氧化铝纳米颗粒生物缀合物以及使用所述生物缀合物刺激免疫应答的方法

专利名称：氧化铝纳米颗粒生物缀合物以及使用所述生物缀合物刺激免疫应答的方法
氧化铝纳米颗粒生物缀合物以及使用所述生物缀合物刺激免疫应答的方法相关申请交叉引用

本申请要求于2010年8月27日提交的美国临时专利申请系列第61/377，792号的权益,在此通过弓I用将其内容整体并入本文。关于政府资助研发的声明本发明在美国国立卫生研究院资助的项目号1R21CA141278-01和海军研究办公室资助的项目号N00014-10-1-0082的政府支持下完成。政府具有本发明的部分权利。领域本申请通常涉及氧化铝(Al2O3)纳米颗粒生物缀合物及其在免疫原性组合物如疫苗组合物中的用途。背景通过树突状细胞(DCs)将外源性抗原交叉呈递至细胞毒性T淋巴细胞(CTL)依赖于主要的细胞蛋白水解机构，即蛋白酶体将长链多肽消化成小片段，所述小片段能够与细胞表面分子(I型MHC)相关联，该分子形成触发T细胞活性的特异性配体。与此相反，通过DCs将外源性抗原呈递至辅助性T淋巴细胞(Th)主要依赖于溶酶体途径，其中溶酶体内部的蛋白酶有助于内化蛋白的消化，并且随后，消化的小肽片段被加载到II型MHC分子上，来激活初始Th细胞。肿瘤细胞加工能够被T淋巴细胞(T细胞)和激活的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)识别的抗原，所述T细胞和CTL不断地循环并寻求破坏肿瘤细胞。因此，提出使用癌症免疫疗法来治疗癌症的方法，从而产生能与肿瘤相关抗原反应的治疗性T细胞，所述T细胞高于介导所建立的肿瘤消退并防止肿瘤复发所需要的阈值水平。遗憾的是，尽管多年来通过许多研究者大量的努力，但癌症疫苗的特异活性免疫在动物模型或临床试验中仍不是非常有效。癌症免疫疗法成功的主要障碍是疫苗最初不能诱导肿瘤反应性CTL的大量扩增，以及随后无法持续。此外，癌症免疫疗法当前可用的方法仍存在其它障碍。例如，对于除黑色素瘤之外的大多数癌症，还不知道潜在的肿瘤排斥抗原，并且占优势的肿瘤排斥抗原可能是肿瘤特异的或患者特异的。尽管近年来已经开发了不同的策略，包括基因-修饰的肿瘤疫苗、来自肿瘤的热休克蛋白、负载肿瘤溶解产物或转染肿瘤来源RNA的DCs、肿瘤和DCs的融合物以及肿瘤细胞分泌的外切体，但其在荷瘤宿主中诱导高水平肿瘤特异性T细胞的能力尚待证实。因此，需要用于治疗癌症的新的免疫原性方法。概述鉴于上述情况，本发明目标是提供生物缀合物，其能够通过交叉激活用于刺激强烈的免疫(例如抗肿瘤或抗病原体免疫)。本文公开的生物缀合物可以用于免疫治疗中，例如，在荷瘤宿主(或病原体感染宿主)中产生足够数量的肿瘤-或病原体-反应效应物/记忆T细胞，该数量高于介导肿瘤(或病原体)消退或防止肿瘤(或病原体)复发所需要的阈值水平。
通常，本发明提供了包含与氧化铝(例如，C1-Al2O3)纳米颗粒缀合的自噬体的生物缀合物，其中这些缀合物能够在受试者中刺激针对靶抗原的免疫应答。更具体地，氧化铝纳米颗粒通常具有范围为大约Inm至大约150nm的直径，并且自噬体封装靶抗原的缺陷型核糖体产物(DRiPs)。自噬体可以由能产生缺陷型核糖体产物的细胞中产生，例如，肿瘤细胞或感染一种或多种病原体的细胞。因为通过降低或抑制细胞蛋白降解能够诱导DRiPs的细胞累积并分泌入自噬小体(例如，自噬体)，所以通过用含有蛋白酶体抑制剂和溶酶体阻滞剂以及任选的自噬诱导剂接触细胞能够产生封装DRiPs的自噬体。可以使用从受试者中获得的细胞(例如，肿瘤细胞或感染一种或多种病原体的细胞)离体产生自噬体。可以从细胞中收获自噬体，来提供分离的自噬体。例如，靶抗原可以是肿瘤-相关抗原，并且自噬体可以来自肿瘤细胞。在另一例子中，靶抗原可以是病原体-相关抗原，自噬体可以来自感染病原体或载体的细胞，该载体表达病原体-相关抗原。例如，病原体可以是病毒，在这种情况下自噬体可以来自病毒。如本文所详细描述的，直径小于大约150nm的氧化铝纳米颗粒被证实能够诱导意想不到的抗原交叉呈递中的改善。它们还能够意想不到地增加来自肿瘤的自噬体的抗肿瘤效力，该自噬体含有有限量的未知的肿瘤特异性抗原。在由其它金属氧化物组成的纳米颗粒或具有更大直径的氧化铝纳米颗粒中未观察到这些好处。因此，本发明生物缀合物的氧化铝纳米颗粒通常具有范围为大约Inm至大约150nm的直径,例如，范围未大约5nm至大约IOOnm(例如，范围为大约IOnm至大约80nm)。可以通过本领域已知的多种方法制备直径小于大约150nm的氧化铝纳米颗粒，所述方法包括激光热解法、火焰喷雾热解法、燃烧合成法或溶胶-凝胶法。在某些实施方案中，可以通过激光热解法制备本发明的生物缀合物，所述激光热解法在组成、结晶度和尺寸高度一致的颗粒形成中是有用的。可以使用多种偶联反应将自噬体与氧化铝纳米颗粒缀合。在一些实施方案中，自噬体可以用具有末端肼基的交联剂修饰。氧化铝纳米颗粒可以是用氨基进行表面修饰的，然后使用具有末端醛基(例如，苯甲醛)的交联剂进一步修饰。肼基和醛基能反应形成稳定的腙键，该腙键将自噬体共价连接在氧化铝纳米颗粒的表面。根据本发明，免疫原性组合物可以包括悬浮于药学上可接受的流体载体中的治疗有效量的氧化铝纳米颗粒-自噬体缀合物。在一些实施方案中，免疫原性组合物可以包括治疗有效量的抗原呈递细胞，所述抗原呈递细胞加载(pulse)(负载)氧化铝纳米颗粒-自噬体缀合物(本文称为“负载缀合物的APCs ” )。通过将APCs与氧化铝纳米颗粒-自噬体缀合物孵育可以获得这些负载缀合物的APCs。在多个实施方案中，APCs可以是树突状细胞。药学上可接受的流体载体选自盐、电解质水溶液和缓冲水溶液。免疫原性组合物还可以包括抗肿瘤化学治疗剂、佐剂或其它免疫刺激剂或它们的组合。免疫原性组合物可以是疫苗组合物。 本发明还提供了在受试者(例如，人或非人的哺乳动物)中刺激针对靶抗原的免疫应答的方法。所述方法包括给予受试者本文公开的免疫原性组合物，从而在受试者中刺激针对一种或多种抗原的免疫应答。在一些实施方案中，受试者具有肿瘤。在这些实施方案中，在给予免疫原性组合物之前还可以给予受试者治疗有效量的淋巴细胞清除剂。在多个实施方案中，通过本文公开方法刺激的免疫应答可以主要是细胞-介导的(与抗体-介导的相对应)。从以下附图、说明书、实施例和权利要求中将更全面地了解前文以及本发明的其它特征及优点。


应理解以下描述的附图只是为了说明的目的。附图不必按比例绘制，重点通常放在说明本发明的原理上。附图并非意图以任何方式限制本发明的范围。图1a是示意图，其显示了本发明的金属氧化物纳米颗粒(MOx NP)-蛋白抗原缀合物的一个实施方案的结构。图1b是氧化铝纳米颗粒(a -Al2O3NPs, 60nm)在与卵白蛋白(OVA)缀合前的透射电子显微镜镜(TEM)图像。插图显示了 C1-Al2O3NP高分辨率TEM图像。图1c显示了 a -Al2O3NP(60nm)在与OVA蛋白缀合后表面的TEM图像。图1d显示了树突状细胞(DCs)与异硫氰酸荧光素(FITC)-标记的a -Al2O3NP-OVA缀合物孵育0.5小时(上)和24小时(下)后代表性的明视场(左)图像、荧光(中)图像和置加(右)图像。图1e 比较了无抗原(无 Ag) DCs、针对加载 10 μ g/mL OVA (OVA IO μ g/mL)的 DCs 和加载 a -Al2O3NP (60nm) -OVA 缀合物(其含有 0.I μ g/mL OVA) ( α -Al2O3NP-OVA0.1 μ g/mL)的DCs上MHC I肽复合物(Kb-SIINFEKL)的表面表达。图2a 显示了与负 载分别与 a -Al2O3NPs (200nm 或 60nm)、锐钛矿 TiO2NPs (IOOnm 或25nm)和a -Fe2O3NPs (25nm)缀合的OVA抗原的树突状细胞相比，用只负载滴定量OVA抗原的树突状细胞刺激60小时后，分化的Thyl.1+OT-1⑶8+T细胞的百分比和。图2b 显示了与负载分别与 a -Al2O3NPs (200nm 或 60nm)、锐钛矿 TiO2NPs (IOOnm 或25nm)和a -Fe2O3NPs (25nm)缀合的OVA抗原的树突状细胞相比，用只负载滴定量OVA抗原的树突状细胞刺激的T细胞的INF- Y产生。图2c 显示了与负载分别与 a -Al2O3NPs (200nm 或 60nm)、锐钛矿 TiO2NPs (IOOnm 或25nm)和a -Fe2O3NPs (25nm)缀合的OVA抗原的树突状细胞相比，用只负载滴定量OVA抗原的树突状细胞刺激的T细胞的IL-2产生。图2d比较了在C57BL/6小鼠中皮下注射单独的OVA抗原(20 μ g或200 μ g)、缀合不同金属氧化物纳米颗粒(具体地，α -Al2O3NPs (200nm或60nm),锐钛矿TiO2NPs (IOOnm
或 25nm)或 a -Fe2O3NPs (25nm))的 OVA 抗原(20 μ g)或 OVA (20 [ig)/Imject@ 明矾佐
