专利名称：用于纯化聚乙二醇化的促红细胞生成素的方法
技术领域：
本文报道了一种使用在SP Sephacryl S500HR柱上的线性梯度洗脱方法来纯化聚乙二醇化的促红细胞生成素的方法。
背景技术：
蛋白在当今的医疗产品中具有重要作用。对于人应用而言，每种治疗性蛋白必须符合独特的标准。为了确保生物药物对人类的安全性，尤其必须除去生产过程中累积的副产物。为了满足管理规范，在生产过程之后必须进行一个或多个纯化步骤。其中，纯度、处理量和收率在确定适宜的纯化方法中起重要作用。已经报道了下述治疗性蛋白的缀合物:例如，聚乙二醇(PEG)和白介素-6 (EP0442724)，PEG和促红细胞生成素(W001/02017)，包含内皮生长抑素和免疫球蛋白的嵌合分子(US2005/008649)，基于分泌型抗体的融合蛋白(US2002/147311)，包含白蛋白的融合多肽(US2005/0100991 ;人血清白蛋白US5，876，969)，聚乙二醇化的多肽(US2005/0114037)和促红细胞生成素融合物。Necina, R.,等人(Biotechnol.Bioeng.60 (1998) 689-698)报道了用表现出高电荷密度的离子交换介质从细胞培养物上清液中直接捕获人单克隆抗体。在W089/05157中，报道了一种通过对细胞培养基直接进行阳离子交换处理来纯化免疫球蛋白产物的方法。Danielsson, A.，等人，J.1mmun.Meth.115 (1988) 79-88 描述了从小鼠腹水中一步纯化单克隆IgG抗体。在W02004/024866中报道了一种通过离子交换色谱法来纯化多肽的方法，其中使用梯度洗脱将目标多肽与一种或多种污染物拆分开。在EP0530447中，报道了一种通过三个色谱步骤的组合来纯化IgG单克隆抗体的方法。Yu，G.，等人，Process Biotechnol.42 (2007) 971-977报道了单聚乙二醇化的白介素-1受体拮抗剂的容易的纯化。Wang，H.，等人，P印tides26 (2005) 1213-1218报道了通过两步阳离子交换色谱法来纯化在大肠杆菌(E.coli)中表达的hTFF3。Yun, Q.，等人(Yun，Q.，等人，J.Biotechnol.118(2005)67-74)报道了通过两个连续的离子交换色谱步骤来纯化聚乙二醇化的rhG-CSF
发明内容
本文报道了一种通过阳离子交换色谱法从反应副产物或未反应的原料中纯化蛋白缀合物的方法，所述蛋白缀合物包含促红细胞生成素和单个聚(乙二醇)残基。已经发现，通过采用阳离子交换色谱材料SP Sephacryl S500HR和线性梯度洗脱,可以在单个步骤中以高纯度和收率获得包含促红细胞生成素和单个聚(乙二醇)残基的缀合蛋白，其中在柱中已经预先施加了具有确定电导率的缓冲溶液。因而，在一个方面，本文报道了一种获得包含促红细胞生成素和单个聚(乙二醇)残基的融合蛋白的方法，所述方法包括下述步骤:a)将具有约21mS/cm的电导率的溶液施加于包含SP Sephacryl S500HR色谱材料的色谱柱上，b)将一种溶液施加于a)的柱上，所述溶液包含游离的促红细胞生成素以及促红细胞生成素和聚(乙二醇)的融合蛋白(其中每个促红细胞生成素分子具有一个或多个聚(乙二醇)残基)的混合物，c)将具有约21mS/cm的电导率的溶液施加于所述柱，并由此回收包含2个或更多个聚(乙二醇)残基的融合蛋白，d)向所述柱施加一种溶液，所述溶液具有连续地且线性地递增的一直到至少60mS/cm的最终值的电导率，并由此分别回收包含促红细胞生成素和单个聚(乙二醇)残基的融合蛋白和游离的促红细胞生成素，其中首先获得包含促红细胞生成素和单个聚(乙二醇)残基的融合蛋白。在一个实施方案中，所述具有约21mS/cm的电导率的溶液是pH值为pH2.5至PH3.5的溶液。在一个实施方案中，所述具有约21mS/cm的电导率的溶液是pH值为pH2.5至pH3.5的磷酸(盐)缓冲溶液。在一个实施方案中，在步骤d)中施加的溶液的pH值为pH2.5至pH3.5。在一个实施方案中，施加具有连续地且线性地递增的电导率的溶液是一直到约70.0mS/cm的最终电 导率值。在一个实施方案中，具有连续地且线性地递增的电导率的溶液是具有连续地且线性地递增的氯化钠浓度的溶液。在一个实施方案中，所述促红细胞生成素是人促红细胞生成素。