺旋和结合位点的结合腔。在某些实施方案中，可使用本领域已知的技术鉴定结合位点内的氨基酸，其可能是多样化的候选。在随机化之后，多样化库可能经过选择或筛选程序以获得具有所需结合特性的结合分子，例如，使用本领域已知方法的特异性结合血小板。可通过本领域公认的方法如噬菌体展示、酵母展示或核糖体展示完成选择。在一个实施方案中，本发明的构建体可以采用本领域已知结合血小板的分子。例如,如本领域所描述的结合GPIba的肽(例如，PS4、0S1或 0S2)可以被使用(Benard 等，2008.Biochemistry47:4674-4682)。
IV.可活化的凝血因子当以活性形式给予时，用于旁路治疗所给予的凝血因子是有效的，因为外源性的凝血因子通常不能被有效的充足动力学所活化。然而，它们通过内源性途径快速失活(例如，通过抗凝血酶III或TFPI)，导致活性形式的清除并缩短有效半衰期。在一个实施方案中，本发明的嵌合凝血因子是“可活化的”。这种可活化的构建体作为具有更长的半衰期的增强的酶原循环，但是当需要时能够容易地在凝血部位被切割。在一个实施方案中，本发明可活化的构建体包含可切割的接头，其包含例如，因子XIa、Xa或凝血酶切割位点(其被分别由因子XIa、Xa或凝血酶切割)，导致在血块位点形成凝血因子的活性形式。示例性的因子FXIa切割位点包括，例如，TQSFNDFTR和SVSQTSKLTR。示例性的凝血酶切割位点包括，例如，DFLAEGGGVR、TTKIKPR和包含ALRPR或由ALRPR组成的序列(例如，ALRPRVVGGA)。在一个实施方案中，可切割的接头的两侧可以有被间隔基部分隔开的一个或多个侧(上游、下游或两侧)。在一个实施方案中，可切割的接头在凝血因子的轻链和重链之间插入。在另一实施方案中，可切割的接头不在凝血因子的轻链和重链之间插入。在一个实施方案中，可切割的接头位于重链的氨基端。示例性的可活化的构建体在附图和以下实施例中示出。V.支架部分本发明的 一些实施方案包含支架部分，其可选自例如蛋白质部分、ScFc区、Fe部分、白蛋白、XTEN等。A.蛋白质部分在一个实施方案中，支架是蛋白质部分。这种部分可包含完整蛋白质或其部分或合成分子。优选的蛋白质部分具有足够的分子尺寸，当结合到构建体中时，其改进本发明的嵌合凝血因子的半衰期。例如，在一个实施方案中，人工蛋白(XTEN)可包括在构建体中作为支架(Schellenberger等，2009.27:1186)。在另一实施方案中，白蛋白(例如，人血清白蛋白)可包括在本发明的构建体中。例如，如在本领域已知，血清白蛋白(例如，HSA)能用作蛋白支架。在HSA的特定各种结构域和亚结构域中，具有相当经得起用于产生血清白蛋白支架基蛋白文库的突变和随机化的结构。可用于本发明的白蛋白的实例，例如其片段，是已知的。例如，美国专利号7, 592，010、美国专利号6，686，179和Schulte, ThrombosisRes.124增刊2:S6-S8 (2009)，其每一个通过引用整体并入本文。BscFc 区在一个实施方案中，本发明提供编码多肽的核酸分子，所述多肽包含位于单个多肽链(即包含单链Fc(ScFc)区的多肽)内的至少一个基因融合的Fe区或其部分，所述单个多肽链包含scFc区。在一个实施方案中，本发明的核酸分子编码嵌合凝血因子，其包含选自FVI1、FIX和FX的凝血因子以及结合血小板的靶向部分以及任选地位于凝血因子和靶向部分之间的间隔基部分。多肽包含FVII，该FVII包含可被凝血级联的组分活化的异源性酶切位点。在一个实施方案中，本发明提供未加工的多肽，其中位于相同线性多肽链内的至少两个Fe部分或结构域(例如，2、3、4、5、6或更多个Fe部分或结构域)能够折叠(例如，分子内或分子间折叠)以形成一个由Fe多肽接头连接的功能scFc区。例如，在一个优选的实施方案中，为了改进半衰期或触发免疫效应功能(例如，抗体依赖性细胞毒作用(ADCC)、吞噬作用或补体依赖性细胞毒作用(CDCC)和/或为了提高可制备性)，本发明的多肽能够通过其scFc区结合至少一个Fe受体(例如，FcRn> Fe y R受体(例如，Fe Y RIII)或补体蛋白(例如，Clq))。可替代设计的多种多肽在本发明的范围内。例如，在一个实施方案中，多肽包含呈从氨基端到羧基端的线性序列的部分:A-Fl-P1-L-P2-B-F2 (I)其中，A(如果存在)是凝血因子或其部分，Fl是第一 Fe部分或结构域，Pl是酶切位点，L是ScFc接头，P2是酶切位点，B (如果存在)是凝血因子或其部分，F2是第二 Fe部分或结构域，并且代表 肽键。式(I)至少包含A或B以及任选地包含两者。A和B (如果都存在)可能是凝血因子的相应的重链和轻链。式(I)至少包含Pl或P2以及任选地包含两者。Pl和P2(如果都存在)可能相同或不同。式⑴至少包含Fl和F2。Fl和F2(如果都存在)可能相同或不同。根据式I 的示例性的多肽包括:A-F1-P1-L-P2-F2、F1-P1-L-P2-B-F2、A-Fl-P 1-L-F2、Fl-P 1-L-B-F2、A-F1-L-P2-F2 和 F1-L-P2-B-F2。在一个实施方案中，每个Fl和F2包含CH2和CH3部分。在一个实施方案中，在切割和基本上切除cscFc接头(L)后，本发明的多肽包含两条多肽链，其中第一多肽链包含连接第一 Fe部分的A，以及其中第二多肽链包含连接第二Fe部分的B，其中Fl和F2 二聚化以形成Fe区。在一个实施方案中，A和B任选地存在，并且它们是凝血因子或其部分。在一个实施方案中，A是凝血因子的轻链，并且B是凝血因子的重链。在一个实施方案中，B是凝血因子的轻链，并且A是凝血因子的重链。在一个实施方案中，当A和B在多肽中缔合时，则多肽形成功能凝血因子，例如，FVI1、FIX或FX。在一个实施方案中，此类多肽在从细胞分泌时就具有酶活性。i) Fe部分或结构域用于产生本发明的多肽的可用作Fl和F2的Fe部分可通过多种不同的来源获得。在优选的实施方案中，多肽的Fe部分源自人免疫球蛋白。然而，应当理解的是Fe部分可源自其他哺乳动物类的免疫球蛋白，包括例如，啮齿类动物(例如，小鼠、大鼠、兔、豚鼠)或非人灵长类动物(例如，黑猩猩、猕猴)物种。而且，多肽Fe结构域或其部分可源自任何免疫球蛋白类，其包括IgM、IgG、IgD、IgA和IgE，以及任何免疫球蛋白同型，其包括IgGl、IgG2、IgG3和IgG4。在优选实施方案中，使用人同型IgGl。多种Fe部分基因序列(例如，人恒定区基因序列)以公开可得的保藏物形式获得。能够选择具有特定效应子功能(或缺少特定的效应子功能)或具有特定修饰的包含Fe部分序列的恒定区结构域以降低免疫原性。许多抗体和抗体编码基因的序列已经被公开，并且合适的Fe部分序列(例如，铰链、CH2和/或CH3序列或其部分)可源自使用本领域公认的技术的这些序列。使用任何前述的方法获得的遗传物质可然后被改变或合成以获得本发明的多肽。应当进一步理解的是本发明的范围涵盖恒定区DNA序列的等位基因、变体和突变体。
例如，可以使用聚合酶链反应以及被选择来扩增目标结构域的引物克隆Fe部分序列。为了从抗体中克隆Fe部分序列，从杂交瘤细胞、脾或淋巴结细胞中分离mRNA，反转录成DNA，并且用PCR扩增抗体基因。详细的PCR扩增方法在美国专利号4，683，195 ；4，683，202 ;4，800，159 ;4，965，188 中描述，以及在例如“PCR Protocols: A Guide toMethods and Applications” Innis 等节基，Academic Press, San Diego, CA(1990) ；Ho等，1989.Gene77:51 ;Horton 等，1993.Methods Enzymol.217:270)中描述。PCR 可以由共有序列恒定区引物或由基于公开的重链和轻链DNA和氨基酸序列的更多种特异性引物开始。如上所讨论的，PCR还可用于分离编码抗体轻链和重链的DNA克隆。在这种情况下，可以通过共有序列引物或更大的同源探针如鼠恒定区探针筛选文库。适用于抗体基因扩增的多数引物组在本领域已知(例如，基于纯化抗体的N末端序列的5’引物)(Benhar和Pastan.1994.Protein Engineering : 1509) ;cDNA 端的快速扩增(Ruberti, F.等，1994.J.1mmunol.Methods 173:33);抗体前导序列(Larrick 等，1989Biochem.Biophys.Res.Commun.160:1250)。抗体序列的克隆进一步在1995年I月25日提交的Newman等,美国专利号5，658，570中描述，其通过引用并入本文。本发明的多肽可包含两个或更多个Fe部分(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个Fe部分)。这些两个或更多个Fe部分能够形成Fe区。在一个实施方案中，Fe部分可以是不同的类型。在一个实施方案中，存在于多肽中的至少一个Fe部分包含铰链结构域或其部分多肽中。在另一实施方案中，本发明的多肽包含至少一个Fe部分，该Fe部分包括至少一个CH2结构域或其部分。在另一实施方案中，本发明的多肽包含至少一个Fe部分，该Fe部分包括至少一个CH3结构域或其部分。在另一实施方案中，本发明的多肽包含至少一个Fe部分，该Fe部分包括至少一个CH4结构域或其部分。在另一实施方案中，本发明的多肽包含至少一个Fe部分,该Fe部分包括至少一个铰链结构域或其部分以及至少一个CH2结构域或其部分(例如，以铰链-CH2方向)。在另一实施方案中，本发明的多肽包含至少一个Fe部分，该Fe部分包括至少一个CH2结构域或其部分以及至少一个CH3结构域或其部分(例如，以CH2-CH3方向)。在另一实施方案中，本发明的多肽包含至少一个Fe部分，该Fe部分包含至少一个铰链结构域或其部分，至少一个CH2结构域或其部分以及至少一个CH3结构域或其部分，例如，以铰链-CH2-CH3、铰链-CH3-CH2或CH2-CH3-铰链方向。在某些实施方案中，多 肽包含至少一个完整Fe区，其源自一个或多个免疫球蛋白重链(例如，包括铰链、CH2和CH3结构域的Fe结构域，虽然它们不需要来自相同的抗体)。在其他实施方案中，多肽包含至少两条完整的Fe区，其源自一个或多个免疫球蛋白重链。在优选的实施方案中，完整Fe部分源自人IgG免疫球蛋白重链(例如，人IgGl)。在另一实施方案中，本发明的多肽包含至少一个Fe部分，该Fe部分包含完整CH3结构域(根据EU编号的抗体Fe区的约341-438的氨基酸)。在另一实施方案中，本发明的多肽包含至少一个Fe部分，该Fe部分包含完整CH2结构域(根据EU编号的抗体Fe区的约231-340的氨基酸)。在另一实施方案中，本发明的多肽包含至少一个Fe部分，该Fe部分包含至少一个CH3结构域和至少一个铰链区(根据EU编号的抗体Fe区的约216-230氨基酸)和CH2结构域。在一个实施方案中，本发明的多肽包含至少一个Fe部分，该Fe部分包含铰链和CH3结构域。在另一实施方案中，本发明的多肽包含至少一个Fe部分，其包含铰链、CH2和CH3结构域。在优选的实施方案中，Fe部分源自人IgG免疫球蛋白重链(例如，人IgGl)。在一个实施方案中，Fe部分包含或由根据EU编号221至447的氨基酸组成。在另一实施方案中，本发明的多肽包含至少一个Fe部分，该Fe部分包含FcRn结合伴侣。FcRn结合伴侣是分子或其部分，其能够被FcRn受体特异性结合，随后被FcRn结合伴侣的FcRn受体活性转运。特异性结合是指形成在生理条件下相对稳定的复合物的两个分子。特异性结合的特征在于高亲和力和低至中等的稳定，如与通常具有低亲和力以及中至高度的能力的非特异性结合相区分。典型地，当亲和常数KA高于IO6M'更优选高于IO8M-1时，则认为结合是特异性的。如果有必要，通过改变结合条件能够降低非特异性结合而基本上不影响特异性结合。适当的结合条件如分子浓度、溶液的离子强度、温度、允许结合的时间、阻断剂(例如血清白蛋白、牛奶酪蛋白)的浓度等，其可以被本领域技术人员使用常规技术来优化。FcRn受体已经从几种哺乳动物物种(包括人)中分离。人FcRn、猴FcRn、大鼠FcRn 和小鼠 FcRn 的序列是已知的(Story 等，1994, J.Exp.Med.180:2377)。FcRn 受体在相对较低的PH下结合IgG(而不是其他免疫球蛋白类，如IgA、IgM、IgD和IgE)，从腔至浆膜方向积极转运IgG抗体跨细胞，然后释放在在间质流体中发现的相对较高的pH下释放IgG0它在包括肺和肠上皮(Israel等，1997，Immunology92:69)、肾小管上皮(Kobayashi等，2002，Am.J.Physiol.Renal Physiol.282:F358)以及鼻上皮、阴道表面和胆管树表面的成人表皮组织中表达(美国专利号6，485，726,6, 030，613,6, 086，875 ；W003/077834 ；US2003-0235536A1)。本发明的FcRn结合伴侣涵盖能被FcRn受体特异性结合的分子，所述受体包括整个IgG、IgG的Fe片段和其他包括FcRn受体的完整结合区的片段。基于X射线结晶学已经描述了结合FcRn受体的IgG的Fe部分的区域(Burmeister等，1994，Nature372:379)。具有FcRn的Fe的主要接触面接近CH2和CH3结构域的连接。Fc-FcRn接触都在单个Ig重链内。FcRn结合伴侣包括整个IgG、IgG的Fe片段和其他包括FcRn受体完整结合区的IgG片段。主要的接触位点包括CH2结构域的氨基酸残基248、250-257、272、285、288、290-291、308-311和314以及CH3结构域的385_387、428和433-436。提及的免疫球蛋白或免疫球蛋白片段或区的氨基酸编号都基于Kabat等，Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest, U.S.Department of Public Health, Bethesda, Md。根据公认的程序(如位点定向诱变及其类似程序)，IgG的Fe区能够被修饰以生成修饰的IgG或Fe片段及其部分(其将被FcRn结合)。这种修饰包括在远离FcRn接触位点的修饰以及在接触位点内的修饰，这些修饰保护或甚至增强与FcRn的结合。例如，人IgGl Fe (Fe Y I)中的以下单个氨基酸残基能够被置换而不明显损失Fe对于FcRnA的结合亲和力:P238A、S239A、K246A、K248A、D249A、M252A、T256A、E258A、T260A、D265A、S267A、H268A、E269A、D270A、E272A、L274A、N276A、Y278A、D280A、V282A、E283A、H285A、N286A、T289A、K290A、R292A、E293A、E294A、Q295A、Y296F、N297A、S298A、Y300F、R301A、V303A、V305A、T307A、L309A、Q311A、D312A、N315A、K317A、E318A、K320A、K322A、S324A、K326A、A327Q、P329A、A330Q、P331A、E333A、K334A、T335A、S337A、K338A、K340A、Q342A、R344A、E345A、Q347A、R355A、E356A、M358A、T359A、K360A、N361A、Q362A、Y373A、S375A、D376A、A378Q、E380A、E382A、S383A、N384A、Q386A、E388A、N389A、N390A、Y391F、K392A、L398A、S400A、D401A、D413A、K414A、R41 6A、Q418A、Q419A、N421A、V422A、S424A、E430A、N434A、T437A、Q438A、K439A、S440A、S444A和K447A，其中例如P238A表示野生型脯氨酸在第238位被丙氨酸置换。