含2-酰基-溶血磷脂酰丝氨酸的组合物及其制造方法

专利名称：含2-酰基-溶血磷脂酰丝氨酸的组合物及其制造方法
技术领域：
本发明涉及含2-酰基-溶血磷脂酰丝氨酸的组合物及其制造方法。
背景技术：
在磷脂中，已知磷脂酰丝氨酸在脑中具有生理机能。作为制造磷脂酰丝氨酸的方法，已知有使磷脂酶D作用于磷脂酰胆碱从而得到磷脂酰丝氨酸的方法(专利文献I和专利文献2) 。另一方面，作为磷脂之一的溶血磷脂是指I个脂肪酸键合于甘油骨架而成的磷月旨，由于溶血磷脂的分子量比一般磷脂小，可以认为其在体内的吸收性高。因此，具有溶血磷脂和磷脂酰丝氨酸这两者的结构的溶血磷脂酰丝氨酸在体内易于被吸收，可以期待其具有优异的生理活性。在溶血磷脂中，2-酰基-溶血磷脂在甘油骨架的sn-Ι位不具有脂肪酸，仅在sn_2位具有脂肪酸。已知与仅sn-Ι位具有脂肪酸的1-酰基-溶血磷脂相比，2-酰基-溶血磷脂的界面张力、表面张力和乳化稳定性优异(例如，专利文献3)。2-酰基-溶血磷脂通过将磷脂sn-Ι位的酯键水解、分离出脂肪酸而得到。作为进行sn-Ι位酯键的水解的酶，已知有磷脂酶Al，专利文献4中公开了使用提取自鱼类的卵巢中的磷脂酶Al，将磷脂转化为2-酰基-溶血磷脂的方法。另外，专利文献5中公开了使用由微生物产生的磷脂酶Al，将磷脂转化为2-酰基-溶血磷脂的方法。现有技术文献
专利文献专利文献1:日本特开平9-121879号公报专利文献2:日本特开2002-218991号公报专利文献3:日本特开平9-227895号公报专利文献4:日本特开2006-197842号公报专利文献5:日本特开2006-325485号公报

发明内容
发明要解决的问题然而，使用磷脂酰胆碱或磷脂酰丝氨酸作为磷脂的情况下，存在以下问题:即使利用磷脂酶Al进行sn-Ι位的脂肪酸的水解反应，磷脂酶Al对磷脂酰胆碱和磷脂酰丝氨酸的反应性也差、磷脂转化为溶血磷脂的比例(溶血化率)低。因此，本发明的目的在于，在制造含2-酰基-溶血磷脂酰丝氨酸的组合物时，提高利用磷脂酶Al由磷脂转化为溶血磷脂的比例(溶血化率)。用于解决问题的方案本发明人等为了解决上述问题而进行了深入研究，结果发现，通过改良磷脂酶Al的酶反应条件，磷脂酶Al对磷脂酰胆碱和磷脂酰丝氨酸的反应性提高，可以提高溶血化率。
即，本发明提供一种含2-酰基-溶血磷脂酰丝氨酸的组合物的制造方法，其包括:(a)在丝氨酸的存在下，使磷脂酶D作用于含有磷脂酰胆碱的原料，从而得到含有磷脂酰丝氨酸的组合物的工序、以及(b)在选自由下述(I)、(II)和(III)组成的组中的一种以上添加剂的存在下，使磷脂酶Al作用于前述含有磷脂酰丝氨酸的组合物，从而得到含2-酰基-溶血磷脂酰丝氨酸的组合物的工序，其中，(I)为选自由I价阳离子的、硫酸盐、磷酸盐、硝酸盐、柠檬酸盐和酒石酸盐组成的组中的一种以上盐，(II)为树胶(gum)类，(III)为乳化剂。
另外，本发明提供一种含2-酰基-溶血磷脂酰丝氨酸的组合物的制造方法，其包括:(c)在选自由下述(I)、(II)和(III)组成的组中的一种以上添加剂的存在下，使磷脂酶Al作用于含有磷脂酰胆碱的原料，从而得到含有2-酰基-溶血磷脂酰胆碱的组合物的工序、以及(d)在丝氨酸的存在下，使磷脂酶D作用于所述含有2-酰基-溶血磷脂酰胆碱的组合物，从而得到含2-酰基-溶血磷脂酰丝氨酸的组合物的工序，其中，(I)为选自由I价阳离子的、硫酸盐、磷酸盐、硝酸盐、柠檬酸盐和酒石酸盐组成的组中的一种以上盐，(II)为树胶类，(III)为乳化剂。