剂(Thermo Scientific)混合物6天后所测量的淋巴结(LN)和脾(SP)中交叉激活的Thyl.1+OT-1 CD8+T细胞占总细胞的百分比。*P〈0.05。图3显不了用未负载抗原(无Ag)的树突状细胞、只负载OVA抗原(0.1 μ g/mL)的树突状细胞、负载 a -Al2O3NP (60nm) -OVA (0.1 μ g/mL)缀合物或 a -Al2O3NPs 和OVA(0.1 μ g/mL)混合物的树突状细胞刺激60小时后分化的Thyl.1+OT-1⑶8+T细胞的百分比。图4显示了用只负载滴定量的OVA抗原(OVA)的树突状细胞、负载与a -Al2O3NPs缀合的OVA抗原(a-Al2O3NP (60nm)-0VA)的树突状细胞、负载OVA免疫复合物(OVA-1C)的树突状细胞或负载在lOOng/mL MPL (Avanti Polar Lipids, Inc.提供的TLR激动剂)存在下的0VA(0VA+MPL)的树突状细胞刺激60小时后分化的Thyl.1+OT-1⑶8+T细胞的百分比。图5a是负载a -Al2O3NP-OVA缀合物的DCs TEM图像，其显示a -Al2O3NP-OVA缀合物被内化入吞噬体、溶酶体和自噬体(通过它们的双层膜表征)。图5b显示了 3-MA、渥曼青霉素(两者均是自噬抑制剂)和NH4Cl (溶酶体阻滞剂)分别对sOVA和C1-Al2O3NP-OVA缀合物交叉呈递的影响。分化的Thyl.1+0T-1⑶8+T细胞的百分比相对于CFSE稀释度作图。图5c显示了基因Beclinl或Atgl2的敲低是自曬所需要的。图5d显示了 Beclinl或Atgl2敲低对自噬的抑制分别如何影响sOVA和C1-Al2O3NP-OVA缀合物的交叉呈递。用转染Beclinl、Atgl2或荧光素酶(对照)的siRNA的DCs刺激后分化的Thyl.1+OT-1⑶8+T细胞的百分比相对于CFSE稀释度作图。图5e分别比较了在摄取OVA和a -Al2O3NP-OVA缀合物后LC3II的产生。图5f显示了布雷非尔德菌素Α(内质网-高尔基体阻滞剂)分别对sOVA和a -Al2O3NP-OVA缀合物交叉呈递效率的影响。使用加载NH4Cl的DCs作为阳性对照。图5g显示了布雷非尔德菌素A(内质网-高尔基体阻滞剂)没有影响加载肽的DCs对初始OT-1 T细胞的刺激。图6阐明了提出的模型，S卩a-Al2O3NPs可如何将抗原从直接的内涵体/溶酶体降解转移至间接的内涵体/自噬体/溶酶体途径。图7a显示了在初次接受试验的小鼠或荷瘤小鼠接种a -Al2O3NP-OVA缀合物、单独的a -Al2O3NPs或与 明矾(Rehydragel )混合的可溶0VA7天后，小鼠脾中产生OVA特异性IFN- Y的CD8+T细胞的频率。图7b显示了在初次接受试验的小鼠或荷瘤小鼠接种a -Al2O3NP-OVA缀合物、单独的a -Al2O3NPs或与明fL(Rehydragel_ )混合的可溶OVA多达40天后的肿瘤尺寸。图8a显示了来自lewis肺癌细胞系(3LL)肿瘤细胞的分离的自噬体的SEM图像。插图显示了自噬体的TEM图像。图8b显示了 a -Al2O3NP-自噬体缀合物的SEM图像。图8c比较了负载OVA-自噬体的DCs与负载a -Al2O3NP-OVA-自噬体的DCs在体外交叉激活初始的Thyl.1+OT-1 CD8+T细胞的能力。图8d比较了在单独的自噬体有或没有共同给予抗-0X40抗体或仅单独给予抗-0X40抗体的情况下，在荷3LL肺肿瘤小鼠中a -Al2O3NP-自噬体缀合物的治疗效率。使用PBS作为对照。*Ρ〈0.05。详细描述癌症疫苗由明确的抗原或不明确的抗原组成。明确的抗原包括已知结构的抗原蛋白(已知的氨基酸序列和/或三维结构)或这些蛋白的抗原片段，其中纯化这些蛋白或片段，并将其并入疫苗。明确的抗原的例子包括组织特异性抗原，例如，黑色素瘤抗原gpioo和前列腺酸性磷酸酶(PAP);肿瘤特异性抗原，例如MAGE-3 ;和癌症/睾丸抗原，例如，NY-ES0-1。因此，明确的抗原可以指纯化形式的抗原蛋白(例如，天然存在的蛋白)。通过比较，具有不明确抗原的癌症疫苗包括还没有被完全表征的抗原蛋白。具有或不具有多种基因修饰物或与DCs的融合物的全部肿瘤细胞、或全部细胞的细胞成分，例如mRNA、分泌的小囊泡(外切体)、黑色素小体或其它组织特异性细胞器、自噬体(DRibbles)和包括这类不明确抗原蛋白的凋亡小体可以被纯化，并用作癌症疫苗。大多数癌症疫苗候选剂需要佐剂来激活天然免疫，克服自身抗原的免疫耐受，并产生强烈的适应性免疫应答。目前，铝盐(铝)例如氢氧化铝、磷酸铝和羟基磷酸铝化合物是用于人使用的FDA批准的疫苗中仅有的佐剂。然而，众所周知，铝盐诱导Th2型而不是Thl型免疫应答。通常地，Th2型免疫应答对抗细胞外细菌、寄生虫和毒素更有效，而Thl型免疫应答对抗细胞内病原体(例如，宿主细胞内的病毒)更有效。此外，已知铝盐通常是抗体应答诱导的强烈佐剂，但对于细胞介导的免疫应答是非常弱的佐剂。由于蛋白翻译中的错误或来自正常的翻译但错误折叠的蛋白，能够产生缺陷型核糖体产物(DRiPs)。DRiPs是免疫原性的，并且可以包括蛋白、肽和/或其片段。通常，DRiPs是短寿的，并且在它们合成大约30分钟内通过蛋白酶体降解。已显示，当用蛋白酶体抑制剂降低或抑制细胞蛋白降解时，细胞积累DRiPs并将其分泌入“小泡”结构。更具体地，已显示在溶酶体阻滞剂存在时抑制蛋白酶体活性将诱导短寿蛋白(SLiPs)如DRiPs的自噬和分泌入称为DRibbles的自噬小体(例如，自噬体)。自噬是细胞再循环途径，在该途径中，细胞质和细胞器被吞入称为自噬体的双膜小囊泡内，随后自噬体与溶酶体融合从而降解。 DRiPs即使被高水平合成，其也能在被递送至抗原呈递细胞用于交叉呈递前迅速破坏，已经证明，与DRiPs相比，DRibbles,即含有SLiPs (例如DRiPs及其免疫原性片段)的自噬体，如果在与溶酶体融合前分离或通过溶酶体抑制剂阻止融合，就能够作为抗原呈递细胞交叉呈递的前体或激活剂。DRibbles作为免疫原性试剂包括作为癌症疫苗的潜在用途已描述于 Li et al., Cancer Res.，68:6889-6895 (2008)和国际公开号 TO2007/016340中，二者均通过引用并入本文。药剂或药有时与佐剂联合给药。佐剂是改良另一种试剂效应的试剂，而在独自给予时即使有任何直接的效应也是很小的。免疫佐剂是当其与免疫原性试剂联合使用时能改变(通常提高)受试者的免疫应答的试剂。出乎意料地，发明人还发现与单独的DRibbles相比，将DRibbles(例如，封装DRiPs的自噬体)与直径小于大约150nm(例如，范围从大约5nm至大约IOOnm)的氧化铝纳米颗粒缀合能提供增强的或提高的细胞介导的免疫应答。不希望受任何具体理论的束缚，认为本发明的纳米颗粒-自噬体缀合物通过提高交叉呈递和交叉激活的效率诱导更强的细胞溶解性T细胞介导的免疫应答。与明矾佐剂相比，发明人发现本文的纳米颗粒-自噬体缀合物能在体内诱导明显更强的T细胞增殖，如通过动物模型中很高数量的Thyl.1+OT-1CD8+T细胞所证实的。不像氢氧化铝，当其与蛋白抗原混合时形成较大的沉淀(ym)，本发明的纳米颗粒-自噬体缀合物的尺寸还可以如下文所述进行控制。此外，发明人惊奇地发现，尽管自噬体与直径大于150nm的氧化铝纳米颗粒缀合在体外诱导了强烈的T细胞增殖，然而在体内则未观察到同样的效应，这表明使用直径大于大约150nm的氧化铝纳米颗的缀合物在体内不能交叉激活初始T细胞。此外，在肺癌和乳腺癌的临床前动物肿瘤模型中，发明人发现与未缀合的(裸露的)自噬体相比，负载本发明纳米颗粒-自噬体缀合物的树突状细胞(DC)明显更有效地介导已建立的肿瘤的消退。此外，与只给予化学治疗剂(例如抗0X40抗体)相比，在存在本发明的纳米颗粒-自噬体缀合物的情况下给予化学治疗剂时，化学治疗剂能更有效地介导已建立良好的肿瘤的消退(在肺癌动物模型中显示)。根据这些观察结果，本发明涉及能用于刺激针对靶抗原的免疫应答的纳米颗粒-自噬体缀合物，这些纳米颗粒-自噬体缀合物的制备以及包含这些纳米颗粒-自噬体缀合物的免疫原性组合物。此外，本发明涉及刺激针对肿瘤特异的DRiP(或SLiP)抗原或病原体特异的DRiP(或SLiP)抗原的免疫应答的方法。在具体的例子中，这些方法在癌症受试者中诱导CD4+和CD8+肿瘤特异性T细胞的快速扩增或在受试者(例如感染病原体的受试者)中诱导CD4和CD8病原体特异性T细胞的大量扩增。在整篇申请中，如果组合物被描述为具有、包括、包含具体的组分，或方法被描述为具有、包括、包含具体的方法步骤，则还考虑本发明的组合物基本上由所列举的组分组成或由所列举的组分组成，并且还考虑本发明的方法基本上由所列举的方法步骤或由所列举的方法步骤组成。在本申请中，如果元件或组分被描述为包括在所列举的元件或组分列表中和/或选自所列举的元件或组分列表，应当理解为，所述元件或组分可以是所列举的元件或组分中的任意一种，或者所述元件或组分可以选自所记载的元件或组分中的两种或更多种。进一步，应当理解，可以以多种方式组合本文描述的组合物、装置或方法的元件和/或特征，而不脱离本发明的精神和范围，无论本文是明示还是暗示。除非明确说明并非如此，否则使用的术语“包括(include) ”、“包括(includes) ”、“包括(including) ”、“具有(have)”、“具有(has)”或“具有(having) ”通常理解为开放式的和非限制性的。除非明确说明并非如此，否则本文使用的单数包括复数(反之亦然)。此外，除非明确说明并非如此，如果 在数值之前使用术语“大约”，则本发明还包括具体的数值本身。除非另有说明或推断，本文使用术语“大约”或符号“ ”是指正常值土 10%的变化。应当理解，只要本发明保持可操作性，步骤的顺序或用于进行某些操作的顺序是不重要的。而且，可以同时进行两个或更多的步骤或操作。产生DRibbles的方法可以从任何类型的能够产生DRiPs或SLiPs的细胞中产生DRibbles，例如哺乳动物细胞。这种细胞的例子包括但不限于，肿瘤细胞和感染一种或多种病原体的细胞。通常，在足以产生Dribbles的条件(例如大幅度地抑制细胞内的蛋白降解的条件)下，将细胞与足量的蛋白酶体抑制剂接触(孵育)。例如，可以将细胞与蛋白酶体抑制剂接触至少4小时、至少6小时、至少12小时、至少18小时或至少24小时，例如4_24小时、6-24小时、12-24小时或12-18小时。在一些实施方案中，在足以诱导细胞自噬的条件下，任选地，将细胞与足量的自噬诱导剂孵育，。例如，在蛋白酶体抑制剂之前、期间或之后，将细胞与自噬诱导剂接触。在某些实施方案中，可以将细胞与蛋白酶体抑制剂及阻止溶酶体融合和酸化的试剂(即NH4Cl或氯喹)共同接触至少4小时(例如至少6小时或至少24小时)，之后与自噬诱导剂接触至少4小时，例如至少12小时或至少18小时。任选地，还可以在足以刺激或甚至提高细胞产生DRibbles的条件下，将细胞与其它试剂接触，例如足量的蛋白酶体抑制剂和一种或多种能降低蛋白糖基化作用的试剂(例如核苷酸转位酶I抑制剂，如胞质霉素、衣霉素、脂硫霉素或它们的组合)。在某些实施方案中，在足以刺激或甚至提高细胞产生DRibbles的条件下，将细胞与足量的蛋白酶体抑制剂(例如至少20nM万珂)、自噬诱导剂(例如雷帕霉素或HBSS)和NH4Cl接触。可以在体内、离体或通过体内和离体方法的组合产生DRibb I e s。例如，可以通过给予受试者治疗有效量的一种或多种蛋白酶体抑制剂(单独或与其它试剂组合，例如自噬诱导剂或衣霉素或氯喹)在体内产生DRibbles，所述治疗有效量例如足以产生DRibbles的量(例如大幅度地抑制肿瘤细胞或感染病原体的细胞内的蛋白降解的量)。给予蛋白酶体抑制剂的量优选是不显著地诱导细胞(例如肿瘤细胞)凋亡的剂量。