作为一个实例，在一个具体的实施方案，结合N297A突变，除去高度保守的N-糖基化位点。除了丙氨酸之外，其他氨基酸可以在以上指定的位点被野生型氨基酸置换。突变可单独地引入到Fe,引起超过一百个的FcRn结合伴侣与天然Fe不同。此外,这些单独突变的两个、三个或更多个组合可以一起引入，引起数百个FcRn结合伴侣。此外，本发明构建体中的一个FcRn结合伴侣可以发生突变而另一个FcRn结合伴侣根本不发生突变，或两个都可以发生突变而具有不同的突变。本发明描述的任何一种突变(包括N297A)可用于修饰Fe，而不考虑生物活性分子(例如，EPO、IFN、因子VI1、因子IX、T20)。上述某些突变可能赋予FcRn结合配体新的功能性。例如，一个实施方案中包含去除高度保守的N-糖基化位点的N297A。这种突变体的结果是降低免疫原性，因此提高FcRn结合配体的循环半衰期，并使FcRn结合配体不能与Fe Y R1、Fe Y RIIA, Fe y RIIB和Fe Y RIIIA 结合，其不损害 FcRn 的亲和力(Routledge 等，1995, Transplantation60:847 ；Friend 等,1999, Transplantation68:1632 ；Shields 等，1995, J.Biol.Chem.276:6591)。作为由上述突变产生的新功能性的另一个实例，FcRn的亲和力可能增加高于在一些例子中野生型的亲和力。这种增加的亲和力可反映增加的“结合”速率、降低的“脱离”速率或同时的增加的“结合”速率和降低的“脱离”速率。认为赋予增加的FcRn亲和力的突变包含T256A、T307A、E380A 和 N434A(Shields 等，2001，J.Biol.Chem.276:6591)。此外，至少3个人Fe Y受体看起来识别低铰链区内(一般为氨基酸234至237)的IgG上的结合位点。因此，新功能性和潜在降低的免疫原性的另一个实例可源于该区域的突变，例如将人IgGl〃ELLG〃的氨基酸233至236取代为IgG2〃PVA〃的相应序列(缺失一个氨基酸)。已示出当引入这种突变体后，介导各种效应子功能的Fe Y R1、FcyRII和Fe Y RIII 不与 IgGl 结合(Ward 和 Ghetiel995, Therapeutic Immunology2:77 和 Armour等，1999, Eur.J.Tmmunol.29:2613)。在一个实施方案中，FcRn结合配体是多肽，其包含序列PKNSSMISNTP(SEQ IDNO: 12)，并任选地还包含选 自 HQSLGTQ (SEQ ID NO: 13)、HQNLSDGK (SEQ ID NO: 14)、HQNISDGK(SEQ ID NO:24)或 VIS SHLGQ(SEQ ID NO:25)(美国专利号 5，739，277)的序列。两个FcRn受体可结合单个Fe分子。结晶学数据表明每个FcRn分子结合Fe 二聚体的单一多肽。在一个实施方案中，FcRn结合伴侣(如IgG的Fe片段)与生物活性分子的连接提供口服、经颊、舌下、直肠、阴道递送生物活性分子的方法，作为经鼻施用的气溶胶或通过肺途径或通过眼途径。在另一实施方案中，可侵入性施用嵌合蛋白，例如皮下施用或静脉内施用。组成本发明的多肽的Fe部分的恒定区结构域或其部分可源自不同的免疫球蛋白分子。例如。本发明的多肽可包含源自IgGl分子的CH2结构域或其部分及源自IgG3分子的CH3区或其部分。在另一个实例中，多肽可包含Fe部分，其包含部分源自IgGl分子且部分源自IgG3分子的铰链结构域。如本文所陈述的，本领域的普通技术人员应理解的是，Fe部分可以被改变以使其氨基酸序列不同于天然存在的抗体分子。在另一实施方案中，本发明的多肽包含含有一个或多个截短的Fe部分的scFc区，尽管如此所述截短的Fe部分足以向Fe区赋予Fe受体(FcR)结合性能。例如，与FcRn (即FcRn结合部分)结合的Fe结构域的部分包含约IgGl的氨基酸282至438，具有初始接触位点的EU编号，CH2结构域的氨基酸248,250至257、272、285、288、290至291,308至311和314及CH3结构域的氨基酸残基385至387、428和433至436。因此，本发明的多肽的Fe部分可包含FcRn结合部分或由FcRn结合部分组成。FcRn结合部分可源自任何同工型的重链，包含IgGl、IgG2、IgG3和IgG4。在一个实施方案中，使用来自人同工型IgGl的抗体的FcRn结合部分。在另一实施方案中，使用来自人同工型IgG4的抗体的FcRn结合部分。在一个实施方案中，本发明的多肽缺少完整Fe区的一个或多个恒定区结构域，例如，其部分或全部缺失。在某个实施方案中，本发明多肽将缺失全部的CH2结构域(ACH2构建体)。本领域的技术人员将意识到这种构建体是优选的，由于其CH2结构域对抗体代谢速率的调节属性。在某些实施方案中，本发明的多肽包含CH2结构域缺失的Fe区，该Fe区源自编码IgG1人恒定区结构域的载体(例如,来自IDEC Pharmaceuticals, San Diego)(参见，例如，W002/060955A2和W002/096948A2)。这种示例性载体设计为缺失CH2结构域并提供为表达结构域缺失的IgG^g定区的合成载体。人们将注意到这些示例性构建体优选地设计为将结合CH3结构域与各自的Fe结构域的铰链区直接融合。在其他构建体中，在一个或多个组成Fe部分之间提供间隔基部分可能是令人期望的。例如，间隔基部分可位于铰链区和CH2结构域之间和/或CH2与CH3结构域之间。例如，相容的构建体可被表达，其中CH2结构域缺失且其余CH3结构域(合成的或非合成的)通过5至20个氨基酸间隔基部分与铰链区连接。可添加这种间隔基部分，例如，以确保恒定区结构域的调节元件保持游离且可及的或铰链区保持可弯曲性。优选地，任何与本发明相容的连接肽将为相对地无免疫原性并不阻止scFc区的适当折叠。在某些实施方案中，本发明的多肽可包含二聚体Fe区，其包含相同的或大体上相同的序列组成的Fe部分(此处被称为“同型二聚体Fe区”)。在其他实施方案中，本发明的多肽可包含二聚体Fe区，其包含至少两个具有不同序列组成(例如，此处被称为“异型二聚体Fe区”)的Fe部分。在一个示例性实施方案中，异型二聚体Fe区包含第一 Fe部分的氨基酸置换(例如，天冬酰胺在EU位置297的氨基酸置换)，但不在第二 Fe部分。在某些实施方案中，Fe区是半糖基化的。例如，异聚体scFc区可包含第一糖基化的Fe部分(例如，糖基化的CH2区`)和第二无糖基化的Fe部分(例如，无糖基化的CH2区)，其中接头在糖基化和无糖基化的Fe部分之间插入。在其他实施方案中，Fe区完全糖基化，即所有的Fe部分都被糖基化。在又一实施方案中，Fe区可以是无糖基化的，例如，没有一个Fe部分被糖基化。在某些实施方案中，用于本发明的多肽的Fe部分被改变，例如，通过氨基酸突变(例如，添加、缺失或置换)。例如，在一个实施方案中，Fe部分相比于Fe部分所源自的野生型Fe具有至少一个氨基酸置换。例如，其中Fe部分源自人IgGl抗体，变体相比于野生型氨基酸在人IgGlFc区的相应位置包含至少一个氨基酸突变(例如，置换)。Fe变体的氨基酸置换可位于Fe部分内的位置，其是指对应于抗体的Fe区中给定的残基的位置序号(如使用EU编号惯例所列出的)。本领域的技术人员可容易地产生比对以确定对应于Fe部分中的位置的EU编号。在一个实施方案中，Fe变体包含位于铰链结构域或其部分内的氨基酸位置的置换。在另一实施方案中，Fe变体包含位于CH2结构域或其部分内的氨基酸位置的置换。在另一实施方案中，Fe变体包含位于CH3结构域或其部分内的氨基酸位置的置换。在另一实施方案中，Fe变体包含位于CH4结构域或其部分内的氨基酸位置的置换。在某些实施方案中，本发明的多肽包含Fe变体，其包含多于一个的氨基酸置换。本发明的多肽可包含，例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个氨基酸置换。优选地，氨基酸置换的彼此空间定位的相互间隔为至少一个氨基酸位置或更多，例如，至少2、3、4、5、6、7、8、9、10个氨基酸位置或更多。更优选地，工程化的氨基酸的空间定位的相互间隔为至少5、10,15,20或25个氨基酸位置或更多。在某些实施方案中，Fe变体使由至少一个包含所述野生型Fe结构域的Fe区赋予的效应子功能发生变化(例如，Fe区结合Fe受体(例如，Fe YR1、Fc YRII或Fe Y RIII)或补体蛋白(例如，Clq)的能力的增强或减弱，或引发抗体依赖型细胞毒性(ADCC)、吞噬作用或补体依赖型细胞毒性(CDCC))。在其他实施方案中，Fe变体提供工程化半胱氨酸残基。本发明的多肽可使用公认的Fe变体，已知其能使效应子功能和/或FcR或FcRn结合发生变化(例如，增强或减弱)。具体地来说，本发明的结合分子可包括，例如一个或多个氨基酸位置的变化(例如，置换)，如公开于国际PCT公布W088/07089A1、W096/14339A1、W098/05787AU W098/23289A1、 W099/51642A1、 W099/58572A1、 W000/09560A2、W000/32767A1、W000/42072A2、W002/44215A2、W002/060919A2, W003/074569A2、W004/016750A2, W004/029207A2, W004/035752A2, W004/063351A2, W004/074455A2,W004/099249A2, W005/040217A2, W004/044859, W005/070963A1, W005/077981A2,W005/092925A2、W005/123780A2, W006/019447AU W006/047350A2 和 W006/085967A2 ；US 专利公布 N0.US2007/0231329、US2007/0231329、US2007/0237765、US2007/0237766、US2007/0237767、US2007/0243188、US20070248603, US20070286859、US20080057056 ;或美国专利 5，648，260,5, 739，277,5, 834，250,5, 869，046,6, 096，871,6, 121，022,6, 194，551、6，242，195,6, 277，375,6, 528，624,6, 538，124,6, 737，056,6, 821，505,6, 998，253、7，083，784和7，317，091，其每一个通过弓I用并入本文。在一个实施方案中，特异性变化(例如，本领域公开的一个或多个氨基酸的特异性置换)可产生于一个或多个所公开的氨基酸位置。在另一实施方案中，可产生在一个或多个公开的氨基酸位置的不同变化(例如，本领域公开的一个或多个氨基 酸位置的不同置换)。在某些实施方案中，本发明的多肽包含Fe部分的氨基酸置换，其改变抗体的抗原非依赖型效应子功能，尤其是抗体的循环半衰期。与缺失这些置换的多肽相比，这种多肽显示出增加的或减少的与FcRn的结合，因此，其各自具有增加的或减少的在血清中的半衰期。预期具有增强的FcRn亲和力的Fe变体具有较长的血清半衰期，且这种分子在治疗哺乳动物的方法中具有有用的应用，其中需要所施用的多肽的长半衰期，例如以治疗慢性疾病或病症(参见，例如美国专利7，348，004、7，404，956和7，862，820)。相反地，预期具有减弱的FcRn亲和力的Fe变体具有较短的血清半衰期，且这种分子也是有用的(例如对于施用于哺乳动物)，其中缩短的循环时间可以是有利的，例如，用于体内诊断性成像或在起始多肽在循环中存在长时间时具有毒性副作用的情况。具有减弱的FcRn结合亲和力的Fe变体也不太可能穿过胎盘，且因此，其还用于孕妇的疾病或病症治疗。此外，需要降低的FcRn结合亲和力的其他应用包括需要定位脑、肾和/或肝的那些应用。在一个示例性实施方案中，本发明的多肽显示出从脉管系统穿过肾脏肾小球上皮细胞的输送的减少。在另一实施方案中，本发明的多肽显示出从脑穿过血脑屏障(BBB)进入血管容积的输送的减少。在一个实施方案中，具有改变的FcRn结合的多肽包含至少一个Fe部分(例如，一个或两个Fe部分)，其具有Fe部分的“FcRn结合环”内的一个或多个氨基酸置换。FcRn结合环由野生型全长Fe部分的氨基酸残基280至299 (根据EU编号)组成。在其他实施方案中，具有改变的FcRn结合亲和力的本发明的多肽包含至少一个Fe部分(例如，一个或两个Fe部分)，其具有丨5 A丨“接触区”内的一个或多