根据这些方法，通过在选自⑴、(II)和(III)中的特定添加剂的存在下进行磷脂酶Al的酶反应，磷脂酶Al对磷脂酰胆碱和磷脂酰丝氨酸的反应性提高，可以提高由磷脂转化为溶血磷脂的比例(溶血化率)。
优选的是，添加剂至少包含⑴、且I价阳离子的盐的浓度为0.25 2.0M0通过在盐浓度处于该范围的添加剂的存在下进行酶反应，可以进一步提高溶血化率。
另外，优选的是，添加剂至少包含(I)、且I价阳离子的硫酸盐为硫酸铵和/或硫酸钠。添加剂为硫酸铵和/或硫酸铵时，可以进一步提高溶血化率。
另外，优选的是，添加剂至少包含(II)、且树胶类为选自由黄原胶、瓜尔豆胶、罗望子胶、他拉胶、阿拉伯胶和刺槐豆胶组成的组中的一种以上。另外，优选的是，添加剂至少包含(III)、且乳化剂为选自由蔗糖脂肪酸酯系乳化剂、聚甘油脂肪酸酯系乳化剂和聚山梨酯系乳化剂组成的组中的一种以上。通过这些添加剂也可以进一步提高溶血化率。
另外，含有磷脂酰胆碱的原料优选衍生自海产品和/或衍生自植物。衍生自海产品的磷脂酰胆碱多是在sn-2位包含二十二碳六烯酸和二十碳五烯酸等高度不饱和脂肪酸而构成的，所得到的2-酰基 -溶血磷脂酰丝氨酸为在sn-2位键合有二十二碳六烯酸和二十碳五烯酸等高度不饱和脂肪酸而成的2-酰基-溶血磷脂酰丝氨酸。另外，使用衍生自植物的磷脂酰胆碱作为原料时，可以提高溶血化率。
另外，本发明提供一种含2-酰基-溶血磷脂酰丝氨酸的组合物，其中，相对于固体成分以质量基准计含有26 51%的溶血磷脂。更优选相对于固体成分以质量基准计含有37 51%的溶血磷脂。另外，含2-酰基-溶血磷脂酰丝氨酸的组合物中的溶血磷脂相对于总磷脂的比例以质量基准计优选为40 73%，更优选为57 73%。另外，2-酰基-溶血磷脂酰丝氨酸优选为在sn-2位键合有高度不饱和脂肪酸的2-酰基-溶血磷脂酰丝氨酸，该高度不饱和脂肪酸优选为二十二碳六烯酸和/或二十碳五烯酸。二十二碳六烯酸和二十碳五烯酸具有改善记忆学习能力等的生理活性，因此可以认为键合有这些脂肪酸的2-酰基-溶血磷脂酰丝氨酸也具有同样的生理活性。这样的含2-酰基-溶血磷脂酰丝氨酸的组合物是根据上述制造方法首次得到的。发明的效果根据本发明的方法，在制造含2-酰基-溶血磷脂酰丝氨酸的组合物时，可以提高利用磷脂酶Al由磷脂转化为溶血磷脂的比例(溶血化率)。


图1是对本发明方法所述的含2-酰基-溶血磷脂酰丝氨酸的组合物的制造方法进行说明的流程图。