在另一个例子中，通过将足量的一种或多种蛋白酶体抑制剂(单独或与其它试剂组合，例如自噬诱导剂、衣霉素或氯喹)与培养中生长的细胞孵育，离体产生DRibbles，所述足量例如足以产生DRibbles的量(例如，大幅度地抑制细胞内的蛋白降解的量)。可以从细胞中分离(收获)、然后收集通过本文描述的方法产生的DRibbles。在具体的实施方案中，从细胞和细胞碎片中分离DRibbles导致分离的DRibbles群，例如群体是至少50%纯(即按总细胞物质重量计，含有50%DRibbles)的，例如，至少90%纯的、至少95%纯的或至少99%纯的。如本文所用的，“分离的”生物组分已基本上从该组分天然存在的生物体(或细胞)的其它生物组分分离或纯化。因此，“分离的”DRibbles是已基本上从其它生物组分(例如整个细胞或大细胞碎片)分离或纯化的。离体产生纯化的DRibbles群体的一个具体示例性方法包括，在足以大幅度地抑制细胞内的蛋白降解的条件下，将细胞与足量的包含白酶体抑制剂的组合物接触，例如孵育大约6-24小时。随后在足以诱导细胞自噬的条件下，孵育细胞，例如与自噬诱导剂孵育大约6-24小时。在沉淀细胞而非Dribbles的条件下,对获得的细胞和Dribbles进行离心。在足以沉淀Dribbles的条件下，对含有DRibbles的上清液进行离心。收集所得到的含有纯化的DRibbles群的沉淀。DRibbles能立即用于缀合或冷冻保存以便后期使用。来自肿瘤细胞的DRibbles在一些实施方案中，通过哺乳动物肿瘤细胞产生DRibbles，例如来自血液肿瘤或实体肿瘤的细胞。在某些实施方案中，细胞是人癌症细胞。在具体的实施方案中，从肿瘤细胞中离体产生DRibbIes,所述肿瘤细胞从待治疗的受试者中获得。可以使用本领域已知的方法从受试者中获得肿瘤细胞，例如从手术取出的肿瘤或从活检样本(例如针吸出的肿瘤)。例如，肿瘤细胞可以获自受试者，并使用本领域已知的组织培养方法长成原代培养物。理想地，原发的肿瘤细胞能在培养中较好地生长和扩增，或者获得的肿瘤样本是大量的，使得足量的细胞(例如至少I百万细胞)能用于产生DRibble。在培养中生长良好或倾向于产生具有很多细胞的大尺寸肿瘤(使得能够使用原代培养物)的肿瘤的例子包括白血病、淋巴瘤、黑色素瘤、肺癌、卵巢癌、胃癌、结肠癌和肾细胞癌。然而，一些原发肿瘤细胞难以在培养中生长或扩增。对于这些肿瘤细胞，可以使用与受试者中所存在的相同类型的肿瘤的已建立好的细胞系，或者可以通过化学治疗、放疗或其它干预措施诱导肿瘤细胞自噬而在体内产生DRibbles。其细胞难以在培养中生长的肿瘤的例子包括乳腺癌和前列腺癌。来自癌细胞系的DRibbles 例如，如果受试者患有乳腺癌，其细胞不能在培养中良好生长，可以从另一位受试者已建立的乳腺癌细胞系中产生DRibbles。这些细胞系的例子是本领域中已知的，例如乳腺癌MDA-MB-231和如列腺癌PC3和LNCap。来自感染细胞的DRibbles在一些实施方案中，可以从感染一种或多种病原体的哺乳动物细胞或感染载体(例如质粒或病毒载体)的细胞中离体产生DRibbles，所述载体包含编码病原体抗原的核酸分子。示例性病原体包括病毒、细菌、真菌、原生动物和它们的组合。例如，病毒包括正链RNA病毒和负链RNA病毒。不例性的正链RNA病毒包括但不限于,小核糖核酸病毒(例如长尾病毒科，例如口蹄疫病毒(FMDV))、Cardioviridae ;肠道病毒科(例如，柯萨奇病毒、艾柯病毒、肠道病毒和脊髓灰质炎病毒)；鼻病毒科(鼻病毒)；甲型肝炎病毒科(甲型肝炎病毒)；外衣病毒(例子包括风疹；阿尔法病毒(例如西方马脑炎病毒、东方马脑炎病毒和委内瑞拉马脑炎病毒))；黄病毒(例子包括登革病毒、西尼罗病毒和日本脑炎病毒)；以及冠状病毒(例子包括SARS冠状病毒，例如厄巴尼株)。不例性的负链RNA病毒包括但不限于，正粘病毒(例如流感病毒)、弹状病毒(例如狂犬病病毒)和副粘病毒(例子包括麻疹病毒和呼吸道合胞体病毒)。病毒还包括DNA病毒。DNA病毒包括但不限于，乙型肝炎病毒,疱疫病毒例如水痘带状疱疹病毒，例如Oka株、巨细胞病毒、以及I型和2型单纯性疱疹病毒。另一组病毒包括逆转录病毒。逆转录病毒的例子包括但不限于I型人类免疫缺陷病毒(HIV-1)，例如C亚型、HIV-2 ;马传染性贫血病毒；猫免疫缺陷病毒(FIV);猫白血病病毒(FeLV);猿猴免疫缺陷病毒(SIV)和禽类肉瘤病毒。另一类病原体是细菌。细菌可被分为革兰氏阴性的或革兰氏阳性的。示例性革兰氏阴性细菌包括但不限于，大肠杆菌(K-12和0157:H7)和志贺氏痢疾杆菌。示例性革兰氏阳性细菌包括但不限于，炭疽芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、肺炎双球菌、淋球菌、链球菌性脑膜炎和结核分枝杆菌。原生动物和 真菌是另一类病原体。示例性原生动物包括但不限于疟原虫、利什曼原虫、棘阿米巴、贾第虫、内阿米巴、隐孢子虫、等孢球虫、结肠小袋纤毛虫、滴虫、锥虫、福氏耐格里和弓形虫。示例性真菌包括但不限于，白色念珠菌、隐球菌、粗球类芽生菌和皮炎芽生菌。为了体力产生来自感染细胞的DRibbles，可以使用病原体感染细胞(例如体外)，并使用感染的细胞产生DRibbles。感染的具体细胞类型可以依赖于所使用的病原体。已知用具体的病原体感染细胞的方法。通常，方法包括在足以使病原体感染细胞的条件下，孵育能够被病原体感染的细胞。在一些实施方案中，在37°C下，将病原体与细胞在培养液中。C孵育至少30分钟，例如至少60分钟。通过洗涤细胞可以除去未感染细胞的病原体。尽管本文提供了具体的例子，本领域的技术人员应了解，可以使用细胞和病原体的其它组合。在一个实施方案中，可以使用结核分枝杆菌感染巨曬细胞(例如从PBMCs获得的巨噬细胞)，例如使用文献描述的方法(见例如，Li et al., Infect.1mmun.70:6223-30,2002)。在另一个实施方案中，可以使用疟原虫属原生动物(如恶性疟原虫)感染红细胞或肝细胞。在另一个实施方案中，能够使用组织胞浆菌或隐球菌真菌感染巨核细胞。在另一个实施方案中，可以使用HIV感染上皮细胞或淋巴细胞。然后，可以将感染的细胞与足量的蛋白酶体抑制剂(单独或在其它试剂存在时，例如自噬诱导剂、衣霉素或NH4Cl)孵育，例如在足以大幅度地抑制蛋白降解的条件下，从而允许细胞产生DRibbles。蛋白酶体抑制剂蛋白酶体抑制剂是能降低和在一些情况下能消除蛋白酶体介导的分解代谢途径的试剂，该途径降解细胞内蛋白，例如泛素化的蛋白。在具体的例子中，这些蛋白酶体抑制剂阻断I类MHC抗原加工途径。蛋白酶体抑制剂可以是可逆的(例如MG132)或不可逆的(例如乳胞素和环氧酶素)。蛋白酶体抑制剂的具体例子是肽硼酸酯和酸性化合物。示例性蛋白酶体抑制包括但不限于，节氧擬基_L_売氨酸-L-売氨酸-L-売氨酸缩醒(MG-132)、节氧擬基-L-売氨酰-L-亮氨酰-L-正缬氨酸缩醛(MG-115)、环氧酶素、N-苄氧羰酰基-L-亮氨酰-L-亮氨酰-L-亮氨酰硼酸(MG-262)、N-苄氧羰酰基-异亮氨酰-谷氨酰(O-叔丁基)_丙氨酰-亮氨酸缩醛(PSI及其环氧化物 )、N-乙酰-亮氨酰-亮氨酰-正亮氨酸缩醛(MG-101、ALLN或钙蛋白酶抑制剂I)、MLN519、N-吡嗪羰酰-L-苯丙氨酰-L-亮氨酸硼酸(硼替佐米、PS-341 或 VELCADE)，乳胞素(Calbiochem-Novobiochem C0.，La Jolla, Calif.)、PS-273,N-乙酰-亮氨酰-亮氨酰-蛋氨酸(ALLM或钙蛋白酶抑制剂II)、N-甲苯磺酰-赖氨酰-氯甲基酮(TLCK)、N-甲苯磺酰-苯丙氨酰-氯甲基酮(TPCK)、四氢吡咯二硫代氨基甲酸酯(PDTC)、[2S, 3S]-反式-环氧琥珀酰-L-亮氨酰氨基-3-甲基丁烷乙基酯(EST)和己酮可可碱(PTX)。可以在不同浓度下，在大幅度地抑制细胞内的蛋白降解(例如将这种降解抑制至少90%)，从而允许细胞形成DRibbles的条件下，使用蛋白酶体抑制剂。在具体的例子中，在半致死量下使用蛋白酶体抑制剂，例如不显著诱导细胞凋亡的浓度，例如与在无蛋白酶体抑制剂时细胞凋亡量相比，不诱导多于10%的细胞凋亡。这与目前给予肿瘤受试者的蛋白酶体抑制剂的量形成对比，其中给予蛋白酶体抑制剂导致肿瘤细胞凋亡。根据本发明，用于产生DRibbles的蛋白酶体抑制剂的浓度低于这些量，这样肿瘤细胞产生DRibbles，并且随后能被肿瘤特异性T细胞杀死。在一些实施方案中，可以通过将细胞与一种或多种蛋白酶体抑制剂接触至少6小时(例如至少8小时、至少12小时或甚至至少16小时，例如过夜处理)来产生DRibbles。可以利用本领域技术人员已知的方法确定适当的浓度和孵育条件。自噬诱导剂可以通过以下来诱导自噬:使细胞营养缺乏(例如通过在HBSS中孵育)、在缺血条件下孵育细胞、使细胞遭受导致细胞器增殖的刺激和/或将细胞用能够抑制蛋白酶体功能的试剂孵育延长的一段时间(例如在20-1000nMVELCADE、他莫昔芬、雷帕霉素(例如InM-1OOnM),长春新碱(例如5-100mg硫酸长春碱/kg体重、例如50mg硫酸长春碱/kg体重)和IFN-Y (例如10-1000U/ml)中孵育细胞)。可以在不同浓度下，在大幅度地诱导细胞自噬，从而允许细胞形成自噬小体的条件下，使用自噬诱导剂。当细胞与自噬诱导剂接触时，自噬速率增加。确定是否已诱导自噬的方法是本领域内已知的。在一些实施方案中，可以通过将细胞与一种或多种蛋白酶体抑制剂接触至少6小时(例如至少48小时)，然后将细胞与一种或多种自噬诱导剂接触至少6小时(例如至少18小时)来产生DRibbles。可以利用本领域技术人员已知的方法确定适当的浓度和孵育条件。收获DRibbles