个氨基酸置换。本文中使用的术语15 I FeRn“接触区”包括野生型全长&部分的下述位置的残基:243 至 261,275 至 280,282 至 293,302 至 319,336 至 348、367、369、372 至 389、391、393、408、424、425至440 (EU编号)。在优选的实施方案中，具有改变的FcRn结合亲和力的本发明的多肽包含至少一个Fe部分(例如，一个或两个Fe部分)，其具有对应于任何一个下述EU位置的氨基酸位置的一个或多个氨基酸置换:256、277至281、283至288、303至 309、313、338、342、376、381、384、385、387、434(例如，N434A 或 N434K)和 438。具有改变的FcRn结合活性的示例性氨基酸置换在国际PCT公布N0.W005/047327中公开，其通过引用并入本文。本发明的多肽可还包含公认的改变多肽糖基化的氨基酸置换。例如，结合多肽的scFc区可包含具有突变的Fe部分，所述突变产生减少的糖基化(例如，N-或O-连接的糖基化)，或可包含野生型Fe部分的改变的糖形(例如，低岩藻糖或无岩藻糖聚糖)。在其他实施方案中，本发明的多肽包含至少一个Fe部分，所述Fe部分具有位于溶剂暴露表面的工程化的半胱氨酸残基或其类似物。优选地，工程化的半胱氨酸残基或其类似物不干扰scFc区赋予的效应子功能。更优选地，所述改变不干扰scFc区与Fe受体(例如，Fe Y R1、Fc YRII或Fe Y RIII)或补体蛋白(例如，Clq)的结合活性，或引发免疫的效应子功能(例如， 抗体依赖型细胞毒性(ADCC)、吞噬作用或补体依赖型细胞毒性(CDCC))。在一个实施方案中，本发明的未处理的多肽可包含基因融合的Fe区(例如，scFc区)，其具有两个或多个独立地选自本文描述的Fe部分的组成性Fe部分。在一个实施方案中，二聚体Fe区的Fe部分是相同的。在另一实施方案中，至少两个Fe部分是不同的。例如，本发明的多肽的Fe部分包含相同数目的氨基酸残基，或其长度不同相差一个或多个氨基酸残基(例如，约5个氨基酸残基(例如，1、2、3、4或5个氨基酸残基)、约10个残基、约15个残基、约20个残基、约30个残基、约40个残基或约50个残基)。在又一实施方案中，本发明的多肽的Fe部分在一个或多个氨基酸位置的序列不同。例如，至少两个Fe部分在约5个氨基酸位置(例如，1、2、3、4或5个氨基酸位置)、约10个位置、约15个位置、约20个位置、约30个位置、约40个位置或约50个位置不同。VL多肽接头本文中使用的术语“多肽”是指肽或多肽序列(例如，合成的肽或多肽序列)，其连接多肽链的线性氨基酸序列中的两个结构域。本发明多肽由核酸分子编码，所述核酸分子编码直接或间接连接两个构成所述构建体的Fe部分的多肽接头。这些接头在本文中是指“scFc接头”。如果scFc接头在线性多肽序列中连续地连接两个Fe部分，则其为“直接”连接。相反地，scFc接头可将第一 Fe部分连接到结合部分,结合部分依次连接到第二 Fe部分，因此形成间接连接。这些scFc接头(L)引起单链基因构建体的形成。然而，在一个实施方案中，scFc多肽还包含导致可切割scFc接头(cscFc接头)的酶切位点,且在一个实施方案中，大体上切除(例如，细胞加工期间)。因此，加工的分子是二聚体分子，其包含至少两个氨基酸链并大体上缺少外源性接头氨基酸序列。在一些实施方案中，切除所有或基本上所有接头，然而在一些实施方案中，切割位点的部分可保留，例如，RRRR切割位点的4个精氨酸。在另一实施方案中，多肽接头的另一个类型(本文中指“间隔基”)可用于连接不同部分，例如，凝血因子或Fe部分的靶向部分。这种类型的多肽接头可为多肽分子提供柔性。一般不切割间隔基，然而这种切割是可取的。附图中示出了间隔基的示例性位置。间隔基可位于凝血因子、靶向部分和/或支架之间，例如，位于这些部分的N或C末端。在一个实施方案中，在加工过程中不去除这些接头。可存在于本发明的嵌合凝血因子中的接头的第三种类型是可切割的接头，其包括切割位点(例如，因子XIa、Xa或凝血酶切割位点)且其可包括在切割位点的N末端或C末端或两端的另外的间隔基接头。这些可切割的接头当并入凝血因子时产生具有异源切割位点的嵌合分子。附图中示出了 这些位点的示例性位置，且所述位置包括，例如，与靶向部分相邻。在另一实施方案中，这种接头可与凝血因子或其部分相邻。例如，在一个实施方案中，可切割的接头可融合到凝血因子重链的N末端以生成凝血因子的活性形式。在这种情况下，可切割的接头可包括切割位点N末端的另外的间隔基接头，但需要在切割位点C末端与凝血因子的重链的氨基端直接融合。本发明的未加工多肽包含两个或更多个Fe结构域或部分的多肽，所述Fe结构域或部分通过cscFc接头连接以形成包含于多肽单链的Fe区。cscFc接头的两侧为至少一个酶切位点，例如，用于胞内酶加工的位点。多肽在至少一个酶切位点的切割产生多肽，其包括至少两个多肽链。在一个实施方案中，cscFc接头任选地通过切割位点连接Fl或F2与，例如凝血因子。如上所陈述的，其他多肽接头可任选地用于本发明的构建体，例如，连接凝血因子或靶向部分与Fe部分。多肽接头的一种类型在这里被称为间隔基。可用于本发明的间隔基的一些示例性位置包括，例如，包含GlySer氨基酸的多肽，如附图中所述和以下详述的那些。在一个实施方案中，间隔基可与一个或多个部分相邻，所述部分各自独立地选自凝血因子、支架部分(例如Fe、切割位点)和靶向部分。在一个实施方案中，多肽接头是合成的，例如，非天然存在的。在一个实施方案中，多肽接头包括肽(或多肽)(其可以是天然存在的或非天然存在的)，其包含连接或基因融合第一氨基酸线性序列与第二氨基酸线性序列的氨基酸序列，其为非天然地连接或天然地基因融合。例如，在一个实施方案中，多肽接头可包含非天然存在的多肽，其为天然存在的多肽的修饰形式(例如，包含突变，如添加、置换或删除)。在另一实施方案中，多肽接头可包含非天然存在的氨基酸。在另一实施方案中，多肽接头可包含天然存在的氨基酸，其存在于不存在于自然界的线性序列。在又一实施方案中，多肽接头可包含天然存在的多肽序列。例如，在某些实施方案中，多肽接头可用于融合相同的Fe部分，因此形成同源scFc区。在其他实施方案中，多肽接头可用于融合不同的Fe部分(例如，野生型Fe部分和Fe部分变体)，因此形成异源scFc区。在另一实施方案中，多肽接头包含gly-ser接头或由其组成。在一个实施方案中，scFc或cscFc接头包含免疫球蛋白铰链和gly-ser接头的至少一部分。本文中使用的术语“gly/ser接头”是指由甘氨酸和丝氨酸残基组成的肽。示例性的gly/ser接头包含式为(Gly4Ser)n (SEQ ID NO:4)的氨基酸序列，其中η为正整数(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9或 10)。优选的 gly/ser 接头为(Gly4Ser)2 (SEQ ID NO: 29), (Gly4Ser)4 (SEQ ID NO:6)或(Gly4Ser)6(SEQ ID NO:5)。另一个示例性的gly/ser接头是GGGSSGGGSG(SEQ ID N0:30)。在某些实施方案中，所述gly-ser接头可以在多肽接头(例如，本文描述的任何多肽接头)的两个其他序列之间插入。在其他实施方案中，gly-ser接头连接在多肽接头(例如，本文描述的任何多肽接头)的另一个序列的一端或两端。在又一实施方案中，两个或多个gly-ser接头连续并入多肽接头中。在一个实施方案中，本发明的多肽接头包含上游铰链区(例如，源自IgGl、IgG2、IgG3或IgG4分子)的至少一部分、中间铰链区(例如，源自IgGl、IgG2、IgG3或IgG4分子)的至少一部分和一系列gly/ser氨基酸残基(例如，gly/ser接头,如(Gly4Ser) n) (SEQ ID N0:4))。本发明的多肽接头为至少一个氨基酸长且可具有不同长度。在一个实施方案中，本发明的接头为约I个至约50个氨基酸长。如在本文中使用的，术语“约”+/_2个氨基酸残基。由于接头长度必须是正整数，其长度为约I个至约50个氨基酸长，是指长度为I到3个至48到52个氨基酸长。在另一实施方案中，本发明的接头为约10至20个氨基酸长。在另一实施方案中，本发明的接头为约15至约50个氨基酸长。在另一实施方案中，本发明的接头为约20至约45个氨基酸长。在另一实施方案中，本发明的接头为约15至约35或约20至30个氨基酸长。在另一实施方案中，本发明的接头为约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、40、50 或 60 个氨基酸长。在一个实施方案中，本发明的肽接头为20或30个氨基酸长。可使用本领域的已知技术将多肽接头引入到多肽序列中。可通过DNA序列分析确定修饰。可使用质粒DNA转化宿主细胞用于产生的多肽的稳定制备。

VII1.酶切割位点在一个实施方案中，一个或多个酶切位点与例如侧面相连接或与本发明的未加工的多肽cscFc接头(L)相邻。此类切割位点可在ccFc接头的上游或下游或两者。例如，在编码本发明的多肽的构建体的实施方案中，切割位点与cscFc接头(L)的一个或两个末端连接(例如，直接地或间接地)。例如，在一个实施方案中，本发明的核酸分子具体指呈从氨基到羧基端的线性序列的由下式表示的多肽:A-Fl-P1-L-P2-B-F2 (I)其中A (如果存在)为凝血因子或其部分，Fl为第一 Fe部分或结构域，Pl为酶切位点，L为ScFc接头，P2为酶切位点，B (如果存在)为凝血因子或其部分，F2为第二 Fe部分或结构域且表示肽键。式(I)包含至少一个A或B及任选地两个。A和B (如果都存在)可能为凝血因子对应的重链和轻链。式(I)包含至少一个Pl或P2及任选地两个。Pl和P2(如果都存在)可为相同的或不同的。式⑴包含至少一个Fl和F2。Fl和F2(如果都存在)可为相同的或不同的。在另一实施方案中，因子XIa或Xa切割位点可并入本发明的构建体，例如，并入可切割的接头中。示例性的FXIa切割位点包括，例如，TQSFNDFTR和SVSQTSKLTR。示例性的凝血酶切割位点包括，例如，DFLAEGGGVR、TTKIKPR、LVPRG(SEQ ID NO: 35)和 ALRPRVVGGA。其他有用的切割位点在本领域是已知的。在一个实施方案中，接头的一些部分在至少一个酶切位点切割后可保留。为了使外来的氨基酸序列的存在降至最低，本发明的多肽可包括两个切割位点。在一些实施方案中，所有或基本上所有接头被切除，然而在一些实施方案中，切割位点的部分可保留，例如，RRRR切割位点的4个精氨酸。多肽的制备多种方法可用于重组产生本发明的嵌合凝血因子。在一个实施方案中，本发明涉及核酸构建体，其包含编码本发明的嵌合蛋白的核酸序列。应理解，由于密码的简并性，多种核酸序列将编码多肽的氨基酸序列。所需的多核苷酸可通过重新的固相DNA合成或早期制备的多核苷酸的PCR诱变产生。寡核苷酸介导的诱变是用于制备置换，框内插入，或改变(例如，改变的密码子)以引入编码氨基酸置换的密码子(例如，到Fe变体部分)的一种方法。例如，通过使编码所需突变的寡核苷酸与单链DNA模板杂交来改变起始多肽DNA。杂交后，使用DNA聚合酶合成模板的整个第二互补链，所述模板包含寡核苷酸引物。在一个实施方案中，基因工程，例如基于引物的PCR诱变，足以包含变化，如本文所定义的，用于制备编码本发明的多肽的多核苷酸。对于重组制备，将编码嵌合蛋白的多核苷酸序列插入到合适的表达载体中，例如，包含用于插入的编码序列的转录和翻译的必需元件，或在RNA病毒载体的情况下，用于复制和翻译的必需元件的载体。将编码嵌合蛋白的核酸插入到合适阅读框中的载体。然后将表达载体转染到将表达多肽的合适的靶细胞中。 本领域已知的转染技术包括，但不限于，磷酸钙沉淀(Wigler等，1978，Celll4:725)和电穿孔(Neumann等，1982，ΕΜΒ0，J.1:841)。可使用多种宿主表达载体系统表达真核细胞中本文中所述的嵌合蛋白。在一个实施方案中，真核细胞是动物细胞，包括哺乳动物细胞(例如，293细胞、？61^6、010、8皿、&^、抱1^细胞)。当嵌合蛋白在真核细胞中表达时，编码嵌合蛋白的DNA还可编码使嵌合蛋白分泌的信号序列。本领域的技术人员将理解，在翻译蛋白质的同时信号序列被细胞切除以形成成熟的嵌合蛋白。各种信号序列在本领域是已知的，例如，天然因子VII信号序列、天然因子IX信号序列和小鼠IgK轻链信号序列。可选地，不包含在嵌合蛋白中的信号序列可通过裂解细胞来恢复。本发明的嵌合蛋白可在转基因动物中合成，如啮齿类动物、山羊、绵羊、猪或牛。术语“转基因动物”是指将外源基因并入其基因组的非人动物。由于这种基因存在于生殖细胞组织，其从亲代传递到子代。外源基因被引入单细胞胚胎(Brinster等，1985，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA82:4438)。制备转基因动物的方法在本领域是已知的，包括产生免疫球蛋白分子的转基因学(Wagner 等，1981, Proc.Natl.Acad.Sc1.USA78:6376 ；McKnight 等，1983，Cell34:335 ；Brinster 等，1983，Nature306:332;Ritchie 等，1984，Nature312:517 ；Baldassarre 等，2003，Theriogenology59:831 ；Rob;等，2003，Theriogenology59:107 ；Malassagne 等，2003, XenotransplantationlO (3): 267)。表达载体可编码使重组产生的蛋白容易纯化和识别的标签。实例包括，但不限于，载体pUR278 (Ruther等，1983，EMBO J.2:1791)，其中本文所述的编码序列的嵌合蛋白可框内连接到具有lac z编码区的载体中以生成杂合蛋白质；pGEX载体可用于表达具有谷胱甘肽S-转移酶(GST)标签的蛋白质。通常这些蛋白质是可溶的，且可通过谷胱甘肽-琼脂糖小球的吸附及存在游离的谷胱甘肽下的洗脱而容易地从细胞纯化。载体包括纯化后易于去除标签的切割位点(例如，PreCission蛋白酶(Pharmacia, Peapack, N.J.))。对于本发明的目的，可使用许多表达载体系统。这些表达载体作为游离基因或宿主染色体DNA的完整部分通常在宿主生物体内是可复制的。表达载体可包括表达控制序列，其包括，但不限于，启动子(例如，天然结合的或异源启动子)、增强子、信号序列、剪接信号、增强子元件和转录终止序列。优选地，表达控制序列是能够转化或转染真核宿主细胞的载体中的真核启动子系统。表达载体还可使用源自动物病毒的DNA元件，所述病毒如牛乳头瘤病毒、多瘤病毒、腺病毒、痘苗病毒、杆状病毒、逆转录酶病毒(RSV、MMTV或M0MLV)、巨细胞病毒(CMV)或SV40病毒。其他涉及具有内部核糖体结合位点的多顺反子系统的使用。通常，表达载体含有选择标记(例如，氨苄青霉素抗性、潮霉素抗性、四环素抗性或新霉素抗性)以允许检测用所需DNA序列转化的那些细胞(参见，例如，Itakura等，美国专利4，704，362)。可通过引入一个或多个可选择转染的宿主细胞的标记选择将DNA整合到其染色体的细胞。 该标记可为营养缺陷型宿主、杀菌剂抗性(例如抗生素)或重金属(如铜)抗性提供原养型。可选择的标记基因能够与被表达的DNA序列直接连接或通过共转化引入到相同细胞中。优选的表达载体是NE0SPLA(美国专利N0.6，159，730)。这个载体包含巨细胞病毒启动子/增强子、小鼠β_球蛋白主要启动子、SV40复制原点、牛生长激素多聚腺苷酸序列、新霉素磷酸转移酶外显子I和外显子2、二氢叶酸还原酶基因和前导序列。已发现这种载体在并入可变和恒定区基因、细胞中转染及含有介质和氨甲喋呤扩增的G418中的选择后引起抗体很高水平的表达。载体系统还教导在美国专利号5，736，137和5，658，570中，其每一个都通过引用整体并入本文。该系统提供高表达水平，例如，>30pg/细胞/天。其他示例性载体系统在例如美国专利号6，413，777中公开。在其他实施方案中，本发明的多肽可使用多顺反子构建体来表达。在这些表达系统中，目标多基因产物如多聚体结合蛋白的多重多肽可由单个多顺反子结构体产生。这些系统有利地使用内部核糖体进入位点(IRES)以提供真核宿主细胞中相对高水平的本发明的多肽。相容的IRES序列在美国专利号6，193,980中公开，其也并入本文。本领域的技术人员将认为这种表达系统可用于有效产生本应用中公开的所有多肽。更普遍地，一旦制备编码多肽的载体或DNA序列，可将表达载体引入到合适的宿主细胞。即可转化宿主细胞。可通过本领域技术人员众所周知的各种技术将质粒引入到宿主细胞中。这些技术包括，但不限于，转染(包括电泳和电穿孔)、原生质体融合、磷酸钙沉淀、包膜DNA的细胞融合、显微注射及完整病毒的感染。参见，Ridgway, A.A.G."MammalianExpression Vectors//Chapter24.2, pp.470-472Vectors, Rodriguez 和 Denhardt 编辑(Butterworths, Boston, Mass.1988)。更优选地,通过电穿孔将质粒引入宿主。转化细胞在适合制备轻链和重链的条件下生长，并测定重链和/或轻链蛋白合成。示例性的测定技术包括酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)或荧光激活的细胞分选分析(FACS)、免疫组织化学等。