具体实施例方式以下，适当参照所附的附图，对本发明的方法详细地进行说明。图1是对本实施方式所述的含2-酰基-溶血磷脂酰丝氨酸的组合物的制造方法进行说明的流程图。本实施方式的方法可以大致分为图1所示的途径I的方法和途径2的方法。途径I和途径2在以下方面是共通的:它们都是使用含有磷脂酰胆碱的原料作为原料，使用磷脂酶Al (PLAl)和磷脂酶D (PLD)作为酶，得到含2-酰基-溶血磷脂酰丝氨酸的组合物作为最终产物。不同点是进行PLAl和PLD的酶反应的顺序。也就是说，在途径I中，先进行PLD的酶反应(工序(a))，使PLAl对通过PLD的酶反应而生成的产物起作用(工序(b))。另外，在途径2中，先进行PLAl的酶反应(工序(c))，使PLD对通过PLAl的酶反应而生成的产物起作用(工序(d))。本说明书中只要没有特别说明，途径I和2中可以使用相同的原料，也可以使用相同的酶(PLD或PLA1)。以下，关于途径I和途径2的方法，首先从途径I的方法开始进行说明。<关于途径1>途径I的方法包括:(a)在丝氨酸的存在下，使PLD作用于含有磷脂酰胆碱的原料，从而得到含有磷脂酰丝氨酸的组合物的工序、以及(b)使PLAl作用于含有磷脂酰丝氨酸的组合物，从而得到含有2-酰基-溶血磷脂酰丝氨酸的组合物的工序。首先，对工序(a)进行说明。工序(a)中所用的含有磷脂酰胆碱的原料只要富含磷脂酰胆碱就没有特别限定。例如，可以使用作为一般的油脂制造原料而已知的大豆、菜种、亚麻、玉米、棉籽、向日葵、米胚芽、大麦、燕麦、红花等衍生自植物的原料，以及鱼油、鱼肉、鱼卵、鱼的内脏类、贝身、贝的内脏类、牛肉、牛脑、猪肉、鸡肉和蛋黄等衍生自动物的原料。进而，也可以将利用公知的方法由这些原料提取出的磷脂作为含有磷脂酰胆碱的原料而使用。原料所包含的磷脂酰胆碱优选在sn-2位键合有高度不饱和脂肪酸。作为该高度不饱和脂肪酸并没有特别限定，不饱和脂肪酸的碳原子数优选16以上，更优选18以上，进一步优选20以上。另外，不饱和脂肪酸的双键的数目优选2以上，更优选4以上，进一步优选5以上。另外，不饱和脂肪酸优选为n-3脂肪酸或n-6脂肪酸，更优选为n-3脂肪酸。具体而言，高度不饱和脂肪酸优选 为二十二碳六烯酸(DHA)或二十碳五烯酸(EPA)，更优选为DHA0作为包含具有DHA的磷脂酰胆碱的原料,例如可列举出由墨鱼、磷奸、金枪鱼、鲣鱼、鲭鱼、沙丁鱼、秋刀鱼、竹荚鱼、鲑鱼子、扇贝和贻贝等鱼类和贝类的组织提取而成的衍生自海产品的原料；由牛脑、基因重组猪和蛋黄等动物组织提取而成的原料；以及由产生DHA的海洋细菌、藻类(小球藻属等)等微生物提取而成的原料。因为墨鱼或磷虾的磷脂大量含有在sn-2位键合有DHA的磷脂酰胆碱，进一步优选衍生自墨鱼或磷虾的原料。上述原料可以单独使用或组合多种使用。
本发明的制造方法中，含有磷脂酰胆碱的原料可以溶解或悬浮于适合PLD的酶反应的溶剂后使用。作为这样的溶剂，例如可列举出氯仿、醚、水、乙酸乙酯、石油醚、己烷、四氢呋喃、吡啶、二氯甲烷和缓冲液。这些溶剂中，优选使用选自氯仿、水和醚中的至少一种。通常而言，据说在磷脂的酶反应中，醚具有活化磷脂酶的效果。然而，将目标产物用于食品用途的情况下，由于对生物体无害，进一步优选使用水。上述溶剂按照目标产物的用途等可以单独使用或适当组合多种而使用。
