重组病毒载体及用于诱导对黄热病毒的免疫反应的方法

专利名称：重组病毒载体及用于诱导对黄热病毒的免疫反应的方法
技术领域：
本发明涉及重组病毒载体和使用重组病毒载体诱导对黄热病毒的免疫反应的方法。本发明提供了基于非复制型改良安卡拉痘苗病毒或基于D4R-缺陷型痘苗病毒的重组病毒载体。当按照本发明的方法施用时，重组病毒载体诱导广泛的对黄热病毒的免疫反应并且显示优良的安全特性(safety profile)。
背景技术：
黄热病(YF)在热带非洲和南美洲的地方流行区仍然代表对公共卫生的持续威胁。世界卫生组织(WHO)估计每年发生200，000例病例，30，000例死亡(WH02009)。黄热病毒(YFV)(—种单链RNA病毒)属于黄病毒科家族，并且通过蚊子传播(LindenbachBD, Thiel HJ和Rice CM2007)。黄热病可分成3期。在3至6天的潜伏期后，患者产生具有症状如发热、不适感、下腰痛、头痛、肌痛、恶心、呕吐和持续3至4天的虚脱(prostration)的热性疾病。在15-25%的患者进入特征在于发热、呕吐、上腹痛(epigastric pain)、出血素质(hemorrhagic diathesis)、黄疸以及肝和肾功能衰竭的第三期(中毒期)前症状消失2至48小时。第7至10天，20-50%的严重YF病例发生死亡(Monath2001 ；Monath2004 ；GubIer, Kuno 和 Markoff2007)。早在1937年，已通过在小鼠和鸡组织培养物中传代，基于Asibi野生型株开发了活减毒疫苗株黄热病病毒 17D (Theiler 和 Smithl937 ；Stokes, Bauer 和 Hudson2001)。17D疫苗已使用了数十年并且已被施用于超过4亿人(Monath2001)。YFV包膜(E)蛋白在保护性免疫反应的诱导中起着主要作用。在动物研究中，纯化的E蛋白或表达膜蛋白及包 膜蛋白的前体(prME)的重组痘苗病毒诱导高水平的中和抗体并且赋予抗致死YFV感染的免疫(Brandriss, Schlesinger和Walshl990 ；Pincus等人1992)。此外，单克隆抗E抗体的被动转移表明抗体介导的免疫足以保护小鼠(Brandriss等人1986)。作为主要靶向体液免疫反应的YFV疫苗的方法，最近已描述了灭活的完整病毒候选疫苗(Monath等人2010)。然而，最近的数据也指出细胞免疫反应的重要作用。与抗体组合的具有Thl表型的⑶4淋巴细胞在病毒清除中起着至关重要的作用(Liu和Chambers2001)。由YFV-17D诱导的⑶8T细胞显示保护性细胞免疫所必需的全部特征，例如广泛的特异性、强劲的增殖、高量级(high magnitude)及长期保留(Miller等人2008; Akondy等人2009)。在包膜蛋白中定位了许多⑶8和⑶4特异性T细胞表位(Co等人 2002 ；van der Most 等人 2002 ；Maciel, Jr.等人 2008)。基于改良安卡拉痘苗病毒(MVA)的重组疫苗已被用于许多非临床和临床研究(Cebere 等人 2006 ;Bejon 等人 2007 ；Brookes 等人 2008 ；Kaufman 等人 2009)。已证明 MVA是特别安全的(Drexler, Staib和Sutter 2004)。当在天花根除的背景中将MVA给超过120，000个人患者施用时，未曾获得显著的副作用(Stickl等人1974 ;Mayr等人1978)。归因于病毒体形态发生中的阻断，高度减毒的痘苗病毒株不能在人和大多数其它哺乳动物细胞中大量复制(Carroll和Mossl997 ;Drexler等人1998 ;Wyatt等人1998)。然而,在早期和晚期表达病毒和外源基因的能力得到保留。此类特征使得MVA成为诱导体液和细胞免疫反应并且显示高度安全特性的有前景的活疫苗载体。另一种非复制型痘苗病毒D4R缺陷型痘苗病毒(dVV)通过必需VV尿嘧啶DNA糖基化酶基因(D4R)的靶向缺失来产生，所述基因参与病毒DNA合成。因此，在许多野生型细胞中，复制周期在晚期基因表达之前，在病毒基因组复制期被阻断。为了繁殖dVV，使用补充缺失的病毒D4R功能的工程化细胞系(Holzer和Falkner 1997 ；Mayrhofer等人2009)。归因于该明确定义的缺失，非复制型病毒dVV代表安全疫苗载体(Ober等人2002)。美国专利N0.6，998，252,7, 015，024,7, 045，136 和 7，045，313 涉及重组痘病毒例
如痘苗病毒。基于MVA的疫苗已被用于临床研究例如抗HIV (Cebere等人2006)、结核病(Brookes等人2008)、疟疾(Be jon等人2007)和癌症(Kaufman等人2009)的临床研究。在所有这些研究中，使用至少2个剂量。当用于临床试验时，基于MVA的疫苗的人剂量为5xl07至 5xl08PFU (Cebere 等人 2006; Tykodi 和 Thompson2008; Brookes 等人 2008)。美国专利N0.5，514，375和5，744，140涉及重组痘病毒，例如包含来自黄病毒属例如YFV的外源DNA的痘苗病毒的宿主范围突变体。美国专利N0.5，021，347涉及重组痘苗病毒，例如具有插入非必需区的日本脑炎病毒E蛋白cDNA的减毒天花病毒。美国专利N0.5，766，882涉及包含外源DNA的缺乏基本功能的缺陷型重组痘病毒。Holzer等人1999 (Holzer等人1999)描述了具有蜱传脑炎病毒prM/E基因的尿嘧啶DNA糖基化酶缺陷型痘苗病毒载体。在先前的研究中(Pincus等人1992)，单剂的IxlO7PFU的表达YFV-17D prME的复制型痘苗病毒Western Reserve株仅部分保护小鼠免受100倍LD5tl的法国亲神经型YFV (French neurotropic YFV)株攻击。甚至在2次接种后，仅94%的动物存活。在利用表达日本脑炎病毒(JEV) prME基因的重组MVA的研究中，3个剂量的2xl06感染单位是保护小鼠免受IO5LD5tl的JEV攻击所必需的(Nam等人1999)。