本文中使用的术语“转化”应在广义上使用，是指DNA引入受体宿主细胞，所述细胞改变基因型且因此引起受体细胞中的变化。在这些相同的系之间，“宿主细胞”是指使用重组DNA技术构建的并编码至少一个异源基因的载体转化的细胞。在描述多肽从重组细胞分离的过程中，可交换地使用术语“细胞”和“细胞培养物”以表示多肽来源，除非另有明确说明。换言之，多肽从“细胞”中的回收可指来自下旋的整个细胞或来自包含培养基和悬浮细胞的细胞培养物。用于蛋白表达的宿主细胞系最优选为哺乳动物源；本领域的技术人员具有优先确定最适于在其中表达的所需基因产物的特定宿主细胞系的能力。示例性的宿主细胞系包括但不限于DG44和DUXBlU中国仓鼠卵巢系，DHFR-)、HELA(人宫颈癌)、CVI (猴肾脏系)、COS (具有SV40T抗原的CVI的衍生物)、R1610(中国仓鼠成纤维细胞)BALBC/3T3(小鼠成纤维细胞)、HAK(仓鼠肾脏系)、SP2/0(小鼠骨髓瘤)、P3.times.63_Ag3.653(小鼠骨髓瘤)、BFA-lclBPT (牛内皮细胞)、RAJI (人体淋巴细胞)和293 (人体肾脏)。通常来自商业服务、美国组织培养物保藏或公布的文献的宿主细胞系是可用的。在一个实施方案中，宿主细胞内源性表达在形成成熟多肽的加工期间切割scFc接头(例如，如果存在这种接头且包含胞内加工位点)所必需的酶。在此加工期间，scFc接头可被大体上去除以减少外来氨基酸的存在。在本发明的另一实施方案中，宿主细胞被转化以表达一种或多种对细胞异源的酶，从而发生scFc接头的加工或将其改善。在一个实施方案中，可由细胞内源性或外源性表达的酶是弗林蛋白酶家族的成员。人弗林蛋白酶(即PACE)的完整cDNA和氨基酸序列在1990年公开。Van denOuweland A M 等，(1990)Nucleic Acids Res.18:664 ；Erratum in:Nucleic AcidsRes.18:1332(1990)。颁予Barr等的美国专利号5，460，950，描述了重组PACE及PACE与异源蛋白的基质前体多肽的共表达以提高活性的，成熟的异源蛋白的表达。

颁予van de Ven等的美国专利号5，935，815,同样描述了重组人弗林蛋白酶(即PACE)及弗林蛋白酶与异源蛋白的基质前体多肽的共表达以提高活性的，成熟的异源蛋白的表达。这个专利中公开的可能的基质前体包括因子IX的前体。除了 PACE，哺乳动物弗林蛋白酶/枯草杆菌蛋白酶/Kex2p-样前蛋白转化酶(PC)家族的其他家族成员被报导包括PC1/PC3、PC2、PC4、PC5/6 (下文中仅指 PC5)、PACE4 和 LPC/PC7/PC8/SPC7。虽然这些各种成员共有某些保守的整体结构特点，但它们的组织分布、亚细胞定位、切割特异性和优选基质不同。关于综述，参见Nakayama K(1997)Biochem J.327:625-35。与PACE相似，这些前蛋白转移酶一般包括，从氨基端开始，信号肽、前肽(其可被自身催化地切割)、以Asp、His、Ser和Asn/Asp残基为特征的枯草杆菌蛋白酶样催化结构域，以及对于催化活性也是必需的且以Arg-Gly-Asp (RGD)序列为特征的Homo B结构域。PACE、PACE4和PC5还包括富含Cys的结构域，其功能是未知的。此外，PC5具有含有及不含跨膜结构域的同工型；这些不同的同工型分别被称为PC5B和PC5A。PACE的催化结构域的氨基酸序列与这个前蛋白转移酶家族的其他成员的催化结构域的氨基酸序列之间的比较显示以下同一性程度:PC4为70% ；PACE4 和 PC5 为 65% ；PC1/PC3 为 61% ；PC2 为 54% 且 LPC/PC7/PC8/SPC7 为 51%。NakayamaK(1997)Biochem J.327:625-35。已报导PACE和PACE4部分重叠但底物不同。特别是，PACE4 (与PACE相比显著不同)已报导不能够加工FIX的前体多肽。Wasley L C等，(1993) J Biol Chem.268:8458-65 ；Rehemtulla A 等,(1993)Biochemistry.32:11586-90o颁予Seidah等的美国专利号5，840，529，公开了人PC7的核苷酸和氨基酸序列及PC7的显著活性(相比于其他PC家族成员)以切割HIV gpl60至gpl20和gp41。啮齿类动物PC5的核苷酸和氨基酸序列首次被Lusson J等(1993) Proc Natl AcadSci USA90:6691-5 描述为 PC5，并且被 Nakagawa T 等，(1993) J Biochem(Tokyo) 113:132-5描述为PC6。颁予Day等的美国专利号6，380，171公开了人PC5A的核苷酸和氨基酸序列(为不含跨膜结构域的同工型)。这些酶的序列和其克隆方法在本领域中是已知的。编码本发明的多肽的基因还可在非哺乳细胞中表达，如细菌或酵母菌或植物细胞。在这方面，应理解各种单细胞非哺乳动物的微生物如细菌也可被转化，即能在培养基或发酵液中生长的那些。易于转化的细菌包括肠杆菌科的成员，如大肠杆菌或沙门氏菌属的菌株；芽胞杆菌科，如枯草芽孢杆菌；肺炎球菌属；链球菌属和流感嗜血杆菌。还可进一步理解，当在细菌中表达时，多肽通常成为包涵体的部分。多肽必须被分离、纯化且然后装配到功能分子中。 除了原核生物，还可使用真核微生物。酿酒酵母或普通的面包酵母是真核微生物中最常使用的，虽然许多其他菌株通常是可用的。对于酿酒酵母中的表达，例如质粒YRp7 是常用的(Stinchcomb 等，Nature, 282:39 (1979) ;Kingsman 等，Gene, 7:141 (1979)；Tschemper等，Gene, 10:157 (1980)) 这种质粒已经包含TRPl基因，其提供用于缺乏在色氨酸中生长的能力的酵母的突变型菌株的选择标记，例如ATCC N0.44076号或PEP4-1 (Jones, Genetics, 85:12 (1977))。作为酵母宿主细胞基因组的特征的trpl病变的存在然后提供了用于检测缺乏色氨酸条件下生长的转化的有效环境。还可使用其他酵母宿主如毕赤酵母属。需要具有表达调控序列(例如，启动子)的酵母表达载体、复制原点、终止序列等。示例性的启动子包括3-磷酸甘油酸激酶和其他糖解酶。诱导型酵母启动子包括，来自醇脱氢酶、异细胞色素C和负责甲醇、麦芽糖和半乳糖利用的酶的启动子及其他。可选地，多肽编码核苷酸序列可并入转基因中以引入到转基因动物的基因组中并随后在转基因动物的乳汁中表达(参见，例如，Deboer等，US5, 741，957，Rosen, US5, 304，489 和 Meade 等，US5, 849，992)。合适的转基因包括与启动子可操作连接的多肽的编码序列和来自乳腺特异性基因的增强子，如酪蛋白或β -乳球蛋白。体外制备允许放大以产生大量所需多肽。在组织培养条件下用于哺乳动物细胞培养的技术在本领域是已知的，且包括均质悬浮培养，例如，在气升式反应器或在连续搅拌反应器中，或固定的或包埋的细胞培养，例如，在中空纤维中、微胶囊中、琼脂糖微珠或陶瓷筒上培养。如果有必要和/或如果需要，多肽溶液可通过常规的色谱法纯化，例如，凝胶过滤、离子交换色谱法、DEAE-纤维素色谱或(免疫_)亲和色谱法，例如，合成的铰链区多肽的优先生物合成之后或本文中描述的HIC色谱步骤之前或之后。亲和标签序列(例如，His (6)标签)可任选地与多肽序列结合或包括在其内以促进下游纯化。在一个实施方案中，本发明的宿主细胞包含编码含有scFc支架的多肽的基因构建体和一种或多种能够加工cscFc接头的酶。可使用单个载体或两个载体表达所述构建体和酶。
在一个实施方案中，本发明涉及编码本发明多肽的核酸分子。在一个实施方案中，核酸分子编码嵌合凝血因子，该嵌合凝血因子选自FVI1、FIX和FX并且包含与血小板结合的靶向部分和任选地凝血因子和靶向部分之间的间隔基部分。在另一实施方案中，本发明涉及编码包含FVII的多肽的核酸分子，其中FVII包含可通过凝血级联的组分活化的异源性酶切位点。一旦表达，嵌合凝血因子可通过本领域的标准程序纯化，包括硫酸铵沉淀、亲和柱色谱法、HPLC纯化、凝胶电泳等(一般参见Scopes, ProteinPurification (Springer-Verlag, N.Y.，(1982))并特异性地参见用于实施例的方法。具有至少约90%至95%的同质性的大体上纯的蛋白质是优选的，且具有98%至99%或更多的同质性的大体上纯的蛋白质是最优选的，其用于药物用途。IX.施用本发明多肽的方法在另一实施方案中，本发明涉及治疗具有止血障碍的受试者的方法，其包括施用治疗有效量的本发明的增强的嵌合凝血因子。施用给受试者的组合物包括核酸分子和多肽分子，所述核酸分子包含编码本发明的嵌合凝血因子(用于基因治疗)以及多肽分子的核苷酸序列。在一个实施方案中，本发明的增强的凝血因子组合物与至少一种其他促进止血的试剂联合施用。所述其他促进止血的试剂是证明具有凝血活性的治疗剂。例如，但不作为限制，止血剂可包括因子V、因子VI1、因子VII1、因子IX、因子X、因子X1、因子XI1、因子XII1、凝血酶原、或纤维蛋白原或前述任何一种的活性形式。止血剂的凝血因子还可包括抗纤维蛋白溶解药物，例如，ε氨基己酸、氨甲环酸。在本发明的一个实施方案中，组合物(例如，多肽或编码多肽的核酸分子)是当施用给受试者时凝血因子以活性形式存在的组合物。这种活化分子可被细胞以活性形式表达或可在施用给受试者之前体外活化。在另一实施方案中，组合物是其中凝血因子以活化形式存在且凝血因子在施用给 受试者后在凝血位点被体内活化的组合物。本发明的嵌合凝血因子可静脉内、皮下、肌肉内施用，或通过任何粘膜表面施用，如口服、舌下、经颊、舌下、鼻腔、直肠、阴道或经肺途径施用。嵌合蛋白可被植入到生物聚合物固相载体内或与其连接，所述载体能使嵌合蛋白缓慢释放至所需位点。对于口服施用，药物组合物可采用通过常规方法制备的片剂或胶囊的形式。组合物还可制成液体，例如糖浆或悬浮液。液体包括悬浮剂(例如，山梨醇糖浆、纤维素衍生物或氢化食用油脂)、乳化剂(卵磷脂或阿拉伯树胶)、非水相媒介物(例如，杏仁油、油性酯、乙醇或分馏的植物油)及防腐剂(例如，对羟苯甲酸甲酯或对羟苯甲酸丙酯或山梨酸)。制剂还可包括调味剂、着色剂和甜味剂。可选地，组合物可以供水或其他合适媒介物重构的干品提供。对于颊和舌下施用，组合物可采用根据常规方法制备的片剂、锭剂或速溶薄膜片的形式。对于通过吸入施用，根据本发明使用的化合物以气溶胶喷雾剂形式用合适的推进剂从加压包装或雾化器(例如，PBS中)方便地递送，所述推进剂例如，二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟甲烷、二氧化碳或其他合适的气体。在加压气溶胶的情况下，可通过提供递送计量数量的阀门确定剂量单位。例如吸入器或吹入器中使用的明胶的胶囊和药筒可配制成含有化合物和合适的粉末基质(如乳糖或淀粉)的粉末混合物。在一个实施方案中，本发明的多肽的施用途径是肠胃外施用。本文中使用的术语肠胃外包括静脉内、动脉内、腹膜内、肌肉内、皮下、直肠或阴道的施用。肠胃外施用的静脉内形式是优选的。尽管所有这些施用形式都清楚地涵盖在本发明的范围内，但是施用形式将为用于注射的溶液，特别是用于静脉内或动脉内注射或滴注的溶液。通常，用于注射的合适的药物组合物可包含缓冲液(例如，乙酸盐、磷酸盐或柠檬酸盐缓冲液)、表面活性剂(例如，多山梨醇酯)、任选地稳定剂(例如，人白蛋白)等。然而，在其他与本文教义相容的方法中，多肽可直接递送到不利细胞群体的位点，从而增加患病组织对治疗剂的暴露。用于肠胃外施用的制剂包括无菌水性或非水性溶液、悬浮液和乳液。非水性溶剂的实例为丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄榄油、和可注射的有机酯如油酸乙酯。水性载体包括水、醇/水溶液、乳液或悬浮液，包括盐水和缓冲基质。在本发明中，药学上可接受的载体包括，但不限于，0.01至0.1M且优选为0.05M磷酸盐缓冲液或0.8%盐水。其他常见的肠胃外媒介物包括磷酸钠溶液、林格氏葡萄糖、葡萄糖和氯化钠、乳酸林格氏(液)或非挥发性油。静脉内媒介物包括液体和营养物补充剂、电解质补充剂，如基于林格氏葡萄糖的那些物质等。也可存在防腐剂和其他添加剂，例如，抗菌剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体等。更特别地，适于注射使用的药物组合物包括无菌水性溶液(即水溶性)或分散液和用于临时制备无菌注射液或分散液的无菌粉末。在这种情况下，组合物必须是无菌的且应该是流体以达到容易注射的程度在制备和储存条件下应该是稳定的且优选地保存在防止微生物(如细菌和真菌)污染的条件下。载体可为溶剂和分散介质，其含有，例如，水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液态聚乙二醇等)及其合适的混合物。可保持适当的流动性，例如，通过使用包衣剂如卵磷脂、通过在分散的情况下保持所需的颗粒大小及通过使用表面活性剂。可通过各种抗细菌剂和抗真菌剂例如对羟苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等实现对微生物作用的预防。在许多情况下，可优选地包括等渗剂，例如，糖、多元醇，如甘露糖醇、山梨糖醇或组合物中的氯化钠。可通过组合物中包括延迟吸收的试剂(例如单硬脂酸铝和明胶)引起可注射组合物的延长吸收。在任何情况下，可通过将所需量的活性化合物(例如，自身或与其他活性剂组合的多肽)与本文列举的成分中的一种或其组合在适当溶剂中结合，根据需要，接着过滤灭菌来制备无菌可注射溶液。通常，通过将活性化合物并入无菌媒介物中制备分散剂，所述无菌媒介物包含基本的分散介质和上述列举的所需的其他成分。在用于制备无菌注射液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥，其产生活性成分和任何其他所需成分(来自其之前经无菌过滤的溶液)的粉末。将用于注射的制剂加工、装入容器(如安瓿、袋、瓶、注射器或小瓶)中并根据本领域已知方法在无菌条件下密封。此外，可将制剂包装并以试剂盒的形式销售。此类制品将优选地具有标签或包装插入物，其表明用于治疗患有或易患凝血障碍的受试者的相关组合物。药物组合物还可配制成为用于直肠施用的栓剂或保留灌肠剂，例如，包含常规的栓剂基质如可可脂或其他甘油酯。用于治疗条件的本发明组合 物的有效剂量，取决于多种不同因素，包括施用方法、革巴点、患者的生理状态、患者是人还是动物、施用的其他药物及治疗是否为预防性的或治疗性的。通常，患者是人而不是非人哺乳动物(包括也可被治疗的转基因哺乳动物)。可使用本领域技术人员已知的常规方法滴定治疗剂量以优化安全性和效力。在一个实施方案中，生物活性部分(例如，包含FIX)的剂量的范围可为25至100IU/kg,例如,0.417mg/kg至1.67mg/kg。在另一实施方案中，生物活性部分(例如,包含FVI11)的剂量的范围可为 25 至 65IU/kg，例如，0.003125mg/kg 至 0.008125mg/kg。在另一实施方案中，生物活性部分(例如，包含FVII)的剂量的范围可为90至2701^/1^或0.090至 0.270mg/kg。剂量的范围可为1000ug/kg至0.lng/kg体重。在一个实施方案中，给药范围为lug/kg至100ug/kg。蛋白可连续施用或在特定时间间隔施用。可使用体外试验确定最佳剂量范围和/或施用计划表。测量凝血因子活性的体外测定是本领域已知的，例如，STA-CLOTVlla-rTF凝血试验。此外，可由动物模型(例如，患血友病的狗)获得的剂量响应曲线推算有效剂量(Mount 等，2002, Blood99 (8): 2670)。上述范围的中间剂量也将在本发明的范围内。可以每天、在可选天、每周或根据经验分析确定的任何其他计划表施用给受试者。示例性的治疗需要长时期的多剂量施用，例如,至少6个月。在一些方法中，可同时施用两种或多种多肽，在这种情况下施用的每种多肽的剂量落入显示的范围内。本发明的多肽可在多重情况下施用。单剂量之间的间隔可以是每天、每周、每月或每年。间隔也可为不规律的，通过测量患者中的修饰的多肽或抗原的血液水平表示。可选择地，可将多肽作为缓释制剂施用，在这种情况下需要较低频率的施用。剂量和频率取决于患者中多肽的半衰期而改变。施用的剂量和频率可根据治疗是预防性的还是治疗性的而改变。在预防性应用中，将包含本发明多肽或其混合物的组合物施用给尚未在疾病状态的患者以增强患者的抵抗力或最大限度地减少疾病的影响。这种数量定义为“预防性的有效剂量”。在长周期内在相对不频繁的间隔施用相对低的剂量。一些患者在其余生继续接受治疗。