收获DRibbles可以包括从细胞中分离DRibbles，例如通过收集分泌的DRibbles，通过裂解细胞并收集细胞内的DRibbles或它们的组合。例如，可以分离细胞分泌到细胞培养液中的DRibbles。在一些实施方案中，可以使用离心方法。例如，可以在足以沉淀整个细胞和大的细胞碎片但不沉淀DRibbles的条件下(例如通过低速离心)，对细胞和培养液进行离心。可以使用整个细胞的沉淀获得细胞内的DRibbles。可以在足以沉淀DRibbles的条件下(例如高速离心)，对得到的含有Dribbles的上清进行离心。在一些实施方案中，可以通过在Percoll胶体密度梯度中超速离心进一步纯化利用上述低速和高速离心获得的Dribble沉淀。例如，将DRibble沉淀放置在21ml含有33%Percoll的PBS的不连续梯度上，并在SW28转头中于72，OOOg离心30分钟，所述不连续梯度在7ml含有22.5%Nycodenz的PBS (1.127g/ml)上。自噬小体(包括自噬体，例如DRibbles)将在下面的界面形成条带，而凋亡小体或释放的线粒体将在管的底部形成沉淀。其它轻的膜性物，例如内质网(ER)和血浆膜碎片将在上面的界面形成条带。例如，还可以通过裂解细胞并从其它细胞碎片中大量分离DRibbles来获得细胞内的 DRibbles。如本文所使用的，“纯化的”不需要绝对的纯度；而是其意图作为一个相对的术语。因而，例如，纯化的细胞是其中细胞比在自然环境中(例如在生物体内)的细胞更纯的细胞。同样地，纯化的DRibble是其中DRibble比在自然环境中(例如在细胞内或培养液中)的DRibble更纯的DRibble。在具体的例子中，纯化的DRibbles群是指至少75%纯、至少80%纯、至少90%纯、至少95%纯、至少97%纯、至少98%纯或至少99%纯的DRibbles群。在一个例子中，基本纯化的DRibbles群由至少95%的DRibbles组成，即DRibbles群包括少于5%的整个细胞或大细胞碎片。与对照相比，可以根据尺寸或通过刺激具体免疫应答的能力测量DRibbles群的纯度(例如如通过ELISA测定所测量的)。在具体的实施方案中，所得到的基本上分离的DRibbles群是至少70%纯(即按细胞物质总量的重量计，包含70%DRibbles)，例如至少80%纯、至少90%纯、至少95%纯或甚至至少99%纯的。DRibbles可立即用于缀合或冷冻保存(例如在大约_20°C至大约_80°C的温度下)直至使用。在一些实施方案中，可以在存在DMSO的条件下保存分离的DRibbles。分离的DRibbles如本文所使用的，分离的DRibbles或分离的自噬体可以指基本上纯化的，例如至少70%纯、至少80%纯、至少90%纯或甚至至少95%纯的分离的DRibbles或自噬体群。在一些实施方案中，可以冷冻分离的DRibbles群，例如在至少10%DMS0的存在下。氧化铝纳米颗粒适合作为本文纳米颗粒-抗原缀合物的一部分使用的氧化铝纳米颗粒通常具有大约5nm至大约150nm的直径。如实施例4中所示,显示直径为大约200nm的氧化招纳米颗粒不能在体内刺激T细胞介导的免疫应答。因此，本发明中使用的氧化铝纳米颗粒通常具有小于大约150nm的直径,例如，具有大约5nm至大约120nm、大约5nm至大约lOOnm、大约IOnm至大约lOOnm、大约IOnm至大约90nm、大约IOnm至大约80nm、大约IOnm至大约75nm、大约IOnm至大约70nm、大约IOnm至大约60nm、大约IOnm至大约50nm、大约IOnm至大约40nm或大约IOnm至大约30nm的直径。在某些实施方案中，本文缀合物的氧化招纳米颗粒具有大约75nm的直径。在某些实施方案中，本文缀合物的氧化铝纳米颗粒具有大约60nm的直径。就组合物而言，如通过以下实施例3和4中的数据所证明的，除氧化铝之外的金属氧化物纳米颗粒，无论它们的尺寸如何，均被证实不能有效地在体内淋巴结或脾中诱导T细胞增殖。此外，不像本文的氧化铝生物缀合物，这些其它金属氧化物生物缀合物还不能刺激细胞因子的有效产生。可以通过本领域中已知的多种方法合成适用于本文生物缀合物的氧化铝纳米颗粒，例如化学沉淀/共沉淀、水热合成、物理气相沉积、化学气相沉积、火焰喷雾合成、燃烧、激光热解、溶胶-凝胶合成、微乳化作用、超生化学合成等。在优选的实施方案中，通过这样的方法合成氧化铝纳米颗粒，该方法允许控制颗粒大小并能提供高纯度(例如选择的结晶相)和窄尺寸分布的氧化铝纳米颗粒。α -氧化铝(a -Al2O3)纳米颗粒在优选的实施方案中，在本文的缀合物中使用C1-Al2O3纳米颗粒。发明人发现可以使用Q-Al2O3纳米颗粒，来促进抗原呈递细胞的抗原交叉呈递。例如，发现将卵白蛋白(OVA)与C1-Al2O3纳米颗粒缀合，导致在体外有效的OVA抗原交叉呈递(参见实施例3)。同样地，发现与加载可溶OVA的DCs相比，负载a -Al2O3纳米颗粒(60nm) -OVA缀合物的DCs在体外和体内均更有效地将OVA抗原交叉呈递给初始T细胞(参见实施例4)。不希望受任何具体理论的束缚，认为增强的细胞免疫应答通过a -Al2O3纳米颗粒( IO-1OOnm)，在缀合时，从内涵体至溶酶体蛋白降解途径(肽抗原通常的降解途径)到内涵体至自噬体蛋白降解途径偏离抗原的能力来实现。

因此，除自噬体之外，可以将其它抗原(例如多种蛋白或肽抗原)与直径范围为大约5nm至大约150nm(例如范围为大约IOnm至大约IOOnm)的a-Al2O3纳米颗粒缀合,其中通过抗原呈递细胞更有效地交叉呈递这些抗原，所得的缀合物能够诱导增加的或提高的T细胞介导的免疫应答。例如，代替本文所述的自噬体(即含有DRiPs或SLiPs的DRibble)，直接范围为大约5nm至大约150nm的a-Al2O3纳米颗粒可以用于与DRiP、SLiP或它们的免疫原性片段缀合。直接范围为大约5nm至大约150nm的a-Al2O3纳米颗粒还可以用于与整个肿瘤细胞缀合，其中如前文所述获得所述整个肿瘤细胞。此外，尽管在本文多个例子中使用DCs来示例抗原呈递细胞(APC)、然而其它APCs的例子包括单核细胞、巨噬细胞、B细胞和胰岛细胞。抗原呈递细胞在其表面携带与I型MHC或II型MHC分子结合的抗原，并将这种情况下的抗原呈递至T细胞。因此，可将本发明更广泛地延伸至纳米颗粒-抗原缀合物，其中纳米颗粒以及纳米颗粒与抗原间的缀合化学如本文描述与纳米颗粒-自噬体缀合物一致。在一些实施方案中，纳米颗粒-抗原缀合物包括肿瘤特异性抗原或病原体特异性抗原。在某些实施方案中，纳米颗粒-抗原缀合物可以包括整个肿瘤细胞，其中所述整个肿瘤细胞充当抗原。在其它的实施方案中，纳米颗粒-抗原缀合物可以包括来自肿瘤细胞的物质，例如DRiP、SLiP或其免疫原性片段。在某些实施方案中，纳米颗粒-抗原缀合物可以包括肿瘤特异的或病原体特异的DRiP (或它们的免疫原性片段)。本文所述的纳米颗粒-抗原缀合物通常能够诱导比B细胞应答(导致产生针对抗原的特定抗体)更显著的T细胞应答(例如CD4+应答或CD8+应答)。纳米颗粒自噬体缀合物可以通过本领域中已知的多种偶联反应制备纳米颗粒-自噬体缀合物。例如，可以使用醛-胺、磷化氢-胺、顺丁烯二酰亚胺-硫醇、醛-肼、叠氮炔烃Huisgen环加成反应(点击化学)、偶联或内含肽介导的蛋白连接。在多个实施方案中，氧化铝纳米颗粒的表面可以用反应性基团(例如NH2、C00_、0H和SH)修饰或官能化，然后任选地进一步用交联剂修饰，所述交联剂具有能与自噬体的膜蛋白或膜脂反应的末端官能团。在一些实施方案中，还可以使用交联剂修饰自噬体。在某些实施方案中，使用不同的异双官能交联剂修饰氧化铝纳米颗粒和自噬体，每一种异双官能交联剂包括允许氧化铝纳米颗粒和自噬体彼此特异性地反应的末端官能团。在某些实施方案中，可以通过一种或多种不包括硫醚键的交联剂将自噬体连接于纳米颗粒的表面。尽管涉及额外的步骤，使用纳米颗粒和自噬体间的多步偶联反应能带来几点好处。例如，通过交联剂官能化自噬体，可在任选的纯化步骤中除去未官能化的自噬体，因此增加了与活化纳米颗粒反应的 产量。通过改变在纳米颗粒表面修饰步骤中使用的活化剂和/或交联剂的摩尔量，可以控制纳米颗粒的表面包装密度并依次控制纳米颗粒-自噬体缀合物的尺寸。在具体的实施方案中，可以通过腙键(-NH-N=CR-)将自噬体连接于氧化铝纳米颗粒。可以用一种或多种苯甲醛基团活化氧化铝纳米颗粒的表面，而可以用肼官能团使自噬体官能化。在中性PH下肼和醛基团间发生反应后，通过腙键将一种或多种自噬体连接于氧化铝纳米颗粒的表面。更具体地，氧化铝纳米颗粒的表面可以首先在去离子水中通过纳米颗粒与胺(例如4-氨基苯酚)反应，用胺基团活化。然后活化的纳米颗粒可以用含醛交联剂(例如琥珀酰亚胺基4-甲酰基苯甲酸酯(SFB))修饰。自噬体可以用含肼的交联剂(例如琥珀酰亚胺基4-肼基烟酸盐丙酮腙(SANH))修饰。所得到的连接自噬体与氧化铝纳米颗粒的腙键在中性pH下是稳定的，但是酸敏感的。因此，纳米颗粒-自噬体缀合物在中性PH下具有良好的保质期，即使用前可以在中性PH下储存更长的时间段(3个月或更长)；但给予受试者后，缀合物可被溶酶体迅速溶解，并释放活性，免疫原性的自噬体。从颗粒中如何轻易地释放抗原将决定抗原呈递的效率。免疫原性组合物本发明提供了免疫原性组合物和产生这类组合物的方法。免疫原性组合物是那些能够通过受试者的免疫系统刺激或引起免疫应答的组合物，例如刺激受试者中T细胞应答的产生，例如针对肿瘤相关抗原或病原体相关抗原(例如病毒相关抗原)的T细胞应答。示例性免疫原性组合物包括疫苗，其能用于预防或治疗。在多个例子中，本发明的免疫原性组合物可以包括本文所述的一种或多种纳米颗粒-抗原缀合物，本文所述的负载一种或多种纳米颗粒-抗原缀合物的抗原呈递细胞(负载缀合物的APCs)和它们的组合。除了纳米颗粒-抗原缀合物和/或负载缀合物的APCs之外，本文的免疫原性组合物可以包括其它试剂，例如一种或多种药学上可接受的载体、免疫刺激剂、抗肿瘤化学治疗剂或它们的组合。免疫刺激剂一个具体的例子是抗0X-40抗体。另一个例子是ssRNA，例如ssRNA单链寡核糖核苷酸。另一个例子是细胞因子，例如GM-CSF。在一些实施方案中，免疫原性组合物通过以下产生:使用本文所述的方法产生纳米颗粒-自噬体缀合物群，然后制备包含纳米颗粒-自噬体缀合物的组合物。免疫原性组合物可以包括悬浮于药学上可接受的流体载体中的纳米颗粒-自噬体缀合物群。在一些实施方案中，产生免疫原性组合物的方法包括将纳米颗粒-自噬体缀合物群与抗原呈递细胞(APC)接触(孵育)，从而产生包含负载缀合物的APCs的免疫原性组合物。在具体的例子中，从缀合物中分离负载缀合物的APCs (例如通过清洗负载缀合物的APC)，并且分离的负载缀合物的APCs形成免疫原性组合物。在具体的实施方案中，抗原呈递细胞是树突状细胞(DC)，免疫原性组合物包含负载缀合物的DCs。从受试者中获得或产生APCs的方法在本领域中是已知的。例如，可以从哺乳动物血液样品中获得APCs。更具体地，可以培养从血液样品中获得的单核细胞来产生DCs。