17D疫苗(以前分类为可获得的最有效且最完全的疫苗之一(Barrettl997))现被认为是不太安全的(Monath2007)。最近的研究显示许多疫苗相关严重不利事件。每100，000个接种中，有0.8个受试者产生了疫苗相关亲神经型疾病(Lindsey等人2008)并且200,000至400,000个已接种疫苗者中有I个产生了亲内脏型疾病(viscerotropicdisease) (Monath2007)。在主要旅行者组(major traveler group)即60岁以上的人中，发病率上升至每50，000个接种中I个发病。此外，在西班牙、巴西、美国、澳大利亚和泰国已报导在所有年龄组中存在严重的不利结果，包括死亡(Vasconcelos等人 2001 ；Martin 等人 2001 ；Chan 等人 2001 ；Kengsakul, Sathirapongsasuti 和Punyagupta2002 ；Gerasimon 和 Lowry2005 ；Doblas 等人 2006 ；Belsher 等人 2007)。因此，本领域需要具有改良的安全特性的疫苗。详细描述本发明提供了对于产生对YFV的免疫反应是有用的重组病毒(在本文中也称为重组病毒载体)。重组病毒基于非复制型痘苗病毒MVA和dVV，并且编码YFV prME多肽。当施用时，重组病毒以与17D疫苗相似的水平诱导YFV特异性体液和细胞免疫反应(包括⑶8和CD4T细胞反应)并且甚至在利用野生型痘苗病毒预免疫后保护小鼠免受致死YFV攻击。此外，重组病毒在小鼠中显示与17D疫苗相比改善的安全特性。重组病毒因此预期用作人的疫苗。由本发明的重组病毒的开放阅读框架编码的prME氨基酸序列可以是例如SEQ IDN0:2所示的YFV-17D prME氨基酸序列；SEQ ID NO: 5所示的巴斯德17D-204YFV疫苗prME多肽序列(来自 NCBI Genbank CAB37419.1) ；SEQ ID N0:6 所示的 YFV YFV17D_213prME 多肽序列(来自 NCBI Genbank AAC54268.1) ,SEQ ID NO: 7 所示的南非 17D-204YFV 疫苗 prME多肽(NCBI Genbank AAC35907.1)、SEQ ID NO:8 所示的 YFV 疫苗株 17DD prME 多肽序列(来自 NCBI Genbank AAC54267.1) ,SEQ ID NO:9 所示的 YFV 株 Asibi prME 多肽序列(来自NCBI Genbank AAT58050)或SEQ ID NO: 10所示的法国亲内脏型YFV株prME多肽序列(来自NCBI Genbank AAA99713.1)。在一些实施方案中，由本发明的重组病毒的开放阅读框架编码的PrME多肽在序列上可在SEQ ID NO:2、5、6、7、8、9或10之间变化，但当给个体施用重组病毒时，PrME多肽保留诱导保护性免疫反应的能力。在此类实施方案中，prME多肽可与 SEQ ID N0:2、5、6、7、8、9 或 10 具有约 80%、约 85%、约 90%、约 91%、约 92%、约 93%、约94%、约95%、约95%、约97%、约98%或约99%的同一性。在本发明的重组病毒中，编码YFV prME多肽的开放阅读框架经密码子最优化以用于在人细胞中表达。在此类实施方案中，天然存在的YFV prME开放阅读框架的密码子的一个或多个(或全部)在密码子最优化YFV prME开放阅读框架中被通常用于人细胞的基因的密码子(有时称为优选密码子)替代。一般而言，密码子最优化已被用于重组基因表达的领域以增强多肽在细胞中的表达。本发明的重组病毒中编码YFV prME多肽的基因盒包括处于启动子的控制之下(即，有效地连接于启动子)的YFV prME开放阅读框架，所述启动子在重组痘苗病毒中具有功能(即，指导开放阅读框架的转录)。在示例性实施方案中，prME多肽从基因盒的表达处于强早期/晚期痘苗病毒mH5启动子或合成早期/晚期selP启动子的控制之下(Chakrabarti, Sisler 和 Mossl997)。

在一个方面，本发明提供了包含YFV prME基因盒的重组改良安卡拉痘苗病毒(MVA)。在一个示例性实施方案中，基因盒包含有效地连接于人密码子最优化的YFV-17DprME开放阅读框架的强早期/晚期痘苗病毒启动子mH5和痘苗病毒早期转录终止信号(如SEQ ID NO:1所示的)。由开放阅读框架编码的prME氨基酸序列示于SEQ ID N0:2(和SEQID NO: 4)。prME开放阅读框架的密码子最优化的序列相应于YFV-17D疫苗株基因组的核苷酸419-2452(登录号NC_002031)。在另一个示例性实施方案中，SEQ ID NO: 3所示的基因盒包含有效地连接于相同人密码子最优化的PrME开放阅读框架的合成早期/晚期启动子(selP) (Chakrabarti, Sisler和Mossl997)。在其它实施方案中，编码prME多肽的开放阅读框架可以是编码SEQ ID N0:2所示的YFV-17D prME氨基酸序列的任意人密码子最优化的开放阅读框架。在其它实施方案中，重组MVA YFV prME基因盒可编码SEQ ID N0:5所示的巴斯德 17D-204YFV 疫苗 prME 多肽序列(来自 NCBI Genbank CAB37419.1)、SEQ ID NO:6 所示的 YFV YFV17D-213prME 多肽序列(来自 NCBI Genbank AAC54268.1)、SEQ ID NO:7 所示的南非 17D-204YFV 疫苗 prME 多肽(NCBI Genbank AAC35907.1)、SEQ ID NO:8 所示的 YFV疫苗株 17DD prME 多肽序列(来自 NCBI Genbank AAC54267.1)、SEQ ID NO: 9 所示的 YFV株Asibi prME多肽序列(来自NCBI Genbank AAT58050)或SEQ ID NO: 10所示的法国亲内脏型YFV株prME多肽序列(来自NCBI Genbank AAA99713.1)。多肽序列可如上面段落