在一个实施方案中，所述人促红细胞生成素具有SEQ ID N0:01或SEQ ID NO:02的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述单个聚(乙二醇)残基具有20kDa至40kDa的分子量。在一个实施方案中，以将Img直至4mg融合蛋白施加于Iml色谱材料上的方式，将包含游离的促红细胞生成素和促红细胞生成素与聚(乙二醇)的融合蛋白(其中每个促红细胞生成素分子具有一个或多个聚(乙二醇)残基)的混合物的溶液施加于所述色谱材料上。发明描述本文报道了一种使用梯度洗脱方法来纯化蛋白的方法，所述蛋白包含一个促红细胞生成素分子和一个聚(乙二醇)残基，其中所述梯度是在SPS^hacryl S500HR柱上的线性电导率梯度，其中在施加包含所述蛋白的溶液之前，已经将具有确定电导率的溶液施加在色谱柱上。本领域技术人员已知一般的色谱方法和它们的应用。参见例如，Heftmann，E.,(编)，Chromatography,第 5 版，Part A !Fundamentals and Techniques, ElsevierScience Publishing Company,纽约(1992) ；Deyl, Z.,(编)，Advanced Chromatographicand Electromigration Methods in Biosciences, Elsevier Science BV, Amsterdam，The Netherlands (1998) ;Poole，C.F.，和 Poole，S.K.，Chromatography Today, ElsevierScience Publishing Company，纽约(1991) ;Scopes，Protein Purification:Principlesand Practice，Springer Verlag(1982) ;Sambrook，J.，等人，(编)，Molecular Cloning:A Laboratory Manual，第 2 片反，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor, N.Y., (1989);或 Ausubel，F.M.，等人，(编)，Current Protocols in MolecularBiology, John ffiley&Sons, Inc.,纽约(1987-1994)。术语“施加于”表示纯化方法的一个部分步骤，其中使溶液与色谱材料接触。这表示:a)将溶液加入含有色谱材料的色谱装置中，或b)将色谱材料加入溶液中。在a)的情况下，溶液通过所述装置，使色谱材料与溶液中含有的物质相互作用。取决于条件(例如pH、电导率、盐浓度、温度和/或流速)，溶液中的一些物质与色谱材料结合，从而可以在进一步的步骤中从色谱材料回收。留在溶液中的物质可在穿流液(flow-through)中找到。“穿流液”表示穿过所述装置后获得的溶液，其可以是施加的溶液或缓冲溶液，所述施加的溶液或缓冲溶液用于洗涤柱或者用于造成与色谱材料结合的物质的洗脱。在一个实施方案中，所述装置是柱或盒。在b)的情况下，可以将色谱材料(例如作为固体)加入例如含有要纯化的目标物质的溶液中，从而允许色谱材料和溶液中的物质之间的相互作用。在相互作用以后,通过例如过滤来除去色谱材料,并且也随之从溶液中除去与色谱材料结合的物质,而未与色谱材料结合的物质保留在溶液中。术语“结合和洗脱模式”表示色谱步骤的一种工作模式，其中将含有要纯化的目标物质的溶液施加于色谱材料上，由此使目标物质与色谱材料结合。因而，目标物质保留在色谱材料上，而非目标物质则·用穿流液或上清液除去。然后在第二步中，用洗脱溶液从色谱材料回收目标物质。在一个实施方案中，在本文中报道的方法以结合和洗脱模式工作。用于本文报道的方法中的溶液是粗制溶液或缓冲溶液。术语“缓冲溶液”表示这样的溶液:其中由酸性或碱性物质的添加或释放引起的PH变化会被溶解的缓冲物质拉平。可以使用具有这种性质的任何缓冲物质。通常，使用药学上可接受的缓冲物质。在一个实施方案中，所述缓冲溶液选自:由磷酸和/或其盐组成的磷酸(盐)缓冲溶液，或由乙酸及其盐组成的乙酸(盐)缓冲溶液，或由柠檬酸和/或其盐组成的柠檬酸(盐)缓冲溶液，或吗啉缓冲溶液，或2- (N-吗啉代)乙磺酸缓冲溶液，或组氨酸缓冲溶液，或甘氨酸缓冲溶液，或三(羟甲基)氨基甲烷(TRIS)缓冲溶液。