在具体的例子中，从受试者中获得APCs (或其前体)，在所述受试者中，在给予免疫原性组合物前刺激免疫应答。例如，方法可以包括从受试者中分离外周血单核细胞(PBMCs)，其中PBMCs用于获得或产生APCs。在具体的例子中，将本发明的纳米颗粒-自噬体缀合物与APCs孵育来产生负载缀合物的APCs。然后，将这些负载缀合物的DCs群悬浮于药学上可接受的流体载体，来提供免疫原性组合物。多种药学上可接受的流体载体是本领域中已知的。通常，流体载体的特性依赖于所用的具体给药模式。例如，肠胃外制剂可以包含可注射的液体，所述可注射的液体包括药学上和生理上可接受的液体，例如水、生理盐水、平衡盐溶液、葡萄糖水溶液、甘油或类似物作为介质。除了生物学中性载体，所给予的药物组合物可以含有少量的非毒性辅助物质，例如润湿剂或乳化剂、防腐剂和PH缓冲试剂等，例如，醋酸钠或去水山梨糖醇月桂酸酯、乳酸钠、氯化钾、氯化钙和油酸三乙醇胺。例如，本文所述的免疫原性组合物可以包含选自盐、电解质水溶液和缓冲水溶液的药学上可接受的流体载体。给药如本文所使用的，术语“给药”是指通过任何有效的途径提供或给予受试者试剂(例如本文公开的免疫原性组合物)的行为。示例性的给药途径包括但不限于口腔、注射(例如皮下注射，肌肉注射，皮内注射，腹膜内注射和静脉注射)、舌下、直肠、经皮、鼻内、阴道和吸入途径。如本文所使用的，“受试者”可以是任何活的多细胞脊椎生物，尤其是哺乳动物。在多个实施方案中，受试者可以是人或非人的哺乳动物(例如实验室或兽医受试者)。可以使用任何给药方式给予治疗剂，例如本文公开的纳米颗粒-抗原缀合物(例如a -Al2O3纳米颗粒-自噬体缀合物)和免疫原性组合物。在本领域技术人员，例如治疗医生，能决定合适的给药途径。在一些实施方案中，免疫原性组合物给药是皮下或皮内给药。在另一个例子中，淋巴细胞清除剂给药是静脉内给药。 可以以治疗有效量给予受试者缀合物和免疫原性组合物。如本文所使用的，“治疗有效量”是指单独或与药学上接受载体或一种或多种其它治疗剂共同诱导期望的应答的试剂的量。可以以刺激防护性免疫应答，例如针对靶抗原的防护性免疫应答的治疗有效量给予治疗剂，例如包含本文的纳米颗粒-自噬体缀合物的免疫原性组合物。可以以多种不同的方法确定治疗剂的最小治疗有效量，例如通过测定免疫应答的增加，例如通过测定患有疾病(例如肿瘤或病原体感染)的受试者生理状态的改善。还可以通过多种体外、体内或原位测定确定治疗有效量。
可以以单一剂量或数次剂量给予治疗剂，例如在治疗过程中每周一次、每月一次或每两月一次。然而，治疗剂的治疗有效量可以依赖于应用的来源、接受治疗的受试者、接受治疗的疾病状况的严重程度和类型及给药方式。在一个例子中，其是足以部分地或完全地减轻受试者传染病的症状或降低病原体感染的量。治疗可以包括仅暂时地减缓疾病进程，但还可以包括永久地停止或逆转疾病的进程，以及首先预防疾病。例如，药物制剂能减轻传染病的一种或多种症状，例如与无药物制剂的量相比，减轻症状至少20%、至少50%、至少70%、至少90%、至少98%或甚至至少100%。在另一个例子中，其是足以部分地或完全地减轻受试者的肿瘤症状的量。治疗可以包括仅暂时地减缓肿瘤进程，但还可以包括永久地停止或逆转肿瘤的进程。例如，药物制剂能减轻肿瘤的一种或多种症状(例如肿瘤尺寸或肿瘤数量)，例如与无药物制剂的量相t匕，减轻症状至少20%、至少50%、至少70%、至少90%、至少98%或甚至至少100%。因此，在某些实施方案中，以单一的单位剂量给予治疗有效量的本文的免疫原性组合物。如本文所使用的，“单位剂量”是指物理离散的单位，其含有经计算以单独地或共同地产生期望的效应，例如免疫原性效应的预定量的活性试剂。可以使用单一单位剂量或多单位剂量来提供期望的效应，例如免疫原性效应。在某些实施方案中，以至少两个单位剂量(例如至少三个单位剂量、四个单位剂量或五个单位剂量)给予治疗有效量的本文的免疫原性组合物，，超过至少60天、至少90天、至少180天或至少365天。刺激针对肿瘤的免疫应答在一些实施方案中，可以使用本文的缀合物、负载缀合物的APCs和/或包含本文的缀合物和/或负载缀合物的APCs的免疫原性组合物，来刺激针对肿瘤(例如来自肿瘤的DRiPs)的免疫应答。非限制性的肿瘤包括良性肿瘤，例如垂体腺瘤和胃肠腺瘤性息肉。示例性恶性肿瘤包括但不限于乳腺癌、肺癌、肾细胞癌或肝癌。肿瘤可以是实体的或血液的。血液肿瘤的例子包括但不限于白血病，包括急性白血病(例如急性淋巴细胞白血病、急性髓细胞白血病、急性 骨髓性白血病和成髓细胞、早幼粒细胞、髓单核细胞、单核细胞和红白血病)、慢性白血病(例如慢性骨髓性白血病和慢性淋巴细胞白血病)、骨髓增生异常综合症和骨髓发育不良、真性红细胞增多症、淋巴瘤(例如霍奇金病、全部形式的非霍奇金淋巴瘤)、多发性骨髓瘤、瓦氏巨球蛋白血症和重链病。实体瘤例如肉瘤和癌的例子,包括但不限于纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肉瘤、软骨肉瘤、骨源性肉瘤和其它肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤因瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、胰腺癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、前列腺癌、肝细胞癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝癌、胆管癌、绒毛膜癌、肾母细胞瘤、宫颈癌、睾丸肿瘤、膀胱癌、黑色素瘤和CNS肿瘤(例如神经胶质瘤、星细胞瘤、成神经管细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、成血管细胞瘤、听神经瘤、少突胶质瘤、脑膜瘤、脑膜瘤、成神经细胞瘤和视网膜母细胞瘤)。尽管肿瘤细胞产生DRiPs，由于其通过蛋白酶体迅速降解，DRiPs不能被有效地交叉呈递。因为大多数肿瘤细胞在其表面表达I型MHC而不是II型分子，并且因为交叉呈递偏爱长寿蛋白并且漏掉DRiPs和SLiPs，所以肿瘤细胞所呈现的很大一批抗原内容不能通过APCs交叉呈递。相比之下，肿瘤细胞产生的DRibbles由于与蛋白酶体抑制剂和溶酶体阻滞剂(例如与自噬诱导剂联合)接触而由APCs负载，因此允许通过APCs交叉呈递来自肿瘤的DRiPs0
因此，在一些实施方案中，本发明提供了在受试者中刺激针对肿瘤的免疫应答的方法，该方法通过给予受试者治疗有效量的本文公开的缀合物和/或负载缀合物的APC (单独的或与其它试剂联合，例如免疫刺激剂如抗0X40抗体)，从而刺激针对一种或多种来自肿瘤的DRiPs的免疫应答。在某些实施方案中，所述方法还包括给予治疗有效量的能够降低或抑制肿瘤或间质细胞抑制分子，例如ro-1的试剂。
在具体的实施方案中，例如使用本文所述的方法，从受试者中存在的相同类型的肿瘤细胞中产生用于制备本文的纳米颗粒-自噬体缀合物的自噬体。例如,如果受试者患有肺癌，从肺癌细胞中产生自噬体。在一些例子中，用于产生自噬体的肿瘤细胞从待治疗的受试者中获得。因此，在一些例子中，所述方法可以包括在给予受试者免疫原性组合物之前从受试者中获得包含肿瘤细胞的样品。所述方法还可以包括在足以允许肿瘤细胞生存、生长或扩增的条件下培养肿瘤细胞。然而，如上文指出的，不是所有的原发肿瘤细胞在培养中都生长良好。因此，在一些例子中，用于产生自噬体的肿瘤细胞可以从与受试者中肿瘤相同的细胞类型的肿瘤细胞系中获得肿瘤细胞。在某些实施方案中，所述方法是在受试者中刺激针对肿瘤细胞的免疫应答的方法。在一些例子中，所述方法包括在肿瘤细胞足以产生自噬体(DRibbles)的条件下，将肿瘤细胞离体暴露于蛋白酶体抑制剂，其中肿瘤细胞与受试者中存在的肿瘤细胞类型相同。在一些例子中，还将肿瘤细胞与自曬诱导剂孵育。在一些例子中，从待治疗的同一受试者中获得肿瘤细胞。自噬体从处理的肿瘤细胞中分离，用交联剂修饰，并与氧化铝纳米颗粒反应，从而提供纳米颗粒-自噬体缀合物，所述氧化铝纳米颗粒在其表面具有一种或多种能与自噬体上的交联剂反应的交联剂。然后给予受试者治疗剂量的纳米颗粒-自噬体缀合物，例如单独或在佐剂或其它免疫刺激剂或抗肿瘤剂的存在下，从而刺激针对一种或多种DRiPs的免疫应答。在一些例子中，在从受试者外周血单核细胞(PBMCs)中获得的APC足以呈递一种或多种DRiPs的条件下，将缀合物与所述APC孵育，从而产生负载缀合物的APCs。以治疗剂量(单独或在另一种治疗剂例如免疫刺激剂或抗肿瘤剂的存在下)给予受试者所得到的负载缀合物的APCs，从而刺激针对一种或多种DRiPs的免疫应答。可以使用本文公开的方法来治疗具有一种或多种肿瘤的受试者。例如，给予本文的纳米颗粒-自噬体缀合物、负载缀合物的APCs或包含本文的纳米颗粒-自噬体缀合物和/或负载缀合物的APCs的免疫原性组合物，能减轻肿瘤的一种或多种症状，例如肿瘤尺寸、肿瘤数量或阻止肿瘤转移。淋巴细胞清除和重建除了肿瘤反应T细胞的初始激活，可以在体内获得长期保持的这些激活的T细胞。例如，为了增加肿瘤反应的细胞溶解性T淋巴细胞和辅助T淋巴细胞的初始扩增和后期保持，在给予治疗有效量的本文的缀合物、负载缀合物的APCs或它们的组合(例如含有缀合物和负载缀合物的APCs的免疫原性组合物)之前，可以单独或组合给予受试者一种或多种能够大幅度地清除受试者的淋巴细胞的药剂。可以在足以实现受试者淋巴细胞清除的条件下，给予淋巴细胞清除剂。在具体的例子中，在给予淋巴细胞清除剂之后，如果受试者中淋巴细胞的数量减少至少50%，例如至少90%，则受试者的淋巴细胞被大幅度地清除了。在具体的例子中，与不给予淋巴细胞清除剂相比，在接种本文的缀合物或负载缀合物的APCs之前，在具有肿瘤的受试者中显著地降低白细胞数目能够引起更强的免疫应答，并且能够破坏更多的肿瘤细胞。在一个例子中，淋巴细胞清除剂是抗肿瘤化学治疗剂。淋巴细胞清除剂的例子包括但不限于氟达拉滨、环磷酰胺或它们的组合。治疗医生根据待治疗的受试者能够选择具体的淋巴细胞清除剂及其适合的剂量。在具体的例子中，所述方法还包括对受试者淋巴细胞清除后，重建受试者的免疫系统。例如，在淋巴细胞清除和给予本发明的免疫原性组合物之前，可以例如通过使用白细胞去除法，从受试者中获得血液细胞(例如单核细胞和巨噬细胞)。可以冷冻分离的血液细胞直至适合将血液细胞引入受试者的时间。例如，可以在给予免疫原性组合物的同时或者给予免疫原性组合物不久之前或之后，给予受试者解冻的淋巴细胞。在具体的实施方案中，这类免疫系统的重组能够提高免疫系统的刺激。刺激针对病原体的免疫应答在一些实施方案中，可以使用本文的缀合物、负载缀合物的APCs或包含本文的缀合物和/或负载缀合物的APCs的免疫原性组合物，来刺激针对病原体(例如来自病原体的DRiPs)的免疫应答。病原体的例子包括但不限于病毒、细菌、原生动物和真菌，例如HIV、流感和李斯特菌。因此，在一些实施方案中，本发明提供了在受试者中刺激针对肿瘤的免疫应答的方法，所述方法通过给予受试者治疗有效量的本文公开的纳米颗粒-自噬体缀合物，，从而刺激针对来自一种或多种病原体DRiPs的免疫应答。从感染靶病原体的细胞中产生用于制备纳米颗粒-自噬体缀合物的自噬体。例如，使用本文公开的方法，从感染一种或多种理想的病原体(或转入编码一种或多种病原体特异抗原的载体)的细胞中生产自噬体。