工序(a)中所用的磷脂酶D(PLD)对磷脂或溶血磷脂起作用，引起磷脂酰基转化反应，将键合于磷脂的磷酸基的胆碱转化为丝氨酸。PLD存在于放线菌以及圆白菜、菠菜、花生等植物中，对于本发明的制造方法，只要磷脂酰基转化反应的效率良好就没有特别限定，均可以使用。作为这样的PLD，具体而言，可列举出磷脂酶D (名糖产业公司制造)、磷脂酶D (Nagase ChemteX Corporatio n 制造)、憐脂酶 D (生化学工业公司制造)、PhospholipaseD(旭化成公司制造)和PLD(Biomol International, Inc.制造)等。对于本发明，优选可列举出磷脂酶D (名糖产业公司制造)和Phospholipase D (旭化成公司制造)。
工序(a)中，为了在丝氨酸的存在下使PLD作用于含有磷脂酰胆碱的原料，例如，可以使含有磷脂酰胆碱的原料溶解于反应溶剂从而制作反应溶液，向该反应溶液中添加丝氨酸，向其中添加PLD。作为PLD的添加量，相对于Ig含有磷脂酰胆碱的原料优选20 500单位，更优选50 200单位，进一步优选100单位。作为酶反应的反应条件并没有特别限定，例如，可以在酶的适合反应条件的范围内作用。例如，作为反应温度优选20 70°C，更优选30 50°C，进一步优选40°C。另外，例如，作为反应时间优选I 48小时，更优选8 24小时，进一步优选18小时。例如，作为反应溶剂可以从以上所说明的溶剂中选择。对于本发明，优选由水或缓冲液等水系溶剂和醚等有机溶剂构成的2层体系的反应，但在将目标产物用于食品用途的情况下，优选水或缓冲液等水系溶剂的反应体系。例如，反应PH优选pH4.5 7.0，更优选pH5.0 6.5，进一步优选pH5.5。另外，作为丝氨酸的添加量，相对于Ig含有磷脂酰胆碱的原料可以优选使用0.5 2g,更优选使用0.7 1.5g,进一步优选使用lg。另外，也可以向反应溶液中加入PLD的反应活化剂。作为这样的反应活化剂,例如可列举出氯化钙。使用氯化钙作为反应活化剂的情况下，相对于Ig含有磷脂酰胆碱的原料，氯化钙以氯化钙二水合物的形式，可以优选使用0.5 2g，更优选使用0.7 1.5g，进一步优选使用lg。
酶反应结束后，对反应溶液进行适当提取、浓缩、干燥等操作，可以由反应溶液得到含有磷脂酰丝氨酸的组合物。
接着，对工序(b)进行说明。本发明的(b)工序中所用的磷脂酶Al (PLAl)对磷脂起作用，水解磷脂sn-Ι位的酯键并使键合于sn-Ι位的脂肪酸游离，从而生成2-酰基-溶血磷脂。PLAl存在于动物的胰脏和肝脏、鱼类的卵巢、微生物等，对于本发明的制造方法，只要是水解sn-2位的酯键并使脂肪酸游离的情况较少、且能够以高收率得到2-酰基-溶血磷脂就没有特别限定，均可以使用。作为这样的PLA1，具体而言，可列举出Aspergillus属、Pseudomonas 属、Shewanella 属、Pseudoalteromonas 属、Vibrio 属和 Serratia 属微生物产生的PLA1,以及由鲣鱼、金枪鱼、鲭鱼、鲑鱼、鳟鱼和鳕鱼等鱼类的卵巢提取而成的PLA1。优选磷脂酶Al (三菱化学公司制造)、Lecitase Ultra(注册商标，Novozymes.C0.Ltd.制造)、Lecitase Novo (注册商标,Novozymes.C0.Ltd.制造)以及日本特开 2006-325485 号中记载的可以由Pseudomonas sp.(HFK10020株)培养上清得到的PLAl等。