本发明的多肽可任选地与其他试剂联合施用，所述其他试剂有效地治疗需要治疗(例如，预防性或治疗性的)病症或疾患。如本文中使用的，与辅助疗法结合或组合的本发明的多肽的施用是指顺序的、同时的、同范围的、共时发生的、伴随的或同时期的施用或应用疗法和公开的多肽。本领域的技术人员将理解，组合的治疗方案的各种组分的施用或应用可定时的，以增加整体治疗效果。技术人员(例如，内科医生)能够容易地辨别有效的组合治疗方案而不需要基于选择的辅助治疗和本说明书内容的教义进行过度实验。将进一步理解，本发明的多肽可用于与一种或多种试剂结合或组合(例如，以提供组合的治疗方案)。可与本发明的多肽结合的示例性试剂包括表示护理正在治疗的特定病症的现行标准的试剂。这种试剂性质上可为化学的或生物的。术语“生物的”或“生物试齐IJ”是指由生物体和/或其预期用作治疗剂的产物制成的药物活性剂。用于与本发明的多肽结合的试剂的量可根据受试者而改变或根据本领域已知的方面来施用。参见例如，Bruce A Chabner 等,Antineoplastic Agents, G00DMAN&GILMAN' STHE PHARMACOLOGICAL BASIS OF THERAPEUTICS1233-1287 ((Joel G.Hardman 等编辑，第 9版1996)。在另一实施方案中，施用与护理标准一致的这种试剂的数量。
如前所述，可施用药学上有效量的本发明的多肽用于体内治疗凝血障碍。在这方面，应理解，可将本发明的多肽配制成容易施用并促进稳定的活性剂。优选地，根据本发明的药物组合物包含药学上可接受的、无毒的、无菌载体如生理盐水，无毒的缓冲液、防腐剂等。当然，可以单剂量或多剂量施用本发明的药物组合物以提供药学有效量的多肽。在一个实施方案中，本发明的嵌合凝血因子可作为核酸分子施用。可使用本领域已知的技术施用核酸分子，所述技术包括通过载体、质粒、脂质体、DNA导入、电穿孔、基因枪、静脉注射或肝动脉灌注。用于基因治疗实施方案的载体在本领域是已知的。按照本公开的范围，可根据前述治疗方法，以足够产生治疗性或预防性效果的数量将本发明的嵌合凝血因子施用给人或其他动物。如本领域技术人员应认识到，本发明的嵌合蛋白具有很多用途，包括但不限于治疗患有疾病或疾患的受试者的方法。所述疾病或疾患可包括但不限于止血障碍。在一个实施方案中，本发明涉及治疗患有止血障碍的受试者的方法，所述方法包括施用有效量的至少一种本发明的嵌合凝血因子。本发明的嵌合凝血因子通过促进纤维蛋白血块形式来治疗或预防止血障碍。本发明的嵌合凝血因子可活化凝血级联系统的任何成员。凝血因子可参与外源性途径、内源性途径或两者。本发明的嵌合凝血因子可用于治疗止血障碍，例如已知可用于存在于嵌合凝血因子中的特定凝血因子治疗的止血障碍。可通过本发明的嵌合蛋白的施用来治疗的止血障碍包括但不限于血友病A、血友病B、血管性血友病、因子XI缺乏(PTA缺乏)、因子XII缺乏、以及纤维蛋白原、凝 血酶原、因子V、因子VI1、因子X或因子XIII中的缺乏或结构异常。在一个实施方案中，止血障碍为遗传性病症。在一个实施方案中，该受试者患有血友病A，并且嵌合蛋白包括因子VII或因子Villa。在另一个实施方案中，受试者患有血友病A并且嵌合凝血因子包含因子VII或因子Vila。在另一个实施方案中，受试者患有血友病B并且嵌合凝血因子包含因子IX或因子IXa。在另一个实施方案中，受试者患有血友病B并且嵌合蛋白包含因子VII或因子Vila。在另一个实施方案中，受试者患有因子VII或因子VIIIa的抑制性抗体并且嵌合凝血因子包含因子VII或因子Vila。在又一个实施方案中，受试者患有针对因子IX或因子IXa的抑制性抗体并且嵌合蛋白包含因子VII或因子VIIa0本发明的嵌合凝血因子可用于预防性治疗患有止血障碍的受试者。本发明的嵌合凝血因子可用于治疗患有止血障碍的受试者的急性出血事件。在一个实施方案中，止血障碍是凝血因子例如因子IX、因子VIII的结果。在另一个实施方案中，止血障碍可以是缺陷性凝血因子的结果。在另一个实施方案中，止血障碍可以是后天获得性障碍。后天获得性障碍可由潜在的继发性疾病或疾患引起。无关的疾患可以是，举例而言，但不作为限制，癌症、自身免疫性疾病或妊娠。后天获得性障碍可由年老或由治疗潜在的激发性病症的药物治疗(例如癌症化疗)引起。本发明还涉及治疗未患有止血障碍或导致获得止血障碍的继发性疾病或疾患的受试者的方法。本发明因此涉及治疗需要一般止血剂的受试者的方法，其包括施用治疗有效量的至少一种本发明的嵌合凝血因子。例如，在一个实施方案中，需要一般止血剂的受试者正进行或将要进行手术。本发明的嵌合凝血因子可作为预防剂在手术之前或之后施用。本发明的嵌合凝血因子可在手术期间或之后施用以控制急性出血事件。手术可包括但不限于肝移植、肝切除术或干细胞移植。在另一个实施方案中，本发明的嵌合凝血因子可用于治疗患有急性出血事件但未患有止血障碍的受试者。急性出血事件可由严重创伤引起，例如手术、汽车事故、损伤、裂伤枪射击或任何其它导致无法控制的出血的创伤事件。本发明通过以下实施例进一步说明，所述实施例不应理解为限制。本申请引用的所有文献、专利和公布的专利申请的内容通过引用并入本文。
实施例除非另有说明，否则整个实施例中使用以下材料和方法。一般材料和方法一般而言，除非另有说明，否则本发明的实施采用化学、生物物理学、分子生物学、DNA重组技术，免疫学(特别是，例如抗体技术)的常规技术，以及电泳中的标准技术。参见，例如，Sambrook, Fritsch and Maniatis, Molecular Cloning:ColdSpring Harbor Laboratory Press (1989) ；Antibody Engineering Protocols(Methodsin Molecular Biology),510,Paul, S., Humana Pr(1996) ；Antibody Engineering:APractical Approach (Practical Approach Series, 169)，McCafferty 编辑，Irl Pr (1996)；Antibodies:A Laboratory Manual, Harlow 等，CS.H.L.Press, Pub.(1999)；和 CurrentProtocols in Molecular Biology 编辑 Ausubel 等，John Wiley&Sons (1992)。

实施例1.在第二 Fe链的氨基端包含FVI1-Fc和MB9_Fc的异源二聚体构建体pSYN-FVI 1-027 的克降FVI1-027构建体包含在细胞中制备的过程中加工时用于切割的cscFc。该构建体包含靶向部分，与GPIIbIIIa结合的scFv部分，MB9。生成用于表达FVI1-Fc和MB9_Fc异源二聚体的质粒(pSYN-FVI1-027)，其中MB9是之前示出的与活化血小板上的受体GPIIb/IIIa结合的scFv。来自pSYN-FVI1-027的蛋白在细胞中表达为单一的多肽，其中FVI1-Fc亚基的C-末端通过(GGGGS)6x多肽接头与MB9-Fc亚基的N-末端连接。此外，将RRRRS和RKRRKR序列分别插入到多肽接头的5’端和3’端，以用于被每个序列的最后一个精氨酸后面的前蛋白转化酶胞内切割。因此，细胞将表达双链FVI1-Fc/MB9-Fc异源二聚体，其中FVI1-Fc链在C-末端具有RRRRS序列，但接头的其余部分和RKRRKR序列以其他方式被除去。作为第一步，使用以下引物生成一系列中间质粒:Hindlll-Sal1-BpsE1-Fc-FAGTCAAGCTTGTCGACTCCGGAACTCCTGGGCGGACCBamH1-接头-Fc-RCATCGGATCCCCCGCCACCGGAACCTCCACCGCCTGATCCACCCCCACCTGATCCGCCGCCACCTTTACCCGGAGACAGGGAGAGGBcl I—Fc-FCAGTCTTGATCAGACAAAACTCACACATGCCCACC
BcFc-EccB1-RACTGACGAATTCTCATTTACCCGGAGACAGCCAGHindiI1-Kozak-FVI1-F:CGACAAGCTTGCCGCCACCATGGTCTCCCAGGCCCTCAGGFVI1-HC-BspE1-R:AGGAGTTCCGGAGCTGGGCACGGTGGGCATGTGTGAGTTTTGTCGGATCCCCCGCCACCGGAACCTCCACCGCCTGATCCACCCCCACCTGATCCGCCGCCACCGGACCCACCTCCGCCGGAGCCACCGCCACCGGGAAATGGGGCTCGCAGGAGG使用以下循环用25pmol HindII1-Sall-BpE1-Fc-F、BamH1-接头-Fc-R 和模板pSYN-Fc-001 进行 50ul PCR 反应:95°C 2 分钟；30 个循环(95°C 30 秒，54°C 30 秒，72°C I 分钟)。用凝胶回收试剂盒(Qiagen, Valencia, Calif.)凝胶纯化预期大小的条带C700bp),并将其克隆到 pBUDCE4(Invitrogen, Carlsbad, Calif.)的 HindIII 和 BamHI 限制性位点以生成中间体 pSYN-FVI1-007。引物 Hindi I 1-Sal 1-BpE1-Fc-F 和 BamH1-接头-Fc-R 扩增起始于氨基酸221 (EU编号)的Fe区，并添加紧挨在位点Fe区的上游的HindIII和SalI限制性酶位点，及编码(GGGGS)4x接头的DNA片段，后面是紧挨在Fe编码区下游的BamHI 位点。然后，用 25pmol Bcl1-FC-F, scFc-EcoR1-R 和模板 pSYN-Fc-Oll 使用与上面相同的循环进行50ul反应。如上述凝胶纯化预期大小的条带Γ70(Λρ)，用限制性内切酶BamHI和EcoRI切割，并克隆到pS YN-FVI1-007的BclI/EcoRI限制位点中以生成中间质粒pSYN-FVI1-008。引物对Bcl1-Fc-F和scFc-EcoR1-R扩增Fe区，同时添加分别紧挨在Fe编码区的上游和下游的BclI和EcoRI限制性位点。为了生成最后一个中间质粒，用25pmolHindi I 1-Kozak-FVI 1-F, FVI 1-HC-BspE1-R 和模板 pSYN-FVI1-OOl 使用以下循环进行50ulPCR反应:95°C2分钟;30个循环(95°C 30秒，55°C 30秒，72°C 90秒)。引物对扩增FVII编码区，同时添加位于编码(GGGGS)6x多肽接头的分子3’端的DNA片段，后面是终止于氨基酸221 (EU编号)的Fe区片段。弓丨物Hindll1-Kozak-FVI1-F产生位于分子5’端的HindIII限制性酶切位点，所述分子后面是紧挨在FVII编码区上游的Kozak序列。FVI1-HC-BspE1-R引物引入编码多肽接头的DNA和Fe部分。如上述凝胶纯化预期大小的条带Γ 50(Λρ)，并将其克隆到 pSYN-FVI1-008 的 Hindlll/BspEI 位点以生成 pSYN-FVI1-Oll。然后，合成两个DNA 片段:Genescr ipt-FVI1-027-l 和 Genscr ipt-FVI1-026-2。Genescript-FVI1-027-l由编码Fe区的部分(起始于核苷酸1306，EU编号)的DNA片段组成，所述Fe区的部分后面是序列RRRRS-(GGGGS) 6x-RKRRKR (其后面是MB9scFv的部分(残基1-142))。使用遗传密码的简并性将EcoRI位点引入MB9的编码序列中以保持合适的氨基酸序列并与Genescript-FVI1-027-l的最后6个碱基重叠。此外,位于5’端的前6个碱基包括存在于Fe区内的SapI位点。Genscript-FVI1-026-2由编码MB9的部分(残基143-273)的DNA片段组成，所述MB9的部分后面是(GGGGS) 6x多肽接头(其后面是Fe区和EcoRI位点)。使用遗传密码的简并性将EcoRI位点引入MB9的编码序列中以保持合适的氨基酸序列并与Genescript-FVI1-026-2的前6个碱基重叠。将Genescript-FVI1-027-l 克隆到 pSYN-FVI1-Oll 的 SapI 和 EcoRI 位点以生成pSYN-FVI1-036。接下来，将 Genscript-FVI1-026-2 克隆到 pSYN-FVI1-036 的 EcoRI 位点以生成pSYN-FVI1-027。限制性内切酶分析和DNA测序证实了最后的克隆步骤的正确方向。