可以使用本文公开的免疫原性组合物，例如通过预防受试者感染病原体，或通过治疗受试者中存在的感染(例如传染病)来治疗受试者。在一些实施方案中，受试者的治疗是预防性的，例如，预防受试者未来的感染或未来的传染病。在一些实施方案中，治疗包括减轻与传染病有关的一种或多种症状，例如减轻呕吐、腹泻、发烧或寒战，或增加有功能性淋巴细胞的数量。使用的缀合物或负载缀合物的APCs的自噬体与待治疗的传染病对应。由细菌引起的传染病的具体例子包括但不限于肺结核(结核分枝杆菌引起)、犬恶丝虫病(犬恶丝虫(Dirofilaria immitis)引起)、胃病(幽门螺杆菌(Helicobacterpylori)引起)、肠道疾病(例如大肠杆菌引起)、肺病(例如流感嗜血杆菌(Haemophilusinfluenzae)引起)和肺炎(例如肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、绿胺假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)和克雷伯氏肺炎菌(Klebsiella pneumoniae)弓I起)。由病毒引起的传染病的具体例子包括但不限于巨细胞病毒(CMV)肺炎、小肠炎和视网膜炎；爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV)淋巴增生症；水痘/带状疱疹(水痘-带状疱疹病毒(VZV)引起)；HSV-1和HSV-2粘膜炎；HSV_6脑炎、BK病毒出血性膀胱炎；流感病毒；呼吸道合胞病毒(RSV)肺炎、AIDS (HIV引起)；宫颈癌(人乳头瘤病毒引起)和肝炎A、B或C。由原生动物引起的传染病的具体例子包括但不限于疟疾(恶性疟原虫引起)；锥虫和查加斯氏病(克氏锥虫引起)、弓形虫；利什曼病和黑热病(利什曼原虫引起)；贾第虫病(贾第虫引起)；隐孢子虫；肠袋虫病(结肠小袋虫引起)；类圆线虫病(粪类圆线虫引起)；蛔虫(例如鞭虫，钩虫和类圆线虫)和毛细线虫病(毛细线虫病引起)。
由真菌引起的传染病的具体例子包括但不限于鹅口疮(白色念珠菌(Candidaalbicans)引起)、隐球菌性肉芽肿(隐球菌(Cryptococcus)引起)、组织胞衆菌病(组织胞楽二菌(Histoplasma)引起)和曲霉病(曲霉(Aspergillus spp.)引起)。通过本文的缀合物和/或负载缀合物的APCs刺激的免疫应答(无论针对肿瘤还是病原体)的类型可以主要是免疫细胞介导的(相对于抗体介导的)。可以测量免疫应答(或本文所述的免疫原性组合物的免疫原性)的程度，例如，通过结合适当的MHC分子和诱导T细胞应答或诱导B细胞或抗体应答的能力，例如，可测量的细胞毒性T细胞应答或对给定表位的血清抗体应答。免疫原性测定是本领域中众所周知的，并且描述于例如，Paul, Fundamental Immunology, 3rd ed., 243-247 (Raven Press, 1993)和其中引用的参考文献中。
实施例
根据以下实施例可以进一步理解本发明的各方面，其不应解释为以任何方式限制本发明的范围。此外，以下所有体外交叉呈递实验代表至少三次独立进行的实验。以下体内交叉呈递(每组3只小鼠)和肿瘤治疗实验(每组5只小鼠)代表两次独立的实验。实施例1:氧化铝纳米颗粒生物缀合物的制备和表征使用卵白蛋白作为阐明本发明的生物缀合物的蛋白抗原。具体地，通过肼修饰的NPs和芳醛修饰的OVA之间的化学选择性连接，将可溶性卵白蛋白(OVA)缀合于多种金属氧化物纳米颗粒(MOx NPs)。图1a显示了示例性的蛋白抗原与本发明金属氧化物纳米颗粒(MOx NP)缀合的结构。在90°C下，通过与4-氨基苯酹(Sigma) (50 μ g/mL)在去离子水中反应2小时，用氨基(-NH2)使金属氧化物纳米颗粒官能化，所述金属氧化物纳米颗粒包括 a-Al2O3NPs (60nm 和 200nm, Nanoamor) (2mg/mL),锐钦矿 TiO2NPs (25nm 和lOOnm, Sigma-Aldrich) (2mg/mL)和 a -Fe2O3NPs (25nm, Nanoamor) (2mg/mL)。通过在 9000g离心I小时来冲洗氨基官能化的MOx NPs，并在去离子水中重悬。随后，使用琥珀酰亚胺基4-甲酰基苯甲酸酯(SFB)进一步修饰氨基官能化的MOx NPs0使用琥珀酰亚胺基4-肼基烟酸盐丙酮腙(SANH)修饰可溶性卵白蛋白(Sigma) (2mg/mL)。在等体积的SFB修饰的MOx NPs (10mg/mL)悬浮液和SANH修饰的0VA(2mg/mL)溶液混合后，通过在9000g下离心I小时来纯化金属氧化物(MOx)NP-OVA缀合物，并重悬于磷酸缓冲液(PBS)。利用二辛可宁酸(BCA)分析测定与MOx NPs缀合的OVA蛋白的量和在上清中残留的OVA蛋白的量。与 lmg/mL a -Al2O3NPs (60nm)、a -Al2O3NPs (200nm)、锐钛矿 TiO2NPs (25nm)、锐钛矿Ti02NPs (IOOnm)和 a-Fe2O3NPs (25nm)缀合的 OVA 的量分别被确定为大约 0.089mg/mL、0.086mg/mL、0.263mg/mL、0.030mg/mL 和 0.245mg/mL。使用 Limulus Amebocyte Lysate 试剂盒(QCL-1000，BioWhittaker)测定不同MOx NPs的内毒素含量。内毒素含量低于激活树突状细胞所需的水平(小于0.05EU/ μ g NPs)。使用配备能量分散X射线(EDX)分光计的FEI Tecnai F20透射电子显微镜镜(TEM)，通过TEM分析MOx NPs和MOx NP-OVA缀合物的形状、内部结构和化学组成。TEM分析显不缀合后(图1c),具有清洁表面的单晶a-Al2O3NPs (图1b)覆盖非晶形层。实施例2:通过树突状细胞摄取a -Al2O3NP-OVA缀合物
使用具有488nm激发源的Zeiss Axiovert40CFL倒置显微镜监视骨髓来源的未成熟的树突状细胞(DCs)对C1-Al2O3NP-OVA缀合物的摄取。使用Alexa488 (Invitrogen)标记C1-Al2O3NP-OVA缀合物。获取活细胞的明视场图像和荧光图像，然后使用Photoshop成像软件叠加。获得的荧光显微镜图像显示，DCs能够有效地吞噬a -Al2O3NP-OVA缀合物(图1d)。最初，内化的a -Al2O3NP-OVA缀合物在细胞质膜附近。最终，在24小时的孵育时间内，它们迁移至DCs的核周区域。这与已报道的观察结果一致，即负载运输小囊泡的迁移是沿着微管，并移向DCs的微管组织中心。实施例3:1类主要组织相容性复合体(MHC I)分子的表达使用树突状细胞(DCs)上的MHC I肽复合物(Kb-SIINFEKL)的表面表达来评价OVA由a -Al2O3NPs交叉呈递的效率。未成熟的DCs来自用补充有20 μ g重组的完全培养液体外培养后的 C57BL6 小鼠(购自 Charles River Laboratories, Wilmington, MA)的骨髓。将 DCs与OVA和a -Al2O3NP-OVA缀合物孵育18小时。使用生物素缀合的25D-1.16mAb对清洗过的细胞进行染色，所述25D-1.16mAb识别来自OVA蛋白的Kb-SIINFEKL复合物(0VA257_264)。在使用PE缀合的链霉亲和素染色后，通过BD FACS Aria II流式细胞仪定量Kb-SIINFEKL复合物。如图1e所示，与负载可溶性OVA的DCs相比，负载a -Al2O3NP-OVA缀合物的DCs产生更高水平的Kb-SIINFEKL复合物，这证实OVA蛋白与a -Al2O3NPs缀合时比其可溶性形式更有效地被交叉呈递。实施例4:CD8+T细胞的体外和体内激活获得只负载 OVA抗原的DCs和负载分别与a -Al2O3NPs (200nm或60nm)，锐钛矿TiO2NPs (lOOnm或25nm)和a -Fe2O3NPs (25nm)缀合的OVA抗原的DCs，并观察它们各自在体外和体内刺激初始OVA特异性⑶8+T细胞的能力。用负载a -Al2O3NPs和OVA的混合物的DCs测定进一步的比较,通过将等体积的OVA (0.2mg/mL)和a-Al2O3NPs (2mg/mL)的悬浮液混合12小时来制备该混合物。通过CFSE标记的初始OT-1 T细胞的染料稀释测定测量OVA在体外的交叉呈递。将OVA、C1-Al2O3NP-OVA缀合物、锐钛矿TiO2NP-OVA缀合物、a-Fe2O3NP-OVA缀合物或a -Al2O3NPs和OVA的混合物(每一个样品负载0.1 μ g/mL OVA)与5X IO5骨髓来源的DCs或DC2.4细胞孵育6小时，冲洗三遍，并与I X IO6CFSE标记的OT-1 T细胞共孵育60小时。通过流式细胞仪分析测量分化的Thyl.1+OT-1⑶8+T细胞的百分比。在体外研究中，观察到负载a -Al2O3NP(60nm或200nm)-OVA缀合物的DCs诱导剂量依赖的Thyl.1+0T-1CD8+T细胞的扩增(图2a)。此外，观察到负载OVA和a -Al2O3NPs混合物的DCs未有效地激活初始T细胞(图3)。这表明将OVA和a -Al2O3NPs递送ADC的相同细胞内分区是有效交叉呈递的关键步骤。