若相对于磷脂过量添加PLAl,则不仅磷脂中的sn-Ι位的酯键会水解,连sn_2位的脂肪酸的酯键也会水解，存在目标2-酰基-溶血磷脂的收量降低的可能，因此作为PLAl的添加量，相对于Ig含有磷脂酰丝氨酸的组合物优选20 500单位，更优选50 200单位，进一步优选100单位。工序(b)中，对于本发明的方法，通过在选自由下述的(I)、(II)和(III)组成的组中的一种以上添加剂的存在下，使PLAl作用，可以提高利用PLAl由磷脂转化为2-酰基-溶血磷脂的比例(溶血化率)。(I)为选自由I价阳离子的、硫酸盐、磷酸盐、硝酸盐、柠檬酸盐和酒石酸盐组成的组中的一种以上盐，(II)为树胶类，(III)为乳化剂。添加剂(I)为选自由I价阳离子的、硫酸盐、磷酸盐、硝酸盐、柠檬酸盐和酒石酸盐组成的组中的一种以上盐，因为溶血化率变得更高，这些盐中特别优选I价阳离子的硫酸盐。I价阳离子的硫酸盐中，因为溶血化率进一步变高，添加剂(I)优选硫酸铵和/或硫酸钠。例如，使用硫酸铵作为添加剂(I)时，优选的是，硫酸铵在反应体系中的浓度优选约
0.25 2.0M，更优选约1M。另外，例如，使用硫酸钠作为添加剂(I)时，优选的是，硫酸钠在反应体系中的浓度优选约0.25 2.0M，更优选约0.75M。通过加入这样高浓度的盐类，可以极大提高溶血化率。添加剂(II)为树胶类。作为这样的树胶类，因为溶血化率变得更高，优选选自由黄原胶、瓜尔豆胶、罗望子胶、他拉胶、阿拉伯胶、刺槐豆胶组成的组中的一种以上。另外，若并用添加剂⑴和添加剂(II)，与单独使用添加剂⑴或(II)的情况相比，可以进一步提高溶血化率，因此优选并用添加剂(I)和添加剂(II)。作为与添加剂(II)并用的添加剂(I)，优选硫酸盐，更优选硫酸钠或硫酸铵。另外，作为并用的添加剂(II)，优选阿拉伯胶。添加剂(III)为乳化剂。作为这样的乳化剂，因为溶血化率变得更高，优选选自由蔗糖脂肪酸酯系乳化剂、聚甘油脂肪酸酯系乳化剂和聚山梨酯系乳化剂组成的组中的一种以上。另外，这些乳化剂优选HLB (亲水亲油平衡，Hydrophile-Lipophile Balance)值为10以上。另外，若并用添加剂⑴和添加剂(III)，与单独使用添加剂⑴或(III)的情况相比，可以进一步提高溶血化率，因此优选并用添加剂(I)和添加剂(III)。作为与添加剂
(III)并用的添加剂(I)，优选硫酸盐，更优选硫酸钠或硫酸铵。另外，作为并用的添加剂
(III)，优选聚甘油脂肪酸酯系乳化剂或聚山梨酯系乳化剂。工序(b)中，为了在选自由(1)、(11)和(III)组成的组中的一种以上添加剂的存在下使PLAl作用于含有磷脂酰丝氨酸的组合物，例如，可以使(a)中所得到的含有磷脂酰丝氨酸的组合物溶解于反应溶剂从而制作反应溶液，向该反应溶液中添加上述添加剂，向其中添加PLA1。作为酶反应的反应条件并没有特别限定，例如，可以在酶的适合反应条件的范围内作用。例如，作为反应温度优选10 50°C，更优选30 50°C。关于反应时间，2-酰基-溶血磷脂产量随反应时间的延长而增加，若超过适宜的反应时间，则PLAl不仅会水解磷脂的sn-Ι位的酯键，还会引起sn-2位的酯键的水解，导致目标2-酰基-溶血磷脂的收率下降，因此优选在适宜的反应时间内使PLAl作用。适宜的反应时间是指1 24小时,更优选I 4小时。例如，作为反应溶剂可列举出由醚或乙酸乙酯等有机溶剂和水等水系溶剂构成的2层体系，或者水等水系溶剂的反应体系。特别优选使用醚作为溶剂，但在将目标产物用于食品用途的情况下，优选水等水系溶剂的反应体系。例如，反应PH优选pH4 8，更优选PH4.5 6.5，进一步优选pH6.5。