实施例2.在第二 Fe链的羧基端包含FVI1-Fc和MB9_Fc、MB9的异源二聚体构建体FVI1-037 的克降使用加工期间未被切割的scFc支架制备FVI1-037构建体。在该构建体中，将靶向部分、然后结合GPIIbIIIa的MB9scFv连接到第二 Fe部分的C-末端。DNA片段Genscript-FVI1-037的合成是外包的(Genscript)。该片段包含Fe区的部分(残基434至447，EU编号)，其后面是(GGGGS)4x多肽接头和MB9scFv。将Genscript-FVI1-037 的 SapI/EcoRI 片段亚克隆到 pSYN-FVI1-Oll (指 P0830)的 SapI/EcoRI以生成中间构建体。将来自pSYN-FVI1-Oll的SapI片段亚克隆到中间构建体的SapI位点以生成pSYNFVI1-037。实施例3.包含FVI1-Fc和在第二 Fe链的C末端紧靠GPIb的肽的异源二聚体构建体pSYN-FVI 1-041中间构律体的克降为了制备这种构建体，首先将FVI1-041构建体制备为中间体。DNA分子Genscript-FVI1-041的合成是外包的(Genscript)。用SapI消化该片段并将其克隆pSYN-FVI1-011的SapI位点以生成pSYN-FVI1-041。该过程在第二 Fe引入唯一的SalI位点(残基 412-413EU 编号，GTG GAC 至 GTC GAC)。pSYN-FVI1-044-.-Q45 和-046 的克降将FVI1-041构建体用作起始材料以生成几种包含靶向部分的构建体，所述靶向部分是与GPIb结合的肽。在-044构建体中使用PS4肽，-045构建体中使用OSl肽，-046构建体中使用0S2肽。在这些构 建体中使用scFc支架并且肽通过接头与第二 Fe部分的C-末端连接。Genscript-FVI 1~044> -045 和-046 的合成是外包的(Genscript)。这些DNA片段被Sall/EcoRI切割并亚克隆到pSYN-FVI 1-041的Sall/EcoRI位点以生成pSYN-FVI1-044、-045 和-046。实施例4.包含FVI1-Fc和在第二 Fe链的C末端紧靠GPIb的肽的异源二聚体构建体pSYN-FVI 1-043 中间体的克降为了制备这种构建体，首先将FVI1-043结构制备为中间体。DNA片段Genscript-FVI1-043的合成是外包的(Genscript)。该片段包含编码Fe区的部分(残基232至447，EU编号)的DNA分子，所述Fe区的部分的后面是(GGGGS) 4x多肽接头和Fe区的另一个部分(残基221至238，EU编号)。用BspEI和RsrII消化该DNA片段并将其亚克隆到pSYN-FVI1-042的BspEI/RsrII位点以生成pSYN-FVII_050。该过程在第一 Fe中引入唯一的 SalI 位点(残基 412-413，EU编号，GTGGAC 至 GTC GAC)。将 pSYNFVI1-050 的 HindIII/EcoRI 片段亚克隆到 pSYN-FVI1-011 的 Hindlll/EcoRI 位点以生成 pSYN-FVI1-043。pSYN-FVI 1-047.-Q48 和-049 的克降将FVI1-043构建体用作起始材料以生成几种包含靶向部分的构建体，所述靶向部分是与GPIb结合的肽。在-047构建体中使用PS4肽，-048构建体中使用OSl肽，-049构建体中使用0S2肽。在这些构建体中使用scFc支架且将肽在scFc接头和与第二 Fe部分的N-末端连接的接头之间插入。DNA 分子 Genscript-FVI1-047、-048 和-049 的合成是外包的(Genscript)。将来自 Genscript-FVI1-047、-048 和-049 的 Sal/RsrII 片段亚克隆到 pSYN-FVI1-043 的 SalI/RsrII 位点以分别产生 pSYN-FVI1-047、-048 和-049。实施例5.包含Gla缺失的FVI1-Fc和靶向分子的异源二聚体构建体FVI1-028中间体的克降为了制备这种构建体，首先将FVI1-028构建体制备为中间体。DNA片段Genscript-FVI 1-028的合成是外包的(Genscript)。用Hindlll/Xbal切割该片段并将其亚克隆到 pSYN-FVI1-011 以生成 pSYN-FVI1-028。FVI1-053 的克降将FVI1-028构建体用作起始材料以生成包含靶向部分且使用缺少Gla结构域的凝血因子的构建体。对于这种构建体，将氨基酸I至35从FVII移除并在残基R152 (WT FVII编号)后添加RKRRKR插入物以促进细胞内活化。MB9scFv用作靶向部分。DNA分子Genscript-FVI 1-025被外包并且来自该分子的Xbal/BsiWI片段亚克隆到 pSYN-FVI1-028 的 Xbal/BsiWI 位点以生成 pSYN-FVI1-053。实施例6.包含作为两个单独的多肽的因子VII重链和轻链的异源二聚体构建体pSYN-FVI 1-024中间构律体的克降在FVI1-024构建体中，因子FVII的重链和轻链在单链分子中是不邻接的。该构建体使用cscFc以使cscFc接头在反式-高尔基体网络中被蛋白酶切割。这种切割导致接头去除及FVII活化，导致活化的FVIIaFc的表达。使用以下引物通过与聚合酶链反应偶联的逆转录作用从人肝脏mRNA库(Ambion, Austin, Texas)获得 FVII 的编码序列:FVI1-FlGGGAATGTCAACAGGCAGGGFVI1-RlCTTGGCTTTCTCTCCACAGGC根据制备商的标准方案使用具有Platinum Taq系统的Superscript One-stepRT-PCR(Invitrogen, Carlsbad, Calif.)在MJ温度循环器中用IOpmol每种引物的进行50 μ I反应。使用的循环为50°C逆转录30分钟，然后在94°C变性2分钟，和30个循环(94 0C 30 秒，53°C 30 秒，72°C 90 秒)，后面是 72 °C 10 分钟。使用 Gel Extraction 试剂盒(Qiagen, Valencia, Calif.)凝胶纯化预期大小的条带Cl400bp)并使用TOPO TA克隆试剂盒(Invitrogen, Carlsbad, Calif.)将其克隆到pCR2.1T0P0中以生成中间质粒pSYN-FVI1-001。为了构建用于表达双链FVI1-Fc和Fe异源二聚体的质粒，使用以下引物将FVII编码序列PCR扩增:Hindll1-Kozak-FVI1-FCGACAAGCTTGCCGCCACCATGGTCTCCCAGGCCCTCAGGBspe1-Fc-FVI1-RCGACTCCGGAGCTGGGCACGGTGGGCATGTGTGAGTTTTGTCGGGAAATGGGGCTCGCAGG正向引物Hindlll-Kozak-FVI1-F添加了 HindIII限制性位点，其后面是紧挨在FVII编码区上游的Kozak序列。反向引物Bspe1-Fc-FVI1-R添加了 IgGl (Fe区)恒定区的片段，所述IgGl包含氨基酸221-233 (EU编号)。该过程还利用遗传密码的简并性在氨基酸231-233并入BspEI限制性位点以保持正确的氨基酸序列(EU编号)。根据制备商的方案使用Platinum PfxDNA聚合酶系统在MJ温度循环器中使用以下循环用15pmol每种引物和模板pSYN-FVI1-001进行50ul反应:95°C 2分钟；30个循环(95°C 15秒，49°C 30秒，68°C90 秒)；68°C 10 分钟。用 HindIII 和 BspEI 消化质粒 pSYN_FIX_027 (pBUD FIXFc/Fc)并用Gel Extraction试剂盒(Qiagen, Valencia, Calif.)纯化载体的预期大小的条带(大约5800bp)以除去FIX插入物(预期大小的条带大约1480bp)。接下来，在移除FIX插入物后将PCR-扩增的FVII序列亚克隆到源自pSYN-FIX-027的载体的HindIII和EcoRI位点。这生成pSYN-FVI1-002 (pBUD FVIIFc/Fc)。接下来，使用以下引物将(GGGGS) 6x多肽接头添加到pSYN-FVI1-002中的FVII和Fe区编码序列之间:FVI1-接头-F:CATCCCCAGCACGTACGTCCFVI1-接头-R:GGGCATGTGTGAGTTTTGTCTGATCCCCCGCCACCGGAACCTCCACCGCCTGATCCACCCCCACCTGATCCGCCGCCACCGGACCCACCTCCGCCGGAGCCACCGCCACCGGGAAATGGGGCTCGCAGGAGGFe-接头-F:GACAAAACTCACACATGCCCACCFe-接头-R:
GCAGAATTCTCATTTACCCGGAG根据制备商的标准方案使用Expand High Fidelity System(BoehringerMannheim, Indianapolis, Ind.)在 MJ 温度循环器中用 12pmol FVI1-接头-F 和 FVI1-接头-R (反应I)或Fe-接头-F和Fe-接头-R (反应2)进行两个12 μ I PCR反应。使用以下循环用I μ g pSYN-FVI 1-002作为模板进行第一和第二反应:94°C 2分钟；14个循环(94°C 30秒，55°C 30 秒，72°C 2 分钟)；72°C 10 分钟。用 Gel Extraction 试剂盒(Qiagen, Valencia,Calif.)凝胶纯化预期大小的条带(反应I为532bp，反应2为670bp)，然后将其在PCR反应中与如前所述的25pmol FVI1-接头-F和Fe-接头-R结合，但进行30轮扩增。用GelExtraction试剂盒(Qiagen, Valencia, Calif.)凝胶纯化预期大小的条带(1200bp)并用限制性酶KpnI和EcoRI消化。如前所述将预期大小的条带(920bp)凝胶纯化并将其克隆到pSYN-FVI 1-002 的 KpnI/EcoRI 位点以生成 pSYN-FVI1-003 (pBUD FVIIFc/6x (GGGGS) /Fe)。pSYN-FVI 1-024的克降以表汰双链异源二聚体生成用于表达双链异源二聚体的质粒(pSYN-FVI1-024)，所述双链异源二聚体中一条链由FVII轻链(残基1-152)组成，FVII轻链的后面是(GGGGS)6x接头(其后面是Fe区)，而另一条链由FVII重链(残基153至406)组成，FVII重链的后面是(GGGGS)6x接头(其后面是Fe区)。设计质粒以表达异源二聚体作为单一多肽，其中FVII重链-接头-Fe链的C末端通过以下多肽序列与重链-接头-Fe链的N末端连接:RRRRS- (GGGGS) 6x-RKRRKR，其中RRRRS和RKRRKR序列是前蛋白转化酶切割位点。通过在每个切割位点的最后一个精氨酸后面的前蛋白转化酶的胞内切割可引起多肽接头的去除。因此，细胞将表达双链异源二聚体，其中FVII轻链-接头-Fe链在C末端具有RRRRS序列，但接头的其余部分RKRRKR序列被去除。pSYN-FVI1-024和几种中间质粒的构建需要使用以下引物:Hindll1-SaI1-EpE1-Fc-FAGTCAAGCTTGTCGACTCCGGAACTCCTGGGCGGACCBamH1-接头(PACEl)-Fc-RCATCGGATCCCCCGCCACCGGMCCTCCACCGCCTGATCCACCCCCACCTGATCCGCCGCCACCCGCTCCGGCGGCGCCGTTTACCCGGAGACAGGGAGAGGHindll1-Kozak-FVI1-FCGACAAGCTTGCCGCCACCATGGTCTCCCAGGCCCTCAGGBspE1-Fc-接头-FVIILC-RGAGTTCCGGAGCTGGGCACGGTGGGCATGTGTGAGTTTTGTCTGATCCCCCGCCCACCGGMCCTCCACCGCCTGATCCACCCCCACCTGATCCGCCGCCACCGGACCCACCTCCGCCGGAGCCACCGCCACCTCGGCCTGGGGTTTGCTGGBamHI_2xlin k-间隔-HC-FCAGTCTGGATCCGGCGGTGGAGGTTCCGGTGGGGGTGGATCMGGMGAGGGAGGMGAGGATTGTGGGGGGCAAGGTGTGCCFc-EcoRl-R ATGTCTGAATTCTCATTTACCCGGAGACAGGGAGAGG为了生成第一中间质粒，根据制备商的标准方案使用Expand High FidelitySystem (Boehringer Mannheim, Indianapolis, Ind.)在 MJ温度循环器中用 25pmol 引物Hindi I 1-Sal 1-BpE1-Fc-F 和 BamH1-接头(PACEl)-Fc-R 和模板 pSYN-Fc-OOl 进行 PCR反应。使用以下循环:95°C 2分钟；30个循环(95 °C 30秒，58°C 30秒，72°C I分钟)；720C 10分钟。如上述凝胶纯化合适大小的条带(大约730bp)并将其克隆到PBUDCE4载体(Invitrogen, Carlsbad, Calif.)的 HindII I/BamHI 位点，生成 p SYN-FVI1-014 引物 Hindll1-Sal1-BpE1-Fc-F 和 BamH1-接头(PACEl)-Fc-R 的 PCR 扩增生成编码 Fe 区的部分(氨基A X-Y)的DNA片段，所述Fe区的部分后面是RRRRS序列和(GGGGS)2x多肽接头。引物HindII1-Sal1-bpE1-Fc-F在分子5’端引入HindIII和SalI限制性位点，而引物BamH1-接头(PACEl)-Fc-R在3’端引入BamHI，其与编码GGGGS接头的最后两个残基(密码子为GGA TCC的残基GS)的密码子重叠。接下来，使用pSYN-FVI1-014的克隆中描述的相同条件，如所述用弓I物HindiI1-Kozak-FVI1-F和BspE1-Fc-接头-FVIILC-R和模板pSYN-FVI 1-002进行另一个PCR反应，但退火温度为57°C。凝胶纯化预期大小的条带(大约 700bp)并将其克隆到 pSYN-FVI1-014 的 HindIII 和 BspEI 位点以生成 pSYN-FVII_023。引物 Hindll1-Kozak-FVI1-F 和 BspE1-Fc-接头-FVIILC-R 扩增编码 FVII 轻链的 DNA 片段，所述FVII轻链后面是(GGGGS)6xS肽接头和直到氨基酸232 (EU编号)的Fe区的部分。引物Hindll1-Kozak-FVI1-F在分子5’端引入后面是Kozak序列的HindIII限制性酶切位点，而引物BspE1-Fc-接头-FVIILC-R在分子3’端添加BspeI位点。在最后一步中，使用以下循环用引物BamH1-2xlink_间隔-HC-F和Fc-EcoR1-R以及模板pSYN-FVI1-003如上述进行PCR反应:95°C 2分钟；30个循环(95°C 30秒，55°C 30秒，72 0C 2分钟);72°C 7分钟。该PCR反应产生编码(GGGGS) 2x多肽接头的DNA分子，所述多肽接头后面是RKRRKR序列(其后面是FVII重链)。引物BamH1-2xlink-间隔-HC-F和Fc-EcoR1-R在分子5’端和3’端分别引入BamHI位点和EcoRI位点。将预期大小的条带(大约 1600bp)克隆到 pSYN-FVI1-023 的 BamHI 和 EcoR 位点以生成 pSYN-FVI1-024。