在一个实施方案中，所述缓冲溶液选自磷酸(盐)缓冲溶液、或乙酸(盐)缓冲溶液、或柠檬酸(盐)缓冲溶液、或组氨酸缓冲溶液。任选地，所述缓冲溶液可以包含额外的盐，例如氯化钠、硫酸钠、氯化钾、硫酸钾、柠檬酸钠或柠檬酸钾。术语“连续洗脱”和“连续洗脱方法”在本申请中可互换地使用，表示这样的方法:其中造成洗脱(即从色谱材料回收结合的化合物)的溶液的电导率连续地变化(即升高或降低)，即通过一系列小阶梯来改变浓度，每个小阶梯不大于造成洗脱的物质的浓度的2%或I %的变化。在该“连续洗脱”中，一个或多个条件(例如pH、离子强度、盐浓度和/或色谱流速)可以线性地或指数地或渐近地变化。在一个实施方案中，所述变化是线性的。术语“离子交换色谱材料”表示固定的高分子量基质，其带有共价结合的带电荷的取代基，在离子交换色谱法中用作固定相。为了达到整体电荷中性，非共价结合的抗衡离子与之结合。“离子交换色谱材料”具有将其非共价结合的抗衡离子交换成周围溶液中的类似的带电荷的离子的能力。根据其可交换的抗衡离子的电荷，“离子交换树脂”被称作阳离子交换树脂或阴离子交换树脂。根据带电荷的基团(取代基)的性质，“离子交换树脂”被称作:例如在阳离子交换树脂的情况下，磺酸树脂(S)、或磺丙基树脂(SP)、或羧甲基树脂(CM) o本领域技术人员熟知用于将氨基酸序列(例如多肽的氨基酸序列)转化成编码该氨基酸序列的对应核酸序列的步骤和方法。因此，通过它的由各个核苷酸组成的核酸序列来表征核酸，同样通过由其编码的多肽的氨基酸序列来表征核酸。术语“聚(乙二醇)”或“聚(乙二醇)残基”表示，含有聚(乙二醇)作为基本部分的非蛋白性的残基。这样的聚(乙二醇)残基可以含有结合反应所必需的其它化学基团，其源自分子的化学合成，或者是分子的多个部分的最佳距离的隔离物。这些其它化学基团不用于计算聚(乙二醇)残基的分子量。另外，这样的聚(乙二醇)残基可以由一个或多个聚(乙二醇)链组成，所述链共价地连接在一起。具有超过一个PEG链的聚(乙二醇)残基称作多臂或支链聚(乙二醇)残基。例如，通过向不同的多元醇(包括甘油、季戊四醇和山梨醇)添加聚氧化乙烯，可以制备支链聚(乙二醇)残基。支链聚(乙二醇)残基在例如EP0473084、US5, 932，462中报道。在一个实施方案中，所述聚(乙二醇)残基具有20kDa至35kDa的分子量，且是直链聚(乙二醇)残基。在另一个实施方案中，所述聚(乙二醇)残基是具有35kDa至40kDa的分子量的支链聚(乙二醇)残基。术语“促红细胞生成素与聚(乙二醇)残基的融合”表示，在促红细胞生成素的N-端或内部赖氨酸残基处化学引入的聚(乙二醇)残基的共价连接。融合会产生蛋白缀合物，其包含一个促红细胞生成素分子和一个或多个聚(乙二醇)残基。所述融合方法也称作聚乙二醇化，且其产物称作聚乙二醇化的促红细胞生成素。多肽与聚(乙二醇)残基的融合/缀合是在现有技术中广泛已知的，且在例如Veronese, F.M.,Biomaterials22 (2001)405-417中综述。使用不同的官能团，可以连接聚(乙二醇)残基。可以使用具有不同分子量、不同形式、以及不同连接基团的聚(乙二醇)(也参见Francis，G.E.,等人，Int.J.Hematol.68(1998) 1-18 ；Delgado, C.，等人，Crit.Rev.Ther.DrugCarrier Systems9 (1992) 249-304)。促红细胞生成素和聚(乙二醇)残基的融合可以在含有聚(乙二醇)残基试剂的水溶液中进行，参见例如W000/44785。所述融合还可以在固相上 进行，参见 Lu，Y.，等人，Reactive Polymers22 (1994) 221-229。根据 W094/01451，还可以产生非随机地N-端融合。术语“使促红细胞生成素与聚(乙二醇)融合”和“聚乙二醇化”表示，在聚(乙二醇)残基与促红细胞生成素的N-端和/或内部赖氨酸残基之间形成共价键，以便获得蛋白缀合物，所述蛋白缀合物包含一个促红细胞生成素分子和一个聚(乙二醇)残基。在一个实施方案中，使用分子量在5kDa至40kDa之间的NHS-活化的直链或支链PEG分子，在水溶液中进行促红细胞生成素的聚乙二醇化。本申请中所用的术语“在适于结合的条件下”及其语法上的等价表述表示，目标物质(例如聚乙二醇化的促红细胞生成素)在与固定相(例如离子交换材料)接触时与之结合。