酶反应结束后，对反应溶液进行适当提取、浓缩、干燥等操作，可以由反应溶液得到含2-酰基-溶血磷脂酰丝氨酸的组合物。
<关于途径2的方法>
接着，对途径2的方法进行说明。途径2的方法包括:(c)使磷脂酶Al (PLAl)作用于含有磷脂酰胆碱的原料，从而得到含有2-酰基-溶血磷脂酰胆碱的组合物的工序、以及(d)在丝氨酸的存在下，使磷脂酶D (PLD)作用于含有2-酰基-溶血磷脂酰胆碱的组合物，得到含2-酰基-溶血磷脂酰丝氨酸的组合物的工序。
工序(c)是利用PLAl由磷脂得到2-酰基-溶血磷脂的工序，可以使用与工序(b)相同的反应条件。也就是说，对于本发明的方法，在工序(c)中，通过在选自由(I)、(II)和(III)组成的组中的一种以上添加剂的存在下，使PLAl起作用，可以提高将磷脂转化为溶血磷脂的比例(溶血化率)。PLAl可以使用工序(b)的说明中所列举出的物质，添加剂(I)、(II)和(III)分别为工序(b)的说明中所列举出的添加剂(I)、(II)和(III)。另外，含有磷脂酰胆碱的原料可以使用工序(a)的说明中所列举出的原料。酶反应结束后，对反应溶液进行适当提取、浓缩、干燥等操作，可以由反应溶液得到含2-酰基-溶血磷脂酰胆碱的组合物。
工序(d)是将工序(C)中所得到的2-酰基-溶血磷脂酰胆碱的磷酸基所键合的胆碱通过PLD的作用转化为丝氨酸的工序，可以使用与工序(a)相同的反应条件。例如，PLD、丝氨酸和反应活化剂可以分别使用工序(a)的说明中所列举出的物质。酶反应结束后，对反应溶液进行适当提取、浓缩、干燥等操作，可以由反应溶液得到含2-酰基-溶血磷脂酰丝氨酸的组合物。
根据本发明的方法，使用途径I或途径2的任意方法，均可以提高PLAl对磷脂酰胆碱和磷脂酰丝氨酸的反应性，可以提高磷脂转化为溶血磷脂的比例(溶血化率)，以高收益得到目标2-酰基-溶血磷脂酰丝氨酸。需要说明的是，本说明书中的“溶血化率”可以根据实施例所记载的方法来决定。
本发明的方法中，为了得到含有2-酰基-溶血磷脂酰丝氨酸的组合物，可以使用途径I或途径2的任意方法。
<关于2-酰基-溶血磷脂酰丝氨酸>
根据上述方法而得到的含有2-酰基-溶血磷脂酰丝氨酸的组合物优选相对于固体成分的溶血磷脂含量较高。因为在脂质中溶血磷脂也具有优异的生理活性机能。例如，相对于固体成分以质量基准计含有26 51%的溶血磷脂，更优选含有37 51%。另外，优选组合物中的溶血磷脂相对于总磷脂的比例较高。例如，溶血磷脂相对于总磷脂的比例以质量基准计优选为40 73%，更优选为57 73%。需要说明的是，上述“溶血磷脂相对于总磷脂的比例”可以用(溶血磷脂 的含量)/(总磷脂的含量)X 100%来决定。“总磷脂的含量”和“溶血磷脂的含量”分别可以根据实施例所记载的方法来决定。