中间体dSYN-FVI1-073 的克降通过基于PCR的定向位点的诱变方法，将沉默的突变引入FVI1-024的第一 Fe部分，导致在编码412和413位(EU编号)氨基酸的氨基酸的DNA区生成SalI位点。其生成中间构建体FVI1-073。pSYN-FVI 1-057 的克隆包含来自pSYN-FVI1-057的SalI至BsiWI位点的核苷酸的DNA序列的合成是外包的。将该DNA亚克隆到pSYN-FVI1-073的Sall/BsiWI位点以生成pSYN-FVI1-057。pSYN-FVI1-0 58、pSYN-FVI1-059、pSYN-FVI1-060、P SYN-FVI1-061 和pSYN-FVI 1-062 的克隆如pSYN-FVI1-057中所述地克隆这些构建体(从SalI至BsiWI的DNA的合成是外包的并亚克隆到pSYN-FVI1-073)。pSYN-FVI 1-066 的克隆包含来自pSYN-FVI1-066的SalI至RsrII位点的核苷酸的DNA序列的合成是外包的。将该DNA亚克隆到pSYN-FVI1-043的Sall/RsrII位点以生成pSYN-FVI1-066。pSYN-FVI 1-067 的克隆包含来自pSYN-FVI1-067的SalI至EcoRI位点的核苷酸的DNA序列的合成是外包的。将该DNA亚克隆到pSYN-FVI1-041的Sall/EcoRI位点以生成pSYN-FVI1-067。pSYN-FVI 1-090 的克隆包含来自pSYN-FVI1-090的BamHI至BsiWI位点的核苷酸的DNA序列的合成是外包的。通过3种方法连接(其中外包的DNA用BamHI/BsiWI切割并且pSYN-FVII_061用BamHI/Bsiffl/Notl 切割)将该 DNA 亚克隆到 pSYN-FVI1-061 以生成 pSYN-FVI1-090。pSYN-FVI 1-100 的克隆用胰蛋白酶的170环(氨基酸EASYPGK)取代FVII的170环的部分(FVII成熟序列的氨基酸311至322)。通过标准重叠PCR方法使用pSYN-FVI1-090作为模板和主链结构引入这种突变以生成pSYN-FVI1-100。pSYN-FVI1-115 的克隆通过基于PCR的定向位点诱变将三点突变(V158D、E296V和M298Q ;成熟FVII序列编号)引入pSYN-FVI1-090的FVII编码区以生成pSYN-FVI1-115。pSYN-FVI1-118 的克隆包含来自pSYN-FVI1-118的XbaI至BsiWI位点的核苷酸的DNA序列的合成是外包的。将该DNA亚克隆到pSYN-FVI1-011的Xbal/BsiWI位点以生成pSYN-FVI1-118。pSYN-FVI1-119 的克隆包含来自pSYN-FVI1-119的XbaI至BsiWI位点的核苷酸的DNA序列的合成是外包的。将该DNA亚克隆到pSYN-FVI1-011的Xbal/BsiWI位点以生成pSYN-FVI1-119。pSYN-FVI 1-127 的克隆通过PCR使用pSYN-FVI1-100作为模板生成包含胰蛋白酶的170环的DNA片段。该PCR反应在5’和3’端分别生成BsiWI和BspEI限制性位点。将该DNA亚克隆到pSYN-FVI1-118 的 BsiWI/BspEI 位点以生成 pSYN-FVI1-127。pSYN-FIX-042 的克隆将来自pSYN-FIX-030 (如美国专利7566565中所述)的HindiII/BspEI片段亚克隆到 pSYN-FVI1-011 的 Hindlll/BspEI 位点以生成 pSYN_FIX_042。pSYN-FIX-068 的克隆将来自pSYN-FIX-030 (US7566565中详细描述的质粒)的Hindlll/BspEI片段亚克隆到 pSYN-FVI1-066 的 Hindlll/BspEI 位点以生成 pSY N-FIX-068。pSYN-FIX-088 的克隆将来自pSYN-FIX-067 的 BspE1-EcoRI 片段亚克隆到 pSYN_FIX_053 的BspE1-EcoRI 位点以生成 pSYN-FIX-088。pSYN-FIX-089 的克隆将来自pSYN-FIX-048 的 BspE1-EcoRI 片段亚克隆到 pSYN_FIX_053 的BspE1-EcoRI 位点以生成 pSYN_FIX_089。pSYN-FIX-090 的克隆包含FIX编码区、SCE5编码序列和EcoRI位点的DNA片段是外包合成的，并将其亚克隆到pSYN-FIX-053的Xbal/EcoRI位点以生成pSYN-FIX-090，所述FIX编码区为蛋白的XbaI位点至C末端且后面是6x (GGGGGS)接头。SCE5序列如下所列:AQVQLQESGG GLVQPGGSLRLSCAASGFMFSRYAMSWVRQAPGKGPEWVSGISGSGGSTYYADSVKGRFTVSRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGATYTSRSDVPDQTSFDYWGQGTLVTVSSGSASAPKLEEGEFSEARVSELTQDPAVSVALGQTVRTTCQGDSLRNFYASWYQQKPGQAPTLVIYGLSKRPSGIPDRFSASSSGNTASLTITGAQAEDEADYYCLLYYGGGQQGVFGGGTKLTVLRQPFAAPSVTLFPPSSAApSYN-FVI 1-094 的克隆包含编码6x (GGGGS)接头(所述接头后面是SCE5编码序列)的序列的DNA片段是合成的(外包的)，并将其克隆到预先修饰的pSYN-FVI1-011变体的EcoRV/EcoRI位点以在FVII编码区的C末端生成EcoRV位点。pSYN-FVI1-088 的克隆包含来自pSYN-FVI1-088的SalI至RsrII位点的核苷酸的DNA序列的合成是外包的。将该DNA亚克隆到pSYN-FVI1-066的Sall/RsrII位点以生成pSYN-FVI1-088。pSYN-FVI 1-125 的克隆DNA片段由pSYN-FVI1-088进行PCR扩增，其包含AP3区和接头的部分。该PCR反应在DNA片段的5’和3’端分别生成BamHI和EcoRI位点。将该DNA片段亚克隆到pSYN-FVI1-011 的 BamHI/EcoRI 位点以生成 pSYN-FVI1-125。pSYN-FVII 1-041 的克隆通过逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)使用FVIII特异性引物从人体肝脏多聚腺苷酸RNA(Clontech)获得人重组B-结构域缺失的FVIII的编码序列。FVIII序列包括FVIII的天然信号序列。B-结构域缺失在丝氨酸743 (S743 ；2287bp)之后开始，并在谷氨酸1638 (Q1638; 4969bp)之前终止，总共缺失 2682bp (SQ 型)。通过RT-PCR使用Fe特异性引物从人白细胞cDNA文库(Clontech)获得人重组Fe的编码序列。设计引物以使B-结构域缺失的FVIII序列在没有中间接头下与Fe序列的N末端直接融合。在CMV启动子的调控下将FVIIIFc DNA序列克隆到哺乳动物双表达载体pBUDCE4.1 (Invitrogen)中。通过RT-PCR获得包括小鼠Igk信号序列的第二个相同的Fe序列，并将其克隆到表达载体PBUDCE4.1中第二个启动子EFla的下游。该最终构建体称作pSYN-FVII1-013。使用PCR和标准分子生物学技术从相似构建体中产生第二个质粒，以表达rFVIIIBDD-Fc-Fc,其中rFVIIIBDDFc编码序列与具有(GGGGS) 4接头的第二 Fe序列融合，允许在短暂转染中只产生rFVIIIBDD-Fc单体-二聚体杂交体。该构建体称作pSYN-FVII1-041。pSYN-FVII 1-049 的克隆通过将Nhel/Xhol片段从pBUD_CE4.1克隆到pSYN-FVII1-013中以生成中间体pSYN-FVII 1-048。包含来自pSYN-FVIII_049的RsrII至XbaI位点的区域的DNA片段的合成是外包的。将该片段亚克隆到pSYN-FVI1-048的RsrII/Xbal位点以生成pSYN-FVI1-049。pSYN-FVII 1-108 的克隆将来自pSYN-FVI1-066 的 SalI/RsrII 片段亚克隆到 pSYN-FVI 11-049 以生成pSYN-FVII1-108。实施例7.在活化构建体表达方面的其他尝试以表达活化的FVII的目标制备几种其他构建体。然而，这些构建体没有成功地表达活化分子。通过蛋白质印迹证实，使用将异源信号肽融合到重链N末端的一般方法，FVII重链不能被游离的N末端表达。pSYN-FVI1-010 的克降在FVI1-010构建体中，因子VII的重链在scFc支架的环境下表达并且轻链被分开表达。使用pSYN-FVI 1-001(参见上文)，用引物对 FVI1-HC-Hind3-1ggKss-F/FVI1-HC-BspE1-R 进行 PCR 扩增。在 pSYN-FVI1-008 (参见上文)的 BspEI/Hindlll 位点克隆，生成 pSYN-FVI1-009。使用引物FVI1-LC-Notl-F/FVI1-LC-Xho1-R 由 pSYN-FVI1-003 (指 P0830) PCR 扩增 FVII 轻链并在 pSYN-FVI1-009 克隆以生成 pSYN-FVI1-010。引物FVI1-HC-BspE1-RAGGAGTTCCGGAGCTGGGCACGGTGGGCATGTGTGAGTTTTGTCGGATCCCCCGCCACCGGAACCTCCACCGCCTGATCCACCCCCACCTGATCCGCCGCCACCGGACCCACCTCCGCCGGAGCCACCGCCACCGGGAAATGGGGCTCGCAGGAGGFVI1-HC-Hind3-lggKss-f
ACTGACAAGCTTGCCGCCACCATGGAGACAGACACACTCCTGCTATGGGTACTGCTGCTCTGGGTTCCAGGTTCCACTGGTATTGTGGGGGGCAAGGTGTGCFVI1-LC-Not1-FACTGACGCGGCCGCGCCGCCACCATGGTCTCCCAGG
FVI1-LC-XhoI—RACTGACCTCGAGTTATCGGCCTTGGGGTTTGCTGGpSYN-FVI1-013 的克降在FVI1-013构建体中，轻链在scFc支架的环境下表达并且重链被分开表达。使用引物对FVI1-LC-接头-BamH1-R/Hindlll-Kozak-FVI1-F 由pSYN-FVI1-001 (指 P0830)PCR 扩增并在 pSYN-FVI1-Oll 的 BamHI/Hindlll 位点克隆，生成pSYN-FVI1-012。使用引物对 FVI1-HC-Notl-F/FVI1-HC-Xho1-R 由 pSYN-FVII_009PCR 扩增FVI1-HC 并在 pSYN-FVI1-012 亚克隆以生成 pSYN-FVI1-013。引物FVI1-LC-6X 接头-BamH1-RACTGACGGATCCCCCGCCACCGGAACCTCCACCGCCTGATCCACCCCCA
CCTGATCCGCCGCCACCGGACCCACCTCCGCCGGAGCCACCGCCACCTCGGCCTTGGGGTTTGCTGGCHindII I—Kozak-FVI1-FCGACAAGCTTGCCGCCACCATGGTCTCCCAGGCCCTCAGGFVI1-HC-Not1-F`
ACTGACGCGGCCGCGCCGCCACCATGGAGACAGACFVI1-HC-Xhol-RACTGACCTCGAGTTAGGGAAATGGGGCTCGCAGGAGpSYN-FVI1-018 的克降对于FVI1-018构建体，FVII的重链被表达为Fe融合蛋白，并且FVII的轻链被分开表达为单独的Fe融合蛋白。使用pSYN-FVI1-010 作为模板，用引物 FVI1-HC-Hind3-1ggKss-F/scFc-EcoR1-RPCR扩增HCFVI1-接头-Fe。在pBUDCE4的Hindlll/EcoRI位点亚克隆。这生成pSYN-FVI1-017。然后，用引物 FVI1-LC-`Notl-F/FC-XHO1-R 由 pSYN-FVII_013PCR 扩增并在FVI1-017 的 Xhol/Notl 位点亚克隆。这生成 PSYN-FVI1-018。引物scFc—EcoRl—RACTGACGAATTCTCATTTACCCGGAGACAGGGAGFe—XhoI—RAGCTCTCGAGTCATTTACCCGGAGACAGGG实施例8.在可活化的构建体表达方面的尝试FVI1-039.-040 的克降尝试制备几种构建体以生成构建体，其中因子VII可使用合适的切割位点(在这种实例下为DFTR因子XIa切割位点)在凝血位点体内活化。在scFc支架的环境下制备039构建体。该构建体包括FVII轻链、FXIa切割位点和在线性序列中具有I153V突变的FVII重链，所述线性序列与第一 Fe部分的N末端相连接。在scFc支架的环境下也制备了 040构建体。该构建体包括缺失R152的FVII轻链、FXIa切割位点和在线性序列中具有I153V突变的FVII重链，所述线性序列与第一 Fe部分的N末端相连接。DFTR切割序列是FIX中发现的天然FXIa序列。在FIX中，DFTR序列后面是缬氨酸，所以I152V突变被引入pSYN-FVI1-039、-040以增加FXIa切割效率。DNA 分子 Genscript-FVI1-039 和-040 的合成是外包的(Genscript)。将来自Genscript-FVI 1-039 和-040 的 Xbal/BsiWI 片段亚克隆到 pSYN-FVI1-Oll 的 Xbal/BsiWI位点以分别生成pSYN-FVI1-039和-040。实施例9.构建体的短暂转染为了表达构建体，在37°C /10%C02下HEK_293_F细胞在补充有维生素K3(只用于FVII 和 FIX 转染)(Sigma Aldrich, St.Louis, MO)的 Freestyle 培养基(Invitrogen)的悬浮液中生长至2 μ g/升(生长培养基)作为悬浮液细胞。通过以5x10s细胞/ml的细胞密度接种每3至4天传代培养细胞。在转染前24 个小时，在补充有 L0NG R3IGF-l(Sigma Aldrich, St.Louis, MO)至20 μ g/升(转染培养基)的生长培养基中以7xl05细胞/ml的密度接种细胞。在转染当天，用等于5%的待转染的细胞培养物的总体积的体积制备转染溶液。在转染溶液中，将DNA (终浓度20mg/L)添加到新制备的PEI在转染培养基中的溶液^Omg/L)。将该溶液涡旋30秒并室温下培养5分钟，然后直接添加到细胞培养物中。4小时后，体积等于补充有维生素K3的OptiCHO(Invitrogen)的细胞培养物体积，将L0NG R3IGF_1和200mM L-谷氨酰胺添加到细胞中。将细胞培养物如上所示地成长并每日对培养基样本取样评估蛋白表达。在收获当天，使细胞下旋并且将培养基在制剂中过滤，所述制剂通过蛋白质A pulldown/蛋白质印迹用于蛋白质纯化或蛋白质分析。实施例10.FVIIFc分子(除了 FVI1-028和FVI1-053)和FIXFc分子的蛋白纯化使用以下柱从条件培 养液中纯化FVIIFc分子:1)具有假亲和洗脱的阴离子交换色谱(例如，Q琼脂糖4FF(GE Healthcare)，接着用不同水平的CaCl2洗脱以选择性洗脱活性最大的种类)，然后2) ShFcRn (可溶性人FcRn)亲和(具有琼脂糖4FF小珠的NHS-偶联的shFcRn)色谱，低pH(例如，ρΗ6.2)时结合含有蛋白质的Fe且中性ρΗ(例如，ρΗ8.0)时洗脱。在某些情况下，包括利用用NaCl洗脱的阳离子交换色谱法的额外步骤。这些纯化步骤使用本领域技术人员已知的标准方法以生成通过SEC分析和SDS-PAGE测得的纯度>95%的纯化的蛋白质。如先前在美国专利7，566，565中所述地纯化FIXFc蛋白。实施例11.FVI1-028和FVI1-053的蛋白纯化使用以下柱从条件培养基纯化FVI1-028和FVI1-053:1)疏水作用色谱(例如，Phenyl FF (high sub) (GE Healthcare)),然后2)具有盐洗脱的阴离子/阳离子交换色谱。这些纯化步骤使用本领域技术人员已知的标准方法以生成通过SEC分析和SDS-PAGE测得的纯度>95%的纯化的蛋白质。实施例12.FIX-090的纯化通过两步色谱过程纯化FIX-090，首先使用具有抗GLA结构域抗体的免疫亲和层析步骤，后面是使用与上述FIXFc蛋白质相似的假亲和洗脱的阴离子交换色谱。这些纯化步骤使用本领域技术人员已知的标准方法以生成通过SEC分析和SDS-PAGE测得的纯度>95%的纯化的蛋白质。实施例13.FVIIIFc蛋白质的纯化