中所论述的进行变化。编码此类prME多肽序列的开放阅读框架还可以是人密码子最优化的序列。基因盒的表达可处于例如强早期/晚期痘苗病毒mH5启动子或合成早期/晚期selP启动子的控制之下。可将prME基因盒在基因组的非必需区域例如缺失I区域、缺失II区域、缺失III区域、缺失IV区域、胸苷激酶基因座、D4/5基因间区域或HA基因座中插入MVA。在示例性实施方案中，插入在缺失III区域中。重组MVA来源于无牛海绵状脑病(BSE)的MVA例如获自国立卫生研究院的MVA74LVD6。可按照本领域的标准方法将表达YFV prME基因盒的重组MVA配制为药物组合物。在一些实施方案中，药物组合物包含药学上可接受的载体。术语“药学上可接受的载体”包括任意和所有临床上有用的溶剂、分散介质、包衣、抗菌剂和抗真菌剂、等渗和吸收延迟剂、缓冲剂和赋形剂例如磷酸缓冲盐溶液、5%葡萄糖或甘露醇水溶液，和乳剂例如油/水或水/油乳剂，以及各种类型的湿润剂和/或佐剂。适当的药物载体和制剂描述于Remington’sPharmaceutical Sciences,第 19 版(Mack Publishing C0., Easton, 1995)中。用于组合物的药用载体取决于活性剂的期望施用模式。本发明提供了诱导个体的对YFV的免疫反应的方法，包括给个体施用药物组合物。在所述方法中，可以以单剂、双剂或多剂施用药物组合物。如本文中所举例说明的，IO5TCID50的重组MVA的单次给药在小鼠中诱导可与单剂(IO4TCID5ci)的YFV-17D类似的保护作用。人中的免疫途径可以是肌内(1.m.)或皮下(s.c.)途径。人免疫剂量的范围可以为约IO6至约109PFU。本发明的方法诱导个体的体液和细胞免疫反应。此外，在本发明的实施方案中，方法诱导个体的保护性免疫反应。保护性免疫反应可以是其中个体对YFV的随后暴露不导致热性疾病。热性疾病包括症状例如发热、不适感、下腰痛、头痛、肌痛、恶心、呕吐和虚脱。保护性免疫反应可以是其中随后对YFV的暴露不导致特征在于例如发热、呕吐、上腹痛、出血素质、 黄疸以及肝肾衰竭的第三期感染。保护性免疫反应可以是其中随后对YFV的暴露不导致致死感染。还提供了产生表达YFV prME基因盒的重组MVA的方法，所述方法包括步骤:a)利用MVA感染原代鸡胚细胞或永久性禽细胞系，b)利用包含prME基因盒和包含侧翼连接基因盒的DNA的质粒转染所述感染的细胞，所述DNA与MVA基因组的非必需区域同源，c)生长细胞以允许质粒在MVA在鸡细胞中复制的过程与MVA基因组重组，从而将prME基因盒在非必需区域中插入MVA基因组，和d)获得产生的重组MVA。示例性鸡胚细胞描述于美国专利N0.5, 391,491.(Slavik, Ciampor 和 Mayerl983)中。还涉及其它禽细胞(例如，DF-1)。在方法中，非必需MVA区域是缺失I区域、缺失II区域(Meyer, Sutter和Mayrl991)、缺失III区域(Antoine 等人 1996)、缺失 IV 区域(Meyer, Sutter 和 Mayr1991) (Antoine 等人 1998)、胸苷激酶基因座(Mackett, Smith和Mossl982)、D4/5基因间区域(Holzer等人1998)或HA基因座(Antoine等人1996)。在一个示例性实施方案中，插入在缺失III区域中。基因可额外地插入任何其它适当的基因组区域或基因组间区域。在另一个方面，提供了表达YFV prME基因盒的重组D4R缺陷型痘苗病毒(dVV)。在一个示例性实施方案中，基因盒包含有效地连接于人密码子最优化的YFV-17D prME开放阅读框架的强早期/晚期痘苗病毒启动子mH5和痘苗病毒早期转录终止信号(SEQ IDN0:1所示的)。由开放阅读框架编码的prME氨基酸序列示于SEQ ID N0:2(和SEQ IDNO: 4)。prME开放阅读框架的序列相应于YFV-17D疫苗株基因组的核苷酸419-2452 (登录号NC_002031)。在另一个实施方案中，SEQ ID NO: 3所示的基因盒包含有效地连接于相同人密码子最优化的prME开放阅读框架的合成早期/晚期启动子(selP) (Chakrabarti, Sisler和Mossl997)。prME基因盒可在复制痘苗病毒(VV)中替代D4R基因或可被插入在dVV的非必需区域。在其它实施方案中，重组dVV中的编码prME多肽的开放阅读框架可以是编码SEQ ID N0:2所示的YFV-17D prME氨基酸序列的任意人密码子最优化的开放阅读框架。在其它实施方案中，重组dVV YFV prME基因盒可编码SEQ ID N0:5所示的巴斯德 17D-204YFV 疫苗 prME 多肽序列(来自 NCBI Genbank CAB37419.1)、SEQ ID NO:6 所示的 YFV YFV17D-213prME 多肽序列(来自 NCBI Genbank AAC54268.1)、SEQ ID NO:7 所示的南非 17D-204YFV 疫苗 prME 多肽(NCBI Genbank AAC35907.1)、SEQ ID NO:8 所示的 YFV疫苗株 17DD prME 多肽序列(来自 NCBI Genbank AAC54267.1)、SEQ ID NO: 9 所示的 YFV株Asibi prME多肽序列(来自NCBI Genbank AAT58050)或SEQ ID NO: 10所示的法国亲内脏型YFV株prME多肽序列(来自NCBI Genbank AAA99713.1)。多肽序列可如上面段落