a-Al2O3NP(60nm)-OVA缀合物和a -Al2O3NP (200nm)-OVA缀合物的半数最大有效浓度(EC50)分别为大约10ng/mL和1.3ng/mL，其效率比OVA (5 μ g/mL)高大约500-1000倍。此外，不考虑它们的尺寸，与OVA与TiO2NPs或a -Fe2O3NPs缀合相比，当OVA与a -Al2O3NPs缀合时，DCs更有效地交叉呈递0VA，这表明a -Al2O3NPs的化学特性也与能够有效的交叉呈递有关。此外，只有a-Al2O3NP-OVA缀合物能显著刺激IFN- Y和IL-2的产生(图2b和2c)。而且，发现在体外刺激初始OT-1 T细胞时，负载a -Al2O3NP-OVA缀合物的DCs优于负载OVA免疫复合物(OVA-1C)的DCs或负载在TLR激动剂存在下的OVA (0VA+MPL)的DCs。将 DC2.4 细胞(105)负载不同量(0.001，0.01，0.l，l，10yg)的 OVA、a-Al2O3NP-OVA 缀合物、OVA-1C 和在 100ng/mL MPL(TRL 激动剂 Avanti Polar Lipids, Inc.)存在下的 0VA，并用于刺激CFSE标记的初始OT-1 T细胞。为了制备OVA/抗-OVA免疫复合物，在使用它们负载DCs前，在室温下过夜孵育等量的OVA (2mg/mL)和山羊-抗-OVA (2mg/mL)。通过流式细胞仪分析测量分化的Thyl.1+OT-1⑶8+T细胞的百分比。实验重复两次，两次重复均显示a -Al2O3NP (60nm) -OVA缀合物介导的交叉呈递效率显著高于在存在OVA/抗-OVA免疫复合物(IC)或TLR4激动剂(MPL)的情况下的Fe受体介导的抗原递送。对于IC和TLR激动剂，估计的交叉呈递分别增强10和100倍，这与OVA/抗-DEC-205免疫缀合物和TLR2激动剂的的交叉呈递接近。对于体内交叉呈递，将Thyl.ΓθΤ_Ι转基因T细胞(105)转移至C57BL/6小鼠，6小时后皮下注射OVA、a -Al2O3NP-OVA缀合物、锐钛矿TiO2NP-OVA缀合物、a -Fe2O3NP-OVA缀合物或OVA/Imject _ 明帆佐剂(Thermo Scientific)混合物。6天后，收集淋巴结和脾，并加工形成单细胞悬液。使用BD FACS Calibur流式细胞仪测量淋巴结(LN)和脾(SP)中交叉激活的OT-1⑶8+T细胞占总细胞的百分比，并且在图2d中绘制结果(*P〈0.05)。当用200 μ g OVA或20 μ g OVA与明矾佐剂混合注射小鼠时，所得的0T_I T细胞扩增类似。较大的NPs、a -Al2O3NP(200nm)-OVA缀合物在体外研究中诱导较强的T细胞增殖，却不能在体内交叉激活初始T细胞。然而观察到大量的a -Al2O3NP (200nm)-OVA缀合物具有在注射位置附近储存的趋势，较小的a -Al2O3NP (60nm)-OVA缀合物在给药位置附近消失，并能流入淋巴结。在注射a -Al2O3NP(60nm)-OVA缀合物的小鼠淋巴结和脾内，Thyl.1+OT-1⑶8+Τ细胞数量大幅度地高于通过OVA/lmject 明矾佐剂混合物诱导的细胞数量。此外，与体外试验一致，发现锐钛矿TiO2NP (IOOnm或25nm)_0VA缀合物和a -Fe2O3NP (25nm)-OVA缀合物都未有效地诱导淋巴结或脾中的T细胞增殖。这些结果表明，具有直径小于IOOnm(例如大约60nm)的a-Al2O3NPs是更有效的抗原载体，并且出乎意料地表现出与较大直径的a -Al2O3NPs或传统的明矾佐剂不同的功能。实施例5: a -Al2O3NP载体交叉呈递抗原的假设机制已经提出多种机制来解释明矾的佐剂活性。有趣的是，已证实明矾将可溶性抗原递送至DCs而不会被吞噬。为了理解C1-Al2O3NPs诱导抗原交叉呈递的潜在机制，使用共聚焦显微镜和TEM分析确定内化的a -Al2O3NP-OVA缀合物的亚细胞位置。 免疫染色、转染和共聚焦显微镜:DCs(IOs)用2μ I Alexa fluor488标记的a -Al2O3NP-OVA 缀合物(lmg/mL a -Al2O3NPs (60nm)和 0.089mg/mL OVA)孵育 6 小时。冲
洗后使用4%甲醛固定DCs，并且使用0.2% Triton x-1oo的pbs透化15分钟。使用兔抗-LC3 抗体(invitrogen, 0.5 μ g/mL)和 Alexa fluor568 标记的驴抗兔二抗(I μ g/mL)对细胞进行染色。为了溶酶体示踪，使用(ImM)溶酶体示踪红色DND-99染料(Iysotracker red DND_99dye, Invitrogen)对被处理的DCs进行染色(未固定)。在配有奥林巴斯Fluoview FV1000共聚焦激光显微镜系统的奥林巴斯1X81倒置显微镜下观察染色的细胞。对于DNA转染，将来自骨髓的未成熟DCs(IOs)与0.1μ g pCMV-tdTomato-LC3或 pCMV-tdTomato-p62 (由 Dr.T.Johansen, Biochemistry Department,University
of TromS0, Norway提供)和0.4μ g聚乙烯亚胺(PEI)载体的混合物在无添加物的RPMI 介质(50 μ I)中孵育过夜。在成像前，用PBS清洗3遍，将表达LC3或ρ62融合蛋白的DCs与Alexa488标记的a -Al2O3NP-OVA缀合物孵育6小时。对内化的a -Al2O3NP-OVA与tdtomato-LC3或td_tomato-p62融合蛋白的共定位进行成像。TEM分析:清洗加载a -Al2O3NP-OVA的DCs，并用含4%多聚甲醛的0.25M PBS缓冲液(pH7.4)在室温下固定I小时。使用0.1M 二甲胂酸钠缓冲液，再使用含2%四氧化锇的
0.1M 二甲胂酸钠缓冲液对固定的DCs进行染色。在乙醇溶液中逐渐脱水之后，在60°C下在环氧树脂中过夜包埋染色的DCs。使用Philips/FEI CM120/Biotwin TEM表征包埋DCs的切片。当用C1-Al2O3NP-OVA缀合物负载DCs6小时时，共聚焦图像显示大多数NPs与自噬体标记物Atg8/LC320共定位,而不是溶酶体示踪剂。如从共聚焦图像所观察到的，在负载NP缀合物前，用编码LC3-tdTomato融合蛋白的质粒DNA转染DCs来证实这种共定位。有趣的是，Q-Al2O3NP缀合物还与p62(死骨片I)共定位，所述p62是货物识别(cargorecognition)和自曬途径21的祀向分子。最近已经阐明p62在聚集的蛋白、破坏的细胞器或细胞内细菌选择性自噬中的重要作用，并且此处的结果表明P62在内化Q-Al2O3NPs自噬中发挥了类似的作用。TEM图像证实在内涵体/吞噬体、自噬体和自溶酶体内发现了 C1-Al2O3NPs(图5a)。还通过能量分散X射线(EDX)分光计分析了 DCs中内化的颗粒物。获得的EDX光谱证实内化的纳米颗粒的组分为ai2o3。作为调节蛋白和细胞器降解的主要细胞途径之一，自噬负责II型MHC限制的内源性抗原的呈递。最近的报道表明抗原供体细胞自噬体有效的交叉呈递，并且PAPCs自噬还调节来自单纯性疱疹病毒(HSV)和卡介苗(BCG)的抗原的交叉呈递，所述BCG用于肺结核疫苗。为了检测自噬是否影响a -Al2O3NP-OVA的交叉呈递，通过磷酸肌醇3激酶抑制剂处理来抑制DCs中自噬的启动。具体地，在负载抗原前，使用3-甲基腺嘌呤(3-MA)(10 μ M)或渥曼青霉素(Calbiochem) (LOnM)抑制自噬，利用NH4Cl (IOmM)阻断DCs的溶酶体活性12小时。为了敲低自噬启动基因Atg6/Beclinl或Atgl2，使用easy siRNA试剂盒(New England Biolabs)通过体外转录T7启动子标记的Beclinl和Atgl2cDNA模板制备siRNAs。按照厂商的方案，在24孔板中用0.3 μ g Beclinl或Atgl2siRNA与1.4yg INTERFERin (Polyplus)混合转染DCs。在孵育72小时后，使用Western印迹证实Beclinl或Atgl2的敲低。同样制备突光素酶siRNA,并用作对照siRNA。为了测定在负载OVA或a -Al2O3NP-OVA缀合物18小时后DCs中的自噬水平，通过Western印迹试验分析(Pierce)测定LC3的转变。NH4Cl处理的DCs用作对照。在负载抗原前，加入布雷非尔德菌素A(0.1 μ g/mL) 18小时抑制来自高尔基体的膜，这将影响另一方面，而不是传统的自噬。已发现，3-MA或渥曼青霉素均不能减少可溶性OVA的交叉呈递，但两种抑制剂几乎能取消a -Al2O3NP-OVA缀合物的交叉呈递(图5b)。此外，在DCs中敲低自噬启动基因Atg6/Beclinl阻断了 a -Al2O3NP-OVA缀合物的交叉呈递，而不影响可溶性OVA的交叉呈递(图5c和5d)。这些数据表明功能性自噬途径功能的自噬途径是a -Al2O3NP-OVA而不是可溶性OVA的交叉呈递所需的。还发现，与Beclinl的敲低相比，Atgl2沉默未有效地抑制a -Al2O3NP-OVA缀合物的交叉呈递(图5d)。此外，通过摄取a -Al2O3NP-OVA缀合物而形成的自噬体不能使LC3-1I的产生显著地增加至未处理的DCs中LC3-1I的基础水平以上(图5e)。不希望受任何具体理论的束缚，假设C1-Al2O3NP-OVA缀合物可能利用有效交叉呈递的Atgl2非依赖型(非经典的)自噬途径。与这个假设一致，已证实通过布雷非尔德菌素A阻断了 C1-Al2O3NP-OVA缀合物的交叉呈递，布雷非尔德菌素A是用于区别非经典的自噬途径与经典的自噬途径的ER-Golgi功能的抑制剂(图5f和5g)。由于通过阻断溶酶体降解可以提高外源性抗原的交叉呈递，假设抑制溶酶体的活性能够进一步增加交叉呈递OVA或a -Al2O3NP-OVA缀合物的效率。使用NH4Cl (溶酶体阻滞剂)处理DCs来验证这个假设，发现NH4Cl处理导致更有效地OVA交叉呈递，而对a -Al2O3NP-OVA缀合物的交叉呈递没有任何影响(图5b)。这些发现揭示a -Al2O3NP介导的非经典的自噬将显著量的抗原转移入自噬体，因而延迟酸化和降解(图6)。不希望受任何具体理论的束缚，根据以上发现认为，a -Al2O3NPs可以将抗原从直接的内涵体/溶酶体降解转移至间接的内涵体/自噬体/溶酶体途径。图6概略地比较了两个途径。通常，通过巨胞饮或受体介导的内吞作用内化可溶性抗原，例如0VA，然后在内涵体和溶酶体融合后在酸性环境中降解。不希望受任何具体理论的束缚，与之相反，认为携带C1-Al2O3NP的抗原吞噬作用后被递送至自噬体。认为通过阻断溶酶体和封装携带a -Al2O3NP的抗原的内涵体的直接融合，自体吞噬的空泡保持烷基化，并且降低抗原的降解，导致a -Al2O3NPs作为分子伴侣情况下的抗原有效的交叉呈递实施例6: a -Al2O3NP-抗原缀合物疫苗对已建立的肿瘤的治疗效率为了检验a -Al2O3NP-OVA缀合物是否能够引起内源性T细胞应答，该应答能够消除已建立的肿瘤，用B16F10-0VA肿瘤细胞注射小鼠，在第7天用a -Al2O3NP-OVA缀合物、单 独的a -Al2O3NPs或混有明矾(Rehydragel )的可溶性OVA通过皮下注射荷瘤小鼠。使用