进而，组合物中所包含的2-酰基-溶血磷脂酰丝氨酸优选包含具有特定生理活性机能的脂肪酸。作为这样的具有特定生理活性机能的脂肪酸，可列举出高度不饱和脂肪酸。高度不饱和脂肪酸作为体内的生理活性物质而发挥作用。高度不饱和脂肪酸更优选二十二碳六烯酸(DHA)和/或二十碳五烯酸(EPA)。已知这些高度不饱和脂肪酸各自具有改善记忆学习能力等的生理活性机能。这些高度不饱和脂肪酸中优选DHA。DHA多含于鱼类和贝类等海产品中，是生理活性机能特别优异的高度不饱和脂肪酸。根据本发明的方法而提供的组合物所包含的2-酰基-溶血磷脂酰丝氨酸等溶血磷脂作为生理活性物质而发挥作用。因此，配混根据本发明的方法所得到的组合物，可以提供赋予了生理活性机能的食品饮料和药品。该情况下，根据本发明的方法所得到的上述组合物的溶血磷脂在组合物中的含量较高，因此即使组合物的配混量为少量也可以得到较高效果。另外，DHA、EPA等高度不饱和脂肪酸键合于组合物中所包含的2-酰基-溶血磷脂酰丝氨酸的sn-2位时，可以提供赋予了改善记忆学习能力等优异的生理活性机能的食品饮料和药品。实施例以下，举出实施例来具体说明本发明，但本发明不受这些实施例的限定。需要说明的是，实施例中若无特别说明，则“％”表示“w/v%”。以下所记载的总磷脂含量、溶血磷脂含量和溶血化率的分析方法是根据以下测定方法而得到的值。1.<总磷脂含量的分析方法>总磷脂含量根据以下方法来决定。(A):试样溶液的测定波长为500nm下的吸光度(B):总磷脂标 准液的测定波长为500nm下的吸光度总磷脂含量(质量％) = (A) / (B) X 100 (质量%)将使试样溶解于盐酸甲醇并使其成为20mg/mL而成的溶液在65 °C下加热30分钟。返回至室温后，向溶液中加入等量的水，接着加入等量的己烷，充分搅拌混合。将溶液离心分离(3000转，5分钟)后，将10 μ L溶液的下层添加至1.0mL下述组成的总磷脂分析用酶显色试剂中。使该溶液在37°C下显色20分钟后，对测定波长为500nm下的吸光度(A)进行测定。总磷脂分析用酶显色试剂的组成:
权利要求
1.一种含2-酰基-溶血磷脂酰丝氨酸的组合物的制造方法，其包括: (a)在丝氨酸的存在下，使磷脂酶D作用于含有磷脂酰胆碱的原料，从而得到含有磷脂酰丝氨酸的组合物的工序、以及 (b)在选自由下述(1)、(11)和(III)组成的组中的一种以上添加剂的存在下，使磷脂酶Al作用于所述含有磷脂酰丝氨酸的组合物，从而得到含有2-酰基-溶血磷脂酰丝氨酸的组合物的工序，其中， (I)为选自由I价阳离子的、硫酸盐、磷酸盐、硝酸盐、柠檬酸盐和酒石酸盐组成的组中的一种以上盐， (II)为树胶类， (III)为乳化剂。
2.—种含2-酰基-溶血磷脂酰丝氨酸的组合物的制造方法，其包括: (c)在选自由下述(I)、(II)和(III)组成的组中的一种以上添加剂的存在下，使磷脂酶Al作用于含有磷脂酰胆碱的原料，从而得到含有2-酰基-溶血磷脂酰胆碱的组合物的工序、以及 (d)在丝氨酸的存在下，使磷脂酶D作用于所述含有2-酰基-溶血磷脂酰胆碱的组合物，从而得到含有2-酰基-溶血磷脂酰丝氨酸的组合物的工序，其中， (I)为选自由I价阳离子的、硫酸盐、磷酸盐、硝酸盐、柠檬酸盐和酒石酸盐组成的组中的一种以上盐， (II)为树胶类，(III)为乳化剂。