使用两个或三个柱纯化过程，从净化的和化学确定的收获培养基中纯化FVIIIFc蛋白质，包括FVII1-特异性亲和纯化步骤(McCue2009)以及之后的阴离子交换与标准NaCl洗脱和/或ShFcRn (可溶性人FcRn)亲和(具有琼脂糖4FF小珠的NHS-偶联的shFcRn)色谱(低PH(例如，pH6.2)时结合含有蛋白质的Fe且中性pH(例如，pH8.0)时洗脱)的组合。这些纯化步骤使用本领域技术人员已知的标准方法以生成通过SEC分析和SDS-PAGE测得的纯度>95%的纯化的蛋白质。实施例14.FVII构建体的活化收集由含有FVIIFc的FcRn色谱柱洗脱的片段，且总蛋白浓度为4mg/ml。将CaCl2浓度提高到5mM，且在4°C下培养样品24至48小时直到至少80%的FVIIFc被活化。通过SDS PAGE评估活化的程度。(图10)实施例15.FVIIa活性测定，可溶性组织因子法通过可溶性组织因子法测定FVIIaFc变体的比活。不同于脂化的全长组织因子，可溶性组织因子(组织因子的胞外部分)不能将FVII活化为FVIIa，但其可作为因子X通过FVIIa转化为因子Xa的活化剂。为了测定FVIIaFc变体的比活，按照制备商的建议使用A STAC LOT FVI1-rTF 试剂盒(Diagnostica Stago, Asnieres, France)。表 I 汇总了数据并且示出所有变体的可比较的比活。表1.基于可溶性组织因子方法的FVIIaFc变体的比活
权利要求
1.一种嵌合凝血因子，其包含i)选自FVI1、FIX和FX的凝血因子和ii)与血小板结合的靶向部分及任选地，iii)所述凝血因子与所述靶向部分之间的间隔基部分。
2.根据权利要求1所述的嵌合凝血因子，其包含由式ABC表示的结构，其中A为凝血因子；其中B为间隔基部分；且其中C为至少一个与血小板结合的靶向部分。
3.根据权利要求2所述的嵌合凝血因子，其包含由选自ABC、CBA的式表示的从氨基端到羧基端的结构。
4.根据权利要求1所述的嵌合凝血因子，其中所述嵌合凝血因子在血小板存在下显示出与缺少至少一个靶向部分的适当的对照相比增加的凝血酶生成。
5.根据权利要求1所述的嵌合凝血因子，还包含支架部分和任选地第二间隔基部分。
6.根据权利要求5所述的嵌合凝血因子，还包含D和E，其中D为间隔基部分；且E为支架部分，并且其中所述嵌合凝血因子包含由选自AB⑶E、ADEBC, EDABC, CBADE, EDCBA和CBEDA的式表示的从氨基端到羧基端的结构。
7.根据权利要求6所述的嵌合凝血因子，其中E为包含第一Fe部分Fl和第二 Fe部分F2的二聚体Fe区。
8.根据权利要求7所述的嵌合凝血因子，其中所述凝血因子被表达为包含在两个Fe部分之间插入的可切割scFc(cscFc)接头的多肽,其中所述cscFc接头与至少一个引起所述cscFc多肽接头切割的酶切位点相邻。
9.根据权利要求8所述的嵌合凝血因子，其中所述cscFc接头与至少一个引起所述cscFc接头切割的酶切位点相邻。
10.根据权利要 求9所述的嵌合凝血因子，其中所述至少一个酶切位点为细胞内加工位点。
11.根据权利要求9所述的嵌合凝血因子，其中所述多肽接头的两侧为两个酶切位点，所述酶切位点由相同的或不同的酶识别。
12.根据权利要求9所述的嵌合凝血因子，其中所述多肽接头的长度为约10个至约50个氨基酸。
13.根据权利要求9所述的嵌合凝血因子，其中所述多肽接头的长度为约20个至约30个氨基酸。
14.根据权利要求9所述的嵌合凝血因子，其中所述多肽接头包含gly/ser肽。
15.根据权利要求14所述的嵌合凝血因子，其中所述gly/ser肽具有式(Gly4Ser)n或Ser(Gly4Ser)n，其中 n 为选自 1、2、3、4、5、6、7、8、9 和 10 的正整数。
16.根据权利要求15所述的嵌合凝血因子，其中所述(Gly4Ser)n接头选自(Gly4Ser) 6> Ser (Gly4Ser) 6> (Gly4Ser) 4 和 Ser (Gly4Ser) 4。
17.根据权利要求8所述的嵌合凝血因子，其中所述凝血因子包含两条多肽链。
18.根据权利要求7所述的嵌合凝血因子，其中所述嵌合凝血因子具有选自以下的结构:A通过间隔基部分与Fl连接且C与F2连接；A通过间隔基部分与Fl连接且C通过间隔基部分与F2连接；A与Fl连接且C通过间隔基部分与F2连接；A通过间隔基部分与Fl连接且C通过间隔基部分与F2连接。
19.根据权利要求18所述的嵌合凝血因子，其包括两条多肽，其中第一条多肽包含部分 A B FUA B FUA B FUA B FlD C 且第二条多肽包含部分 C F2、C D F2、F2D C、F2D C，其中所述两条多肽链形成Fe区。
20.根据权利要求7所述的嵌合凝血因子，其中所述靶向部分与所述Fe区的所述多肽链中的至少一条融合。
21.根据权利要求7所述的嵌合凝血因子，其中所述靶向部分直接与Fl和F2的至少一个融合。
22.根据权利要求7所述的嵌合凝血因子，其中所述靶向部分通过间隔基部分与Fl和F2的至少一个融合。
23.根据权利要求7所述的嵌合凝血因子，其中所述靶向部分通过可切割接头与Fl和F2的至少一个融合。
24.根据权利 要求1所述的嵌合凝血因子，其中所述靶向部分选自抗体分子、抗体分子的抗原结合片段、scFv分子、受体的受体结合部分、肽。
25.根据权利要求1、2、5或7所述的嵌合凝血因子，其中所述靶向部分与静息血小板结
26.根据权利要求1、2、5或7所述的嵌合凝血因子，其中所述靶向部分选择性地与活化血小板结合。
27.根据权利要求25所述的嵌合凝血因子，其中所述靶向部分选择性地与选自以下的靶标结合:GPIba、GPVIdP GPIIb/IIIa的非活性形式。
28.根据权利要求26所述的嵌合凝血因子，其中所述靶向部分选择性地与选自以下的靶标结合:GPIIb/IIIa 的活性形式、P 选择蛋白、GMP-33、LAMP-1、LAMP-2、CD40L 和 LOX-1。
29.根据权利要求25所述的嵌合凝血因子，其中所述靶向部分与GPIb复合物结合。
30.根据权利要求25所述的嵌合凝血因子，其中所述靶向部分是选自PS4、OSl和0S2的肽。
31.根据权利要求25所述的嵌合凝血因子，其中所述靶向部分包含来自抗体的抗体可变区，其选自SCE5、MB9和AP3。
32.根据权利要求1、2、5或7所述的嵌合凝血因子，其中所述凝血因子是因子VII。
33.根据权利要求1、2、5或7所述的嵌合凝血因子，其中所述凝血因子是因子VII的高比活变体。
34.根据权利要求1、2、5或7所述的嵌合凝血因子，其中所述凝血因子是因子IX。
35.根据权利要求1、2、5或7所述的嵌合凝血因子，其中所述凝血因子是因子IX的高比活变体。
36.根据权利要求1、2、5或7所述的嵌合凝血因子，其中所述凝血因子是因子X。
37.根据权利要求1、3、4或5所述的嵌合凝血因子，其中所述凝血因子是因子X的高比活变体。
38.根据权利要求8所述的嵌合凝血因子，其中所述凝血因子由细胞以活性形式分泌。
39.根据权利要求1所述的嵌合凝血因子，其中所述凝血因子在体内活化。
40.根据权利要求39所述的嵌合凝血因子，其中所述嵌合凝血因子包含非天然地存在于所述凝血因子中的异源性酶切位点。
41.根据权利要求40所述的嵌合凝血因子，其中所述酶切位点与所述凝血因子的重链部分的氨基端基因融合。
42.根据权利要求5所述的嵌合凝血因子，其中所述支架部分是蛋白质分子，其增加所述凝血因子的流体动力学半径。
43.根据权利要求42所述的嵌合凝血因子，其中所述支架部分，如果存在，选自白蛋白和 XTEN*、
44.一种包含FVII的多肽，其中FVII包含由所述凝血级联的组分活化的异源性酶切位点。
45.根据权利要求44所述的多肽，其中所述多肽包含支架部分和任选地间隔基部分。
46.根据权利要求45所述的嵌合凝血因子，其中所述支架部分是包含第一Fe部分Fl和第二 Fe部分F2的二聚体Fe区。
47.根据权利要求44所述的嵌合凝血因子，其中所述凝血因子包含两条多肽链。
48.根据权利要求44所述的嵌合凝血因子，其中所述嵌合凝血因子具有选自以下的结构:所述凝血因子通过间隔基部分与所述第一 Fe部分连接；所述凝血因子通过间隔基部分与所述第二 Fe部分连接；所述凝血因子直接与Fl连接；且所述凝血因子直接与F2连接。
49.根据权利要求47所述的嵌合凝血因子，还包含靶向部分C。
50.根据权利要求47所述的嵌合凝血因子，其中所述嵌合凝血因子被合成为包含cscFc接头的单个多肽链。
51.根据权利要求49所述的嵌合凝血因子，其中所述cscFc接头与至少一个引起所述接头切割的酶切位点相 邻。
52.根据权利要求50所述的嵌合凝血因子，其中所述至少一个酶切位点为细胞内加工位点。
53.根据权利要求50所述的嵌合凝血因子，其中所述cscFc接头的两侧具有两个酶切位点，所述酶切位点由相同的或不同的酶识别。
54.根据权利要求49所述的嵌合凝血因子，其中所述cscFc接头的长度为约10个至约50个氨基酸。
55.根据权利要求49所述的嵌合凝血因子，其中所述cscFc接头的长度为约20个至约30个氨基酸。
56.根据权利要求49所述的嵌合凝血因子，其中所述cscFc接头包含gly/ser肽。
57.根据权利要求56所述的嵌合凝血因子，其中所述gly/ser肽具有式(Gly4Ser)n或Ser(Gly4Ser)n，其中 n 为选自 1、2、3、4、5、6、7、8、9 和 10 的正整数。
58.根据权利要求56所述的嵌合凝血因子，其中所述(Gly4Ser)n接头选自(Gly4Ser) 6> Ser (Gly4Ser) 6> (Gly4Ser) 4 和 Ser (Gly4Ser) 4。
59.根据权利要求45所述的嵌合凝血因子，其中所述凝血因子是因子VII的高比活变体。
60.根据权利要求44所述的嵌合凝血因子，其中非天然存在于所述凝血因子中的异源性酶切位点在血块形成的位点被切割。
61.根据权利要求44所述的嵌合凝血因子，其中所述切割位点选自因子XIa切割位点、因子Xa切割位点和凝血酶切割位点。
62.根据权利要求59所述的嵌合凝血因子，其中所述酶切位点与所述凝血因子的重链部分的氨基端基因融合。
63.根据权利要求48所述的嵌合凝血因子，其中所述靶向部分与静息血小板结合。
64.根据权利要求48所述的嵌合凝血因子，其中所述靶向部分选择性地与活化血小板彡口口
65.根据权利要求63所述的嵌合凝血因子，其中所述靶向部分选择性地与选自以下的靶标结合:GPIba、GPVIdP GPIIb/IIIa的非活性形式。
66.根据权利要求64所述的嵌合凝血因子，其中所述靶向部分选择性地与选自以下的靶标结合:GPIIb/IIIa 的活性形式、P 选择蛋白、GMP-33、LAMP-1、LAMP-2、CD40L 和 LOX-1。
67.根据权利要求64所述的嵌合凝血因子，其中所述支架部分是蛋白质分子，其增加所述凝血因子的流体动力学半径。
68.根据权利要求67所述的嵌合凝血因子，其中所述支架部分，如果存在，选自白蛋白^PXTFNn,
69.根据权利要求44所述的嵌合凝血因子，其包括选自ABC、CBA、ABCDE、ADEBC、EDABC、CBADE, EDCBA, CBE DA的从氨基端至羧基端部分的线性序列，其中A为可活化的凝血因子，B不存在或为接头，C为靶向部分，D不存在或为接头,且E为支架部分。
70.根据权利要求44所述的嵌合凝血因子，其中所述凝血因子包含凝血因子的轻链和重链且每个所述轻链和重链被表达成单独的多肽链。
71.—种核酸分子,其编码根据权利要求1、2、5、7、44、45、45和58中任一项所述的嵌合凝血因子。
72.根据权利要求71所述的核酸分子，其中所述核酸分子存在于载体中。
73.根据权利要求72所述的载体，其中所述载体还包括编码酶的核苷酸序列，所述酶切割至少一个酶切位点。
74.—种宿主细胞，其包含根据权利要求72所述的表达载体。
75.—种宿主细胞，其包含根据权利要求72所述的表达载体，其中所述宿主细胞表达能够细胞内加工的酶。
76.根据权利要求75所述的宿主细胞，其中所述酶对于所述细胞是内源性的。
77.根据权利要求75所述的宿主细胞，其中所述酶对于所述细胞是异源性的。
78.一种用于制备嵌合凝血因子的方法，其包含在培养物中培养根据权利要求76或77所述的宿主细胞并从所述培养基中回收所述嵌合凝血因子。
79.—种包含两条多肽链的加工的、异源二聚体多肽，其中所述加工的、异源二聚体多肽通过在于细胞培养基中培养的细胞中表达根据权利要求78所述的载体并从所述培养基中分离所述成熟的、异源二聚体多肽来制备。
80.一种组合物，其包含根据权利要求1、2、5、7、44、45、48和58中任一项所述的嵌合凝血因子和药学上可接受的载体。
81.—种组合物，其包含根据权利要求71所述的核酸分子和药学上可接受的载体。
82.一种用于在受试者中改善止血的方法，包括施用根据权利要求80或81所述的组合物。
全文摘要
描述了嵌合凝血因子，和用于制备嵌合凝血因子的方法，以及使用这些凝血因子改善止血的方法，所述嵌合凝血因子使治疗剂定位在凝血部位(例如，通过被靶向到血小板或可在凝血部分被活化)，具有降低的清除率、具有提高的可制备性、具有降低的凝血活性、具有增强的活性或具有一种以上的这些特征。
文档编号A61K38/36GK103180439SQ201180042449
公开日2013年6月26日 申请日期2011年7月11日 优先权日2010年7月9日
发明者乔·萨拉斯, 罗伯特·彼得斯, 艾伦·比通蒂 申请人:比奥根艾迪克依蒙菲利亚公司