这不一定表示100%的目标物质与固定相结合，而表示基本上100%的目标物质与固定相结合，即至少50%的目标物质与固定相结合、至少75%的目标物质与固定相结合、至少85%的目标物质与固定相结合、或者95%以上目标物质与固定相结合。促红细胞生成素和聚(乙二醇)的化学融合或缀合通常产生不同化合物的混合物，所述化合物例如多聚乙二醇化的促红细胞生成素、单聚乙二醇化的促红细胞生成素、未聚乙二醇化的促红细胞生成素、活化的PEG酯的水解产物、以及促红细胞生成素本身的水解产物。为了获得基本上同质形式的单聚乙二醇化的促红细胞生成素，必须对这些物质进行分离。
因此，本文报道的一个方面是，提供一种用于生产基本上同质形式的蛋白缀合物的方法，所述蛋白缀合物包含一个促红细胞生成素分子和单个聚(乙二醇)残基，其中所述方法包括下述步骤:a)使用具有20kDa至40kDa的分子量的活化聚(乙二醇)酯，使促红细胞生成素
与聚(乙二醇)缀合，b)将在步骤a)中获得的缀合物施加于SP Sephacryl S500HR色谱材料，所述色谱材料已经施加了具有约21mS/cm的电导率的溶液，c)通过线性电导率梯度洗脱，回收基本上同质形式的包含一个促红细胞生成素分子和单个聚(乙二醇)残基的蛋白(单聚乙二醇化的促红细胞生成素)，并由此生产包含促红细胞生成素和单个聚(乙二醇)残基的蛋白缀合物。在一个实施方案中，所述SP Sephacryl S500HR色谱材料是在色谱柱中。该方法特别适用于纯化聚乙二醇化的重组促红细胞生成素，后者是糖基化的，即其已由哺乳动物细胞生产，在一个实施方案中，由CHO细胞、或HEK293细胞、或BHK细胞、或Per.C6 细胞、或HeLa细胞生产，并且随后被化学地聚乙二醇化。在所述方法的第一步中，促红细胞生成素被聚乙二醇化。在聚乙二醇化反应中所用的聚(乙二醇)(PEG)聚合物分子具有约20kDa至40kDa的分子量(本文使用的术语“分子量”应当被理解为PEG的平均分子量，因为PEG作为聚合化合物不是以一种确定的分子量被获得的，而事实上是具有一个分子量分布；术语“约”表示，在所述的PEG制备物中，一些分子的重量大于标示分子量，一些分子的重量小于标示分子量，即术语“约”是指这样的分子量分布:其中95%的PEG分子具有在标不分子量+/-10%以内的分子量。例如，30kDa的分子量表示27kDa至33kDa的范围)。 术语“促红细胞生成素”和它的缩写“EP0”是指，具有SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的氨基酸序列的蛋白，或者基本上与之同源的蛋白或多肽，其生物学性质与刺激红细胞产生和刺激骨髓中定向红系祖细胞的分裂和分化有关。可以如下制备重组促红细胞生成素:通过重组DNA技术或通过内源基因活化(也就是说，通过内源性基因活化，表达促红细胞生成素糖蛋白)，在真核细胞中(例如在CHO细胞、或BHK细胞、或HeLa细胞中)表达，参见例如 US5, 733，761、US5, 641，670、US5, 733，746、W093/09222、W094/12650、W095/31560、W090/11354、W091/06667和W091/09955。在一个实施方案中，所述促红细胞生成素是人EPO0在一个实施方案中，所述人促红细胞生成素具有在SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2中描述的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述人促红细胞生成素具有在SEQ ID N0:1中描述的氨基酸序列。术语“促红细胞生成素”也表示，SEQ ID NO:1或SEQ ID N0:2的蛋白的变体，其中一个或多个氨基酸残基已经被改变、缺失或插入，并且其具有与未修饰的蛋白(例如在EP1064951或US6，583，272中所报道的那些)可比较的生物学活性。变体可以具有含有1-6个额外糖基化位点的人促红细胞生成素的氨基酸序列。通过本领域已知的多种测定法，可以确定聚乙二醇化的促红细胞生成素的比活性。纯化的聚乙二醇化的促红细胞生成素的生物活性会使得，通过给人患者注射施用所述蛋白，导致与未注射的或对照组的受试者相比，骨髓细胞会增加网织红细胞和红细胞的产生。通过Bristow,A.,PharmeuropaSpec.1ssue Biologicals BRP Erythropoietin Bio97_2 (1997) 31-48 的方法，可以试验根据在本文中报道的方法获得和纯化的聚乙二醇化的促红细胞生成素的生物活性。