中所论述的进行变化。编码此类prME多肽序列的开放阅读框架还可以是人密码子最优化的序列。基因盒的表达可处于例如强早期/晚期痘苗病毒mH5启动子或合成早期/晚期selP启动子的控制之下。可将表达YFV prME基因盒的重组dVV配制为药物组合物。在一些实施方案中，药物组合物包含药学上可接受的载体。术语“药学上可接受的载体”包括任意和所有临床上有用的溶剂、分散介质、包衣、抗菌剂和抗真菌剂、等渗和吸收延迟剂、缓冲剂和赋形剂例如磷酸缓冲盐溶液、5%葡萄糖或甘露醇水溶液，和乳剂例如油/水或水/油乳剂，以及各种类型的湿润剂和/或佐剂。适当的药物载体和制剂描述于Remington’s PharmaceuticalSciences,第19版(Mack Publishing C0., Easton, 1995)中。用于组合物的药用载体取决于活性剂的期望施用模式。本发明提供了诱导个体的对YFV的免疫反应的方法，包括给个体施用药物组合物。在所述方法中，可以以单剂、双剂或多剂施用药物组合物。人中的免疫途径可以是肌内或皮下途径。免疫剂量的范围可以为约IO6至约109PFU。本发明的方法诱导个体的体液和细胞免疫反应。此外，在本发明的实施方案中，方法诱导个体的保护性免疫反应。保护性免疫反应可以是其中个体对YFV的随后暴露不导致热性疾病。热性疾病包括症状例如发热、不适感、下腰痛、头痛、肌痛、恶心、呕吐和虚脱。保护性免疫反应可以是其中随后对YFV的暴露不导致特征在于例如发热、呕吐、上腹痛、出血素质、黄疸以及肝肾衰竭的第三期感染。保护性免疫反应可以是其中随后对YFV的暴露不导致致死感染。还提供了产生表达YFV prME基因盒的重组dVV的方法，所述方法包括步骤:a)利用野生型VV (例如李斯特/埃尔斯特里株系)感染D4R补充细胞系，b)利用包含prME基因盒和包含侧翼连接基因盒的DNA的质粒转染所述感染的细胞，所述DNA与野生型VV基因组的D3R和D5R区域同源，c)生长细胞以允许质粒在病毒基因组在D4R补充细胞系中复制的过程与病毒基因组重组，从而将PrME基因盒插入D3R与D5R区域之间的病毒基因组，和d)获得产生的重组dVV。 D4R补充细胞系可以是兔RK44.20细胞系(Holzer和Falknerl997)、非洲绿猴cVero-22细胞系(Mayrhofer等人2009)或允许反式提供VV D4R基因产物的VV的任何其它细胞系。与17D疫苗相比较，本发明的重组痘苗病毒避免了免疫受损个体的禁忌，并且不能诱导与不利事件相关的亲神经和亲内脏型YFV疫苗，因为它们在人中不具有复制能力。附图概要

图1显示MVA-YF(Aii)和dVV_YF(Bii)的质粒转移载体⑴和基因组结构(ii)。质粒载体pd3-lacZ-mH5-YFprMEco (Ai)靶向MVA基因组中的缺失III插入位点。为了获得无任何辅助序列的重组病毒(Aii)，利用MVA侧翼之一的220bp自重复序列(self repeat)(R)侧翼连接瞬时lacZ/gpt筛选标记，所述自重复序列通过自发重组介导标记盒的去除。质粒载体pDW-mH5-YFprMEc0 (Bi)的插入位点为野生型李斯特/埃尔斯特里病毒的ORF D3R与D5R之间的区域。lacZ/gpt标记盒位于串联DNA重复(R)之间以实现标记盒的最终去除。所得的重组缺陷型病毒(Bii)不存在尿嘧啶DNA糖基化酶基因(D4R)，并且依然包含一个串联重复。两种质粒(Ai和Bi)都包含处于早期/晚期痘苗病毒mH5启动子的控制之下的人密码子最优化的YFV prM和E编码区。图2显示感染的鸡细胞(DF-1)的双免疫染色。(A)MVA-YF、⑶野生型MVA以及(OMVA-YF/MVA加标对照。4天后固定感染的细胞，用豚鼠抗YFV-17D抗血清和缀合至过氧化物酶的抗-豚鼠IgG温育所述细胞。通过用含镍的DAB溶液染色将prME的表达可视化为黑斑。为了检测无prME表达的MVA，用兔抗痘苗病毒血清和缀合有抗兔过氧化物酶的IgG抗体温育细胞，随后用不含镍的DAB溶液进行染色，从而导致褐斑(prME非表达子(non-expressor))。图3显示在许可条件下的YFV prME蛋白表达。(A)利用MVA-YF或相应对照感染的鸡细胞(DF-1)的裂解物的Western印迹。MVA-YF(泳道I)、阴性对照、野生型MVA(泳道2)、未感染的DF-1细胞(泳道3)、阳性对照YFV-17D感染的DF-1细胞(17D，泳道4)、从感染的HeLa细胞制备的YFV-17D (17D对照，泳道5)。(B)利用dVV_YF或相应对照感染的cVero22细胞的裂解物的Western印迹。dVV_YF(泳道I)、阴性对照、野生型dVV(泳道2)、非感染的cVero22细胞(泳道3)、阳性对照YFV-17D感染的cVero22 (17D，泳道4)、17D对照(泳道5)。约50kDa的条带代表YFV包膜蛋白。图4显示许可条件下的YFV prME蛋白表达水平的比较。⑷⑷小鼠肌细胞(Sol8)或(B)利用重组体或相应对照感染的人细胞(HeLa)的Western印迹。MVA-YF(泳道I)、dVV-YF (泳道2)、阴性对照野生型MVA (泳道3)、阴性对照野生型dVV (泳道4)、未感染的(A) So18⑶HeLa细胞(泳道5)、利用YFV-17D感染的各自细胞系的阳性对照(17D，泳道6)、17D对照(泳道7)。约50kDa的条带代表YFV包膜蛋白。图5显示在Balb/c小鼠中进行的保护作用研究。利用指定剂量的(A)MVA_YF、(B)dVV-YF或利用(C)阳性对照YFV-17D(17D)和阴性对照野生型MVA、缺陷型痘苗病毒(dVV)或缓冲液(PBS)按照单剂方案肌内接种动物。21天后，利用1x105TCID5Q的YFV-17D疫苗株进行皮下攻击，监测14天。结果为3个单独实验的平均值。