3.根据权利要求1或2所述的制造方法，其中，所述添加剂至少包含所述(I)，所述I价阳离子的盐的浓度为0.25 2.0M。
4.根据权利要求1 3中的任一项所述的制造方法，其中，所述添加剂至少包含所述(I)，所述I价阳离子的硫酸盐为硫酸铵和/或硫酸钠。
5.根据权利要求1 4中的任一项所述的制造方法，其中，所述添加剂至少包含所述(II)，所述树胶类为选自由黄原胶、瓜尔豆胶、罗望子胶、他拉胶、阿拉伯胶和刺槐豆胶组成的组中的一种以上。
6.根据权利要求1 5中的任一项所述的制造方法，其中，所述添加剂至少包含所述(III)，所述乳化剂为选自由蔗糖脂肪酸酯系乳化剂、聚甘油脂肪酸酯系乳化剂和聚山梨酯系乳化剂组成的组中的一种以上。
7.根据权利要求1 6中的任一项所述的制造方法，其中，所述含有磷脂酰胆碱的原料衍生自海产品和/或衍生自植物。
8.根据权利要求1 6中的任一项所述的制造方法，其中，所述含有磷脂酰胆碱的原料衍生自海广品。
9.一种含2-酰基-溶血磷脂酰丝氨酸的组合物，其中，相对于固体成分以质量基准计含有26 51%的溶血磷脂。
10.根据权利要求9所述的含2-酰基-溶血磷脂酰丝氨酸的组合物，其中，相对于固体成分以质量基准计含有37 51%的溶血磷脂。
11.根据权利要求9或10所述的含2-酰基-溶血磷脂酰丝氨酸的组合物，其中，所述含2-酰基-溶血磷脂酰丝氨酸的组合物中的溶血磷脂相对于总磷脂的比例以质量基准计为40 73%。
12.根据权利要求11所述的含2-酰基-溶血磷脂酰丝氨酸的组合物，其中，所述含2-酰基-溶血磷脂酰丝氨酸的组合物中的溶血磷脂相对于总磷脂的比例以质量基准计为57 73%。
13.根据权利要求9 12中的任一项所述的含2-酰基-溶血磷脂酰丝氨酸的组合物，其中，所述2-酰基-溶血磷脂酰丝氨酸为sn-2位键合有高度不饱和脂肪酸的2-酰基-溶血磷脂酰丝氨酸。
14.根据权利要求13所述的含2-酰基-溶血磷脂酰丝氨酸的组合物，其中，所述高度不饱和脂肪酸为二十二碳六烯酸和/或二十碳五烯酸。
15.根据权利要求9 14中的任一项所述的含2-酰基-溶血磷脂酰丝氨酸的组合物，其通过权利要求1 8中的任一项所述的方法得到。
全文摘要
本发明提供一种含2-酰基-溶血磷脂酰丝氨酸的组合物的制造方法，其包括(a)在丝氨酸的存在下，使磷脂酶D作用于含有磷脂酰胆碱的原料，从而得到含有磷脂酰丝氨酸的组合物的工序、以及(b)在选自由下述(I)、(II)和(III)组成的组中的一种以上添加剂的存在下，使磷脂酶A1作用于含有磷脂酰丝氨酸的组合物，从而得到含有2-酰基-溶血磷脂酰丝氨酸的组合物的工序，其中，(I)为选自由1价阳离子的、硫酸盐、磷酸盐、硝酸盐、柠檬酸盐和酒石酸盐组成的组中的一种以上盐，(II)为树胶类，(III)为乳化剂。
文档编号A61K31/685GK103140587SQ201180047811
公开日2013年6月5日 申请日期2011年9月26日 优先权日2010年9月30日
发明者矢泽一良, 诹佐智之, 后藤祥二, 田代靖人, 川岛顺市, 今村茂行 申请人:国立大学法人东京海洋大学, 株式会社明治