通过将适当的修饰引入编码促红细胞生成素的核苷酸序列中，或通过肽合成，可以制备促红细胞生成素的氨基酸序列变体。这样的修饰包括，例如，在促红细胞生成素的氨基酸序列内删除残基、和/或插入残基、和/或置换残基。可以进行删除、插入和置换的任意组合，以获得最终的构建体，前提条件是，最终的构建体具有与人促红细胞生成素可比较的生物活性。保守氨基酸置换显示在表I中“优选置换”的标题下。更多的实质变化提供在表I中，在“示例性置换”的标题下，并在下面参照氨基酸侧链类别进行了描述。可以将氨基酸置换引入人促红细胞生成素中，并针对人促红细胞生成素的生物活性的保留来筛选产物。表I
权利要求
1.一种用于获得蛋白的方法，所述蛋白包含促红细胞生成素和单个聚(乙二醇)残基，所述方法包括下述步骤: a)将溶液施加于包含SPSephacryl S500HR色谱材料的柱，所述溶液包含促红细胞生成素以及促红细胞生成素与聚(乙二醇)的缀合物的混合物，在所述缀合物中每个促红细胞生成素分子具有一个或多个聚(乙二醇)残基，所述柱已经施加了具有约21mS/cm的电导率的溶液， b)将具有约21mS/cm的电导率的溶液施加于所述柱，由此回收游离的聚(乙二醇)和包含2个或更多个聚(乙二醇)残基的蛋白， c)向所述柱施加溶液，并由此分别回收包含促红细胞生成素和单个聚(乙二醇)残基的蛋白和促红细胞生成素，其中首先回收包含促红细胞生成素和单个聚(乙二醇)残基的蛋白，所述溶液具有线性地递增的一直到约62.5mS/cm的最终值的电导率。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述具有约21mS/cm的电导率的溶液是pH值为pH2.5至pH3.5的溶液。
3.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述具有约21mS/cm的电导率的溶液是PH值为pH2.5至pH3.5的磷酸(盐)缓冲溶液。
4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，未将所述包含促红细胞生成素以及促红细胞生成素与聚(乙二醇)的缀合物的混合物的溶液调至约21mS/cm的电导率，在所述缀合物中每个促红细胞生成素分子具有一个或多个聚(乙二醇)残基。
5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，具有线性地递增的电导率的所述溶液是具有线性地递增的氯化钠 浓度的溶液。
6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，具有线性地递增的电导率的所述溶液的PH值为pH2.3至pH3.5。
7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述促红细胞生成素是人促红细胞生成素。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述人促红细胞生成素具有SEQID NO:Ol或SEQ ID NO:02的氨基酸序列。
9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述单个聚(乙二醇)残基具有20kDa至40kDa的分子量。
全文摘要
本文报道了一种通过阳离子交换色谱法从反应副产物或未反应的原料中纯化蛋白的方法，所述蛋白包含促红细胞生成素和单个聚(乙二醇)残基。已经发现，通过采用调节至21mS/cm的电导率的阳离子交换SP SephacrylS500HR色谱材料和线性梯度洗脱，可以在单个步骤中以高纯度和收率获得促红细胞生成素和单个聚(乙二醇)残基的融合蛋白。
文档编号A61K47/48GK103118708SQ201180044060
公开日2013年5月22日 申请日期2011年9月13日 优先权日2010年9月14日
发明者罗伯托·法尔肯施泰因, 沃尔夫冈·克恩莱因, 沃尔夫冈·库内, 哈特穆特·舒里希(死亡) 申请人:霍夫曼-拉罗奇有限公司