图6显示针对YFV E-抗原引发的细胞免疫反应。㈧利用MVA-YF、dVV_YF或相应YFV-17D(17D)阳性或野生型MVA和dVV阴性对照免疫两次后的IFN- Y分泌性⑶4+T-细胞的数目的FACS分析。利用YFV E-蛋白、E57-71(E4;黑色条块)、E129-143(E5;灰色条块)和E133-147(E6 ;白色条块)的15聚肽刺激小鼠的脾细胞。(B)在如上所示的两次免疫后，IFN- Y分泌性⑶8+T细胞的数目的FACS分析。利用YFV E-蛋白、E60-68 (El ;黑色条块)、E330-338(E2 ;灰色条块)、E332-340 (E3白色条块)的9聚肽刺激小鼠的脾细胞。(C)特异性CD8+T细胞对肽脉冲的靶细胞的细胞毒性杀伤的FACS分析。利用YFV E-蛋白、E60-68 (El ;黑色条块)、E330-338 (E2 ;灰色条块)、E332_340 (E3 ；白色条块)的9聚肽装载靶细胞。数据为两个单独实验的平均值(+/-SD)。图7显示研究预存抗牛痘免疫对保护作用的影响的实验的结果。利用野生型痘苗病毒肌内接种Balb/c小鼠，3个月后按照初免或初免/加强方案，利用亚最佳(IxIO3TCID5ci)或最佳(IxIO5TCID5ci)肌内剂量的MVA-YF或利用IxIO4TCID5tl的YFV-17D病毒或缓冲液(作为对照)进行免疫。利用IxIO5TCID5ci的YFV-17D大脑内攻击所有动物，监测存活率，进行14天。免疫方案和结果示于表2中。图8显示重组候选疫苗在BALB/c小鼠中的安全性。⑷利用IxlO5至IxIO7TCID50 (仅显示IxIO7TCID5tl剂量)的MVA-YF (亮灰色线)、dVV_YF (灰线)和相应对照野生型MVA (虚线)和dVV (黑线)大脑内注射动物，监测21天。(B)以IxlOY亮灰色线)、1χ102(灰线)或1χ103(虚线)的剂量利用YFV-17D疫苗大脑内注射小鼠，监测21天。
实施例本发明通过下列实施例来举例说明，其中实施例1和2各自描述将编码YFV株的膜和包膜(PrME)蛋白的前体的密码子最优化的基因插入非复制型改良安卡拉痘苗病毒和插入D4R缺陷型痘苗病毒的不同实施方案。实施例3和4显示在各种细胞中基因盒从重组病毒表达。评估重组病毒在小鼠模型中的免疫原性和保护作用并且在实施例5和6描述的实验中将其与商业YFV-17D疫苗相比较。重组活病毒在单次IO5TCID5tl的低免疫剂量后已赋予抗致死攻击的完全保护作用，并且诱导充足量的Y干扰素分泌性CD4T细胞和具有功能活性的CD8T细胞。实施例7证明抗野生型痘苗病毒的预存免疫对保护作用没有负面影响。实施例8显示，与经典17D疫苗不同，重组病毒在给小鼠大脑内施用后都不引起发病或死亡，从而显示高度安全 特性。实施例1重组病毒MVA-YF的构建和表征 构建表达编码黄热病株17D的prME编码序列(CDS)的重组MVA，将其称为MVA-YF。化学合成处于痘苗病毒早期/晚期mH5启动子(Wyatt等人1996)的控制之下的prME CDS。这允许除去存在于原始序列中的痘病毒早期转录终止信号(5TNT)和根据人密码子选择最优化开放阅读框架以在人中获得高表达水平而不用修饰氨基酸序列。包括mH5启动子的基因盒的序列示于SEQ ID NO:1。为了产生MVA-YF，将密码子最优化的(co)表达盒插入新构建的转移质粒pd3-lacZ-gpt,从而产生质粒pd3-lacZ-mH5-YFprMEco(图1Ai)。该质粒通过同源重组指导外源基因进入MVA的缺失IlKdelIII)区域。按照下列步骤(i)_(v)构建用于重组入MVA基因的del III区域的转移质粒(图1Aii)。(i)pd3-Script Prel0 使用寡核苷酸 oYF_8 (5，-GTT AAC AGT TTC CGG TGA ATGTGT AGA TCC AGA TAG T_3’)(SEQ ID NO: 11)和 oYF_9 (5’-GAA GAC GCT AGC ACT AGT GCGGCC GCT TTG GAA AGT TTT ATA GG-3，) (SEQ ID NO: 12)(针对右侧翼)以及 oYFlO (5’_GCGGCC GCA CTA GTG CTA GCG TCT TCT ACC AGC CAC CGA AAG AG-3’ ) (SEQ ID NO: 13)和oYF-ll(5，-CGT ACG TTA TTA TAT CCA TAG GAA AGG-3，) (SEQ ID NO: 14)(针对左侧翼)，通过PCR从野生型MVA的基因组DNA扩增del III区域的左右侧翼。利用这两个片段(作为模板)以及引物oYF-11和oYF-8进行重叠PCR。将片段克隆进入载体pPCR-Script AmpSK (+) (Stratagene),从而产生质粒 pd3_Script Prel。(ii)pd3dlacZ/Notr MCS。利用 BamH1、BsmFI 或利用 BsiW1、Eell36II 和绿豆消化(mung bean digestion)除去pPCR-Script-Amp SK (+)质粒的残留 IacZ序列和位点 1617 上的NotI限制位点，随后进行平端再连接，从而产生质粒pd3-dlacZ/N0tr。为了在痘苗病毒DNA 区段之间引入多克隆位点(Nhe1、HindII1、Alu1、BamH1、Stu1、Spe1、Xho1、NotI)，利用NheI和NotI切割质粒，插入由退火的寡核苷酸oYF-50(5’-CTA GCG ACA AGC TTG CAG GATCCA CTA GGC CTA TAA CTA GTC CGC TCG AGA TTG C_3’)(SEQ ID NO: 15)和oYF-51(5’GGCCGC AAT CTC GAG CGG ACT AGT TAT AGG CCT AGT GGA TCC TGC AAG CTT GTC G3，) (SEQID NO: 16)组成的接头，从而产生 pd3-dlacZ/Notr-MCS。(iii)pDW2-重复-dellll。产生左MVA侧翼的delIII自重复序列(R) (Staib等人2000)以在蚀斑纯化过程中通过内部同源重组来帮助除去lacZ/gpt基因盒。使用寡核苷酸 oYF-48(5，-CGC CGT CGA CTA TAT TAG ACA ATA CTA CAA TTA AC-3，) (SEQ ID NO: 17)和 oYF-49(5’ -ATA TGG ATC CTC TAC CAG CCA CCG AAA G_3’ ) (SEQ ID NO: 18)通过 PCR从pd3-Script扩增delIII自重复序列(220bp)，将其克隆在gpt/lacZ基因盒下游的pDW2的 SalI 与 BamHI 之间(Holzer 等人 199 8)。