细胞内IFN-Y染色计算在接种疫苗7天后初次接受试验的小鼠或荷瘤小鼠的脾中OVA特异性⑶8+T细胞的频率。图7a显示了接种疫苗后具有B16-0VA肿瘤细胞的小鼠脾中OVA特异的产生IFN- Y的⑶8+T细胞的频率。如图所示，接种a -Al2O3NP-OVA缀合物的小鼠显示了更高水平的OVA特异性T细胞。明显地，注射a -Al2O3NP-OVA缀合物的小鼠完全拒绝肿瘤，并维持无肿瘤超过40天，而所有其它组小鼠死于肿瘤负担(图7b)。为了进一步证明a -Al2O3NPs激发T细胞对疫苗中呈现有限量的抗原的应答的佐剂活性，开展研究以检查a-Al2O3NPs (60nm)增加肿瘤相关抗原交叉呈递的能力。具体地，使用来自肿瘤细胞的自噬体(图8a)而不是整个肿瘤细胞，因为更小的自噬体(小于I μ m)与C1-Al2O3NPs缀合比较大的肿瘤细胞(大于10 μ m)更容易。此外，与整个肿瘤细胞相比，分离的自噬体能够更有效地交叉激活抗原特异性⑶8+T细胞。工程改造肿瘤细胞以表达短寿细胞内0VA，这样能够用Thyl.1+OT-1⑶8+T细胞增殖实验评估成功的交叉呈递。如前文所述，DRibbles是封装蛋白抗原(例如缺陷型核糖体产物)的自噬体。可以通过将细胞(例如肿瘤细胞和感染靶病原体的细胞)与蛋白酶体抑制剂(包括可逆蛋白酶体抑制剂如MG132和不可逆蛋白酶体抑制剂如乳胞素和环氧酶素)和溶酶体阻滞剂，以及在一些情况下还与自噬诱导剂(例如细胞饥饿培养液如HBSS和免疫抑制药物，例如雷帕霉素)接触来产生DRibbles。它们对肿瘤生长的效力和作为癌症疫苗的潜力已经在Li etal., Cancer Res.，68:6889-6895 (2008)和国际公开号 W02007/016340 中描述，在此通过引用并入本文用于所有目的。对于本研究，按照以下Liet al.，Cancer Res.，68:6889-6895(2008)所报道的方法制备分离的自噬体。简述之，在添加IOOnM硼替佐米(蛋白酶体抑制剂)和20mM NH4Cl的RPMI完全培养液中培养肿瘤细胞24小时。收集细胞，并且通过用溶液D(150mM NaCl和5mMEDTA)剧烈地冲洗细胞，从细胞中移出分泌的自噬体(DRibbles)。通过差别离心方法去除较大的细胞碎片和小囊泡(<200nm颗粒)来富集自噬体(300-800nm双层膜颗粒)。用RIPA缓冲液裂解自噬体后，通过BCA测定分离的自噬体的蛋白量。如以上对OVA蛋白的描述，用SANH修饰后，将分离的自噬体与SFB修饰的a -Al2O3NPs缀合。自噬体或a -Al2O3NP-自噬体悬浮液中的蛋白量保持在lmg/ml,而a-Al2O3浓度为大约lmg/mL。通过配备EDX分光计的FEI Sirion场发射扫描电子显微镜(SEM)分析a-Al2O3NP-自噬体缀合物的形态和化学组成。图8b显示了 a -Al2O3NP-自噬体缀合物的SEM图像。黑色素瘤模型:用2x105B16-0VA细胞皮下注射初次接受试验的C57BL/6小鼠。7天后，当肿瘤可触及时，通过皮下注 射a -Al2O3NPs-OVA缀合物、单独的NPs或吸附进入明帆Rehydragel )的OVA接种小鼠(每组8只小鼠)。处死每组中的3只小鼠，在用SIINFEKL肽(BD bioscience)体外刺激12小时后，通过细胞内细胞因子染色(ICS)测定脾中OVA肽特异性⑶8+T细胞的频率。连续地监测和测量剩下5只小鼠中B16-0VA肿瘤的生长。肺转移模型:用lewis肺癌细胞系(3LL)肺肿瘤细胞(2X105每只)静脉注射8周龄雄性C57BL/6小鼠，建立实验性肺转移。7天后开始治疗。通过皮下注射来自3LL肺肿瘤细胞的自噬体(IOOyg蛋白每只小鼠)或C1-Al2O3NP-自噬体缀合物(IOOyg蛋白和100 μ ga -Al2O3NPs每只小鼠)接种小鼠。对于一些组，通过腹膜内注射疫苗，共同给予100 μ g抗-0X40。14天后，收集肺，并在FeketeJ s溶液(100mL70%乙醇、IOmL福尔马林和5mL冰醋酸)中固定。以双空白型计算转移的数量。与加载裸露自噬体的DCs相比，加载a -Al2O3NPs (60nm)缀合的自噬体的DCs (图8b)更有效地交叉激活OT-1 CD8+T细胞(图8c)。在携带实验性转移3LL肺肿瘤的雄性C57BL/6小鼠中评价自噬体和a -Al2O3NP (60nm)-自噬体缀合物的治疗效力(图8d)。使用的自噬体来自未修饰的3LL肿瘤细胞。与PBS处理的对照小鼠相比，皮下注射C1-Al2O3NP-自噬体缀合物而不是裸露的自噬体显著地抑制肺转移的形成。当用含有Q-Al2O3NP-自噬体缀合物的疫苗和抗-0X40抗体(促进抗原特异性T细胞的增殖和存活)处理小鼠时，实现了进一步的提高。该组合处理导致5只小鼠中3只零转移，而在只用0X40抗体处理的小鼠中未观察到效果。以上发现表明a -Al2O3NPs能够用作有效的新载体，其用于在pAPC中将抗原递送至自噬体相关的交叉呈递途径，来有效地激活初始抗原特异性T细胞。当与来自肿瘤的自噬体缀合时，a -Al2O3NPs还能促进这些来自肿瘤的含有复杂未知抗原的自噬体的抗肿瘤效力。通过引用将本文提到的所有出版物、专利申请、专利和其它参考文献全文并入本文。在不脱离本发明的精神和本质特征的情况下，本领域普通技术人员可进行本文所述内容的变化、修改和其它执行方案。因此，本发明的范围并不受前面的说明书的限定，而是由以下的权利要求书限定，并且落入与权利要求等同的含义和范围内的所有变化都意图包含在本文中 。
权利要求
1.纳米颗粒-抗原缀合物，其能够刺激针对靶抗原的免疫应答，所述缀合物包含: 氧化招纳米颗粒，其具有范围为大约5nm至大约150nm的直径；和 自噬体，其封装所述靶抗原的缺陷型核糖体产物(DRiPs)，其中所述自噬体与所述氧化铝纳米颗粒是共价连接的。
2.如权利要求1所述的缀合物，其中所述氧化铝纳米颗粒是C1-Al2O3纳米颗粒，其具有范围为大约IOnm至大约120nm的直径。
3.如权利要求1或2所述的缀合物，其中所述氧化铝纳米颗粒具有范围为大约IOnm至大约80nm的直径。
4.如权利要求1-3中任一项所述的缀合物，其中所述自噬体是通过将包含所述靶抗原的细胞与蛋白酶体抑制剂接触来产生的。
5.如权利要求1-4中任一项所述的缀合物，其中所述自噬体是通过硫醚键以外的键共价连接于所述氧化铝纳米颗粒。
6.如权利要求1-4中任一项所述的缀合物，其中所述自噬体是通过键共价连接于所述氧化铝纳米颗粒，所述键是肼和醛的缩合产物。
7.如权利要求1-6中任一项所述的缀合物，其中所述靶抗原是肿瘤相关抗原，并且所述自噬体来自肿瘤细胞。
8.如权利要求1-6中任一项所述的缀合物，其中所述靶抗原是病原体相关抗原，并且所述自噬体来自感染病原体或载体的细胞，所述载体表达所述病原体相关抗原。
9.如权利要求1-6中任一项所述的缀合物，其中所述靶抗原是病毒相关抗原，并且所述自曬体来自病毒。
10.纳米颗粒-抗原缀合物，其能够刺激免疫应答，所述缀合物包含: a -Al2O3纳米颗粒，其具有范围为大约IOnm至大约80nm的直径；以及 确定的抗原或不确定的抗原，其中所述确定的抗原是纯化蛋白的形式，而所述不确定的抗原是整个肿瘤细胞或来源于肿瘤细胞的自噬体的形式，并且其中所述蛋白质、所述整个肿瘤细胞或所述自噬体与所述a -Al2O3纳米颗粒是共价连接的。
11.免疫原性组合物，其包含悬浮于药学上可接受的流体载体中的治疗有效量的权利要求1-10中任一项所述的缀合物。
12.免疫原性组合物，其包含悬浮于药学上可接受的流体载体中的治疗有效量的抗原呈递细胞，其中所述抗原呈递细胞已用权利要求ι- ο中任一项所述的一种或多种缀合物加载。
13.如权利要求12中所述的免疫原性组合物，其中所述抗原呈递细胞是树突状细胞。
14.如权利要求11-13中任一项所述的免疫原性组合物，其中所述药学上可接受的流体载体选自盐、电解质水溶液和缓冲水溶液。
15.如权利要求11-14中任一项所述的免疫原性组合物，其还包含抗肿瘤化学治疗剂、免疫刺激剂或它们的组合。
16.如权利要求11-15中任一项所述的免疫原性组合物，其中所述免疫原性组合物是疫苗组合物。
17.在受试者中刺激针对靶抗原的免疫应答的方法，所述方法包括根据剂量方案给予所述受试者权利要求11-16中任一项所述的免疫原性组合物，所述剂量方案对于在所述受试者中刺激针对所述靶抗原的免疫应答是治疗有效的。
18.如权利要求17所述的方法，其中所述受试者具有肿瘤。
19.如权利要求18所述的方法，其中在给予所述免疫原性组合物之前给予所述受试者治疗有效量的淋巴细胞清除剂。
20.如权利要求17- 19中任一项所述的方法，其中所述免疫应答是细胞介导的。
全文摘要
本文公开了能够刺激针对靶抗原的免疫应答的纳米颗粒-自噬体缀合物，其中所述纳米颗粒-自噬体缀合物包含共价结合于氧化铝纳米颗粒的自噬体，其中所述自噬体包含靶抗原的缺陷型核糖体产物(DRiPs)。本文还公开了包含这些缀合物和/或负载这些缀合物的抗原呈递细胞的免疫原性组合物，以及通过给予免疫原性组合物刺激针对靶抗原的免疫应答的方法，所述免疫原性组合物包含这些缀合物和/或负载这些缀合物的抗原呈递细胞。
文档编号A61K47/48GK103221069SQ201180051604
公开日2013年7月24日 申请日期2011年8月26日 优先权日2010年8月27日
发明者胡红明, 李海燕, 焦军 申请人:俄勒冈州健康与服务部, 由俄勒冈州高等教育管理委员会代表的波特兰州立大学