(iv)pd3-lacZ-gpto 使用 HindIII 和 BamHI 限制位点将 pDW2_ 重复-delIII 的lacZ/gpt delIII 自重复片段克隆进入 pd3-lacZ/Notr_MCS,从而产生 pd3_lacZ-gpt。(v)pd3-lacZ-mH5_YFprMEco。针对人密码子选择(co)最优化并且合成(Geneart, Regensburg, Germany)处于强早期/晚期痘苗病毒启动子mH5控制之下的编码YFV prME(YFprMEco)基因的开放阅读框架(登录号NC_002031，(Rice等人1985))。合成序列缺乏痘苗病毒早期转录终止信号；该信号被正好引入编码区的下游。将表达盒插入pd3-lacZ-gpt 的 Spel/Notl 位点，从而产生 pd3-lacZ-mH5_YFprMEco (图1Ai)。如下进行重组MVA-YF的构建和纯化(图1A(II))。通过磷酸钙沉淀法将20微克pd3-lacZ-mH5-YFprMEco质粒转染进入MVA感染的原代鸡胚细胞(CEC)。已从12日龄鸡胚产生CEC，将其在含有5%胎牛血清(FCS)、100Π/ι 1 Pen/Strep (Lonza)和100UI/ml NEAA (Lonza)的培养基199 (Gibco)进行生长。使用先前描述的瞬时标记稳定法(Scheiflinger, Dorner和Falkner 1998)选择重组病毒。扩增纯化的MVA-YF克隆以在CEC中进行大规模繁殖。在数轮蚀斑纯化后，通过最初利用选择压，随后不用选择压(Wyatt等人1996)，获得称为MVA-YF病毒的终重组病毒(图1Aii)。该病毒包含位于MVA del III插入位点中的受痘苗病毒mH5启动子调控的prME基因并且不含额外的外源序列。作为替代,构建等同于pd3-lacZ-mH5_YFprMEco但在Sacl/Spel限制位点之间包含合成E/L启动子(selP) (Chakrabarti等人1997)而非mH5启动子的质粒。通过使寡核苷酸 oYF_39(5’ -CTA GTG GAT CTA AAA ATT GAA ATT TTA TTT TTT TTT TTT GGA ATATAA ATA GAG CT-3’ ) (SEQ ID NO: 19)与 oYF_40(5’ -CTA TTT ATA TTC CAA AAA AAA AAAΑΤΑ AAA TTT CAA TTT TTA GAT CCA-3’ ) (SEQ ID NO:20)退火产生 selP 启动子。基因盒的序列示于SEQ ID N0:3中。如段落
中所述进行具有处于selP启动子的控制之下的YFV prME基因盒的重组MVA-YF的构建和纯化。将pd3-lacZ-selP_YFprMEco质粒而非pd3-lacZ-mH5-YFprMEco 质粒用于转染。作为另一个替代，为了指导外源基因进入MVA的HA基因座，将处于mH5或selP启动子的控制之下的YFprMEco盒分别在XhoI/SnaBI限制位点之间插入转移质粒 pHA-vA(Scheiflinger 等人 1998),从而分别产生质粒 pHA-mH5_YFprMEco 或pHA-seIP-YFprMEco。以相同方式进行同源重组以产生称为MVA_mH5YF或MVA_selPYF的具有替代插入位点的重组MVA-YF。通过PCR分析以及通过双免疫染色测定确认野生型MVA不存在于重组病毒中。为了进行PCR分析，选择在侧翼区域结合缺失III整合位点的引物对，从而产生具有MVA-YF的3490bp的片段和具有野生型MVA的1298bp的片段。该测定确认在1000PFU的重组病毒中有约IPFU污染物的检测限上，重组MVA-YF原种(stock)不含亲代野生型病毒(数据未显示)O为了检测潜在污 染性野生型病毒或丧失表达YF抗原的能力的重组体，在6孔板中培养DF-1细胞或cVero22细胞(Mayrhofer等人2009)，利用10，100或1000PFU的重组体感染所述细胞。野生型病毒以及野生型病毒与各自的重组体的混合物用作对照。在37°C于5%C02中温育I小时后，吸取病毒接种物，将3ml0.5%的具有补充有5%FCS的DMEM的羧甲基纤维素覆盖物(overlay)添加至每一个孔。在4天的温育后，除去覆盖物，用甲醇/丙酮(1:1)固定细胞。为了检测YFV E-蛋白质表达子的蚀斑，使用抗YFV-17D的gp抗血清。将缀合有山羊抗_膝鼠辣根过氧化物酶的IgG (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.)用作二级抗体。利用包含镍(Vector Laboratories)的二氨基联苯胺(DAB)溶液显现蚀斑，从而产生黑色蚀斑。为了检测无prME表达的MVA蚀斑，使用多克隆兔抗-痘苗病毒血清(批号.AVVSKP26012006)。二级抗体为缀合有山羊抗兔过氧化物酶的IgG(Jackson Inc)。利用不含镍的DAB溶液显现蚀斑，从而产生褐斑。目测计数黑色和褐色蚀斑。MVA-YF感染的细胞显示代表表达prME蛋白的重组体的均匀黑色灶点(foci)(图2A)，这表明原种不含野生型MVA或不具有prME表达的任何异常重组体(非表达子)。在野生型MVA对照中，仅看到褐色灶点(图2B)，然而MVA-YF/MVA加标对照以预期的比例包含可明确地区分的褐色和黑色灶点(图2C)。实施例2重组病毒dVV-YF的构建和表征平行地，产生表达密码子最优化的prME⑶S的D4R-缺陷型痘苗病毒，将其称为dVV-YF。为此目的，将mH5-prME盒插入质粒pDW2，从而产生pDW-mH5_YFprMEco (图1Bi)。为了产生D4R-缺陷型痘苗病毒，构建质粒pDW2的衍生物(Holzer等人1998)。pDW-2包含D3R和D5R基因的痘苗病毒基因组序列(以便进行同源重组)以及位于串联DNA重复之间的lacZ/gpt标记盒(从而允许进行瞬时选择和蓝斑筛选)。将合成mH5-YFprMEc0基因盒插入质粒pDW-2的Xhol/Notl位点，从而产生pDW-mH5-YFprMEco (图1Bi)。通过序列分析验证启动子和prME基因盒的序列。将该质粒用于构建非复制型病毒dVV-YF，其中将YFV prME表达盒插入在痘苗病毒D3R与D5R基因之间，从而替代必需D4R基因。通过用野生型VV (李斯特/埃尔斯特里株系)(来自美国典型培养物保藏中心的VR-862)感染D4R互补性cVero22细胞，然后利用重组质粒进行转染，随后进行数轮蚀斑纯化来产生重组病毒。dVV-YF(图1Bii)。为了产生重组复制缺陷型痘苗病毒(dVV-YF)，将20微克pDW2-mH5-YFprMEco转染进入痘苗病毒李斯特/埃尔斯特里感染的cVero22细胞(Mayrhofer等人2009)。如先前所述(Holzer和Falknerl997)进行蚀斑纯化。在cVero细胞中大规模扩增通过该方法获得的缺陷型dVV_YF的纯化分离株，将其经历进一步表征。这些步骤导致称为dVV-YF的复制缺陷型重组病毒(图1Bii)。重组体具有期望的无任何标记基因的基因结构，如通过PCR表征的。其不能在野生型细胞中生长，通过双免疫染色分析的所有蚀斑表达prME蛋白(数据未显示)。实施例3允许细胞的抗原表达首先在允许MVA复制的条件下测试通过MVA-YF模式化的prME表达。为此目的，利用MVA-YF或利用野生型MVA或YFV-17D(17D)(商购可得的疫苗Stamaril，Sanofi/Pasteur)(作为对照)以0.01的MOI感染禽DF-1细胞。将感染的细胞温育4天，通过SDS-PAGE研究总细胞裂解物，使用多克隆抗-YFV-17D抗血清进行Western印迹分析。利用Western印迹法评估MVA-YF和dVV_YF重组体的prME蛋白的表达。为了分析在许可条件下的表达，以0.01的MOI感染DF-1细胞或CVero细胞(在缺陷型重组体的情况下)，进行4天。为了在非许可条件下进行分析，以10的MOI感染HeLa或SolS细胞，进行72小时。平行地利用相应的野生型痘苗病毒或YFV-17D作为对照感染细胞。将超声处理的和热处理的细胞裂解物加载在12%的聚丙烯酰胺凝胶(Bio-Rad，Inc)上，随后印迹至硝酸纤维素膜(Invitrogen, Inc)上。为了检 测prME蛋白，使用抗YFV-17D的多克隆豚鼠(gp)抗血清。将缀合有山羊抗-豚鼠辣根过氧化物酶的IgG(Jackson ImmunoResearchLaboratories, Inc.)用作二级抗体。YFV-17D感染的HeLa细胞(Μ0Ι0.01,进行3天)用作阳性对照。如图3A中所示，由重组MVA-YF(泳道I)表达的YF包膜(E)蛋白显示为在50kDa大小范围内的单一条带，该大小是黄病毒E蛋白的预期大小(Lindenbach BD, Thiel HJ和Rice CM2007)。还可在17D对照(泳道5)中检测到相同的条带。重组MVA的E蛋白表达水平高于YFV-17D感染(泳道4)中的所述水平。在禽DF-1细胞中重复地看到YFV-17D的低表达水平。也在人细胞中研究在HA基因座中具有YFprMEco盒的重组MVA-YF的表达模式。为了分析处于mH5或selP启动子的控制之下的prMEco表达，以MOI为10的MVA_selPYF—式两份地分别感染人(HeLa)细胞。将感染的细胞温育I天，通过SDS-PAGE研究总的细胞裂解物，使用抗-YFV血清进行Western印迹分析。在HeLa细胞中，在MVA_mH5YF和MVA_selPYF感染中发现相当量的E蛋白(数据未显示)。为了研究由dVV-YF在支持D4R缺陷型痘苗病毒的复制的细胞培养系统中进行的prME表达，利用dVV-YF或利用dVV野生型病毒或YFV-17D (作为对照)以0.01的MOI感染互补性Vero细胞系cVero22。如上所述进行其它步骤。如图3B中所示，重组dVV-YF (泳道I)在感染的cVero22细胞中表达E蛋白，YFV-17D病毒(泳道4)亦如此。
实施例4非允许细胞的抗原表达设计在人中用于诱导免疫反应的重组MVA-YF和dVV-YF，并且在小鼠保护模型中评估功效。在小鼠和人生物体中，此类病毒不复制。尽管不存在病毒复制，但YFV蛋白表达应当以合理的水平发生，以诱导高效的免疫反应。为此，也在对于重组MVA-YF和dVV-YF都是非允许的人和小鼠细胞系中研究表达模式。利用MOI为10的MVA-YF或dVV_YF以及利用相应的对照感染小鼠肌细胞(Sol8)或人细胞(HeLa)。将感染的细胞温育2天，通过SDS-PAGE研究总细胞裂解物，使用抗-YFV抗血清进行Western印迹分析。Sol8肌细胞的表达在选择的小鼠攻击模型(其中肌内(1.m.)免疫小鼠)中应当反映靶细胞类型。如图4A中所示，重组MVA-YF(泳道I)和dVV-YF(泳道2)以相当的量表达E蛋白。如阴性对照(泳道3-5)中所预期的，未检测到YFV蛋白。在该设置中，通过YFV-17D阳性对照(泳道6)的E蛋白表达低于检测限。在HeLa细胞(图4B)中，再次在MVA-YF (泳道I)和dVV_YF (泳道2)感染中发现相当量的E蛋白。YFV-17D感染的细胞(泳道6)显示相当量的E蛋白。因此，在利用非复制型MVA-YF或dVV-YF接种的人中，可预期以有效水平进行的YFV抗原的正确表达。实施例5小鼠中的保护作用研究随后，分析重组MVA-YF和dVV_YF保护小鼠免受利用YFV-17D病毒的致死大脑内攻击的能力。所有动物实验由实验动物护理与使用委员会(IACUC)评审并且由奥地利监管机构(Austrian regulatory authorities)批准。遵照有关动物实验的奥地利法律和由国际实验动物评估认证管理 委员会(Association for Assessment and Accreditation ofLaboratory Animal Care) (AAALAC)提出的指导方针进行所有动物实验。将动物关养在被AAALAC认可的设施中。通过MVA-YF或dVV-YF (在50 μ I体积的PBS-0.01%人血清白蛋白(HSA)缓冲液中的IxlO2至IxIO5TCID5q的剂量范围上)的单次注射免疫成组的6只Balb/c小鼠(Charles River)。利用 50 μ I 体积的 PBS-0.01%HAS 中的 IxIO6TCID50 的野生型 MVA、dVV或PBS(作为阴性对照)以及利用50μ I体积的PBS-0.01%HAS中的1x104TCID50 (等同于人剂量)的YFV-17D(作为阳性对照)或利用PBS缓冲液免疫对照组。在接种后第21天，利用TBS-0.01%HAS缓冲液中的IxIO5TCID5q (>1000倍小鼠致死剂量50 (LD50))的YFV-17D大脑内(1.c.)攻击小鼠,监测临床症状和存活,进行14或21天。9周龄小鼠的LD5tl经测定为约83TCID5(I (数据未显示)。由MVA-YF产生的保护作用很明显是剂量依赖性的(图5A)。每只动物IxIO5TCID5q的最高剂量赋予完全保护作用，即使IxlO2的最低剂量也保护超过50%的动物。同样地，在dVV-YF组(图5B)中，保护作用也是剂量依赖性的，在1x105TCID5Q的最高免疫剂量具有100%的存活率。然而，更低的剂量不具有保护作用，重组MVA-YF亦如此。IxIO2TCID5tl的剂量保护作用低于30%。所有阴性对照组(利用野生型痘苗病毒或PBS注射的)死亡或显示最高20%的低存活率。如所预期的，在利用YFV-17D免疫的组中看到完全保护作用(图5C)。为了确定保护作用的相关性，在第19天在攻击前血清中分析中和抗体滴度。在利用单剂接种后，PRNT5tl滴度较低。对于利用达到最高免疫剂量的重组病毒以及利用YFV-17D的接种情况亦如此。因此，进行第二实验，其中小鼠接受单剂或双剂的IO4UO6UO7TCID5q的MVA-YF或dVV-YF或IO4和IO6TCID5tl的YFV-17D病毒(作为阳性对照)的接种。此外，利用双剂的IxIO7TCID5q的空MVA或dVV载体(作为阴性对照)免疫小鼠。在初次免疫后第42天收集血清，利用PRNT5tl测定分析YFV中和抗体。在6孔板中每孔接种约3xl05个Vero细胞，将细胞培养过夜以获得汇合单层。在56°C下对血清进行补体灭活，进行30分钟。以1:10稀释度测试接种前血清，向其中添加100PFU的YFV-17D。将接种后血清的系列2倍稀释物与100PFU的YFV-17D株混合，在4°C下温育过夜。将病毒与血清的混合物添加至Vero细胞单层，并且在37°C下温育I小时。利用0.75%羧甲基纤维素-DMEM溶液替换病毒/血清混合物，温育4天，如上所述利用免疫染色进行显色。中和抗体滴度为使病毒蚀斑的数目相对于接种前血清减少至少50%的最高血清稀释度的倒数。如下面表I中所示，两种重组疫苗在IO5TCID5tl的一次施用后都诱导100%的保护作用，然而，即使在107TCID50的最高剂量上也未测量到PRNT5tl滴度或仅测到较低的PRNT5tl滴度。仅有YFV-17D疫苗在IO4和IO6TCID5tl的单剂施用后诱导可测量的中和滴度。表1.小鼠中的保护作用和攻击前YFV PRNT
权利要求
1.一种重组改良安卡拉痘苗病毒(MVA)，其包含编码黄热病毒(YFV)prME多肽的基因盒。
2.根据权利要求1所述的重组MVA，其中所述基因盒编码SEQID N0:2所示的YFV prME氨基酸序列。
3.根据权利要求1所述的重组MVA，其中所述基因盒编码SEQID N0:5所示的YFV prME氨基酸序列。
4.根据权利要求1所述的重组MVA，其中所述基因盒编码SEQID N0:6所示的YFV prME氨基酸序列。
5.根据权利要求1所述的重组MVA，其中所述基因盒编码SEQID NO: 7所示的YFV prME氨基酸序列。
6.根据权利要求1所述 的重组MVA，其中所述基因盒编码SEQID N0:8所示的YFV prME氨基酸序列。
7.根据权利要求1所述的重组MVA，其中所述基因盒编码SEQID N0:9所示的YFV prME氨基酸序列。
8.根据权利要求1所述的重组MVA，其中所述基因盒编码SEQID NO: 10所示的YFVprME氨基酸序列。
9.根据权利要求1所述的重组MVA，其中所述YFVprME多肽从所述基因盒的表达处于mH5启动子的控制之下。
10.根据权利要求2所述的重组MVA，其中所述YFVprME多肽从所述基因盒的表达处于mH5启动子的控制之下。
11.根据权利要求3所述的重组MVA，其中所述YFVprME多肽从所述基因盒的表达处于mH5启动子的控制之下。
12.根据权利要求4所述的重组MVA，其中所述YFVprME多肽从所述基因盒的表达处于mH5启动子的控制之下。
13.根据权利要求5所述的重组MVA，其中所述YFVprME多肽从所述基因盒的表达处于mH5启动子的控制之下。
14.根据权利要求6所述的重组MVA，其中所述YFVprME多肽从所述基因盒的表达处于mH5启动子的控制之下。
15.根据权利要求7所述的重组MVA，其中所述YFVprME多肽从所述基因盒的表达处于mH5启动子的控制之下。
16.根据权利要求8所述的重组MVA，其中所述YFVprME多肽从所述基因盒的表达处于mH5启动子的控制之下。
17.根据权利要求1所述的重组MVA，其中所述YFVprME多肽从所述基因盒的表达处于selP启动子的控制之下。
18.根据权利要求2所述的重组MVA，其中所述YFVprME多肽从所述基因盒的表达处于selP启动子的控制之下。
19.根据权利要求3所述的重组MVA，其中所述YFVprME多肽从所述基因盒的表达处于selP启动子的控制之下。
20.根据权利要求4所述的重组MVA，其中所述YFVprME多肽从所述基因盒的表达处于selP启动子的控制之下。
21.根据权利要求5所述的重组MVA，其中所述YFVprME多肽从所述基因盒的表达处于selP启动子的控制之下。
22.根据权利要求6所述的重组MVA，其中所述YFVprME多肽从所述基因盒的表达处于selP启动子的控制之下。
23.根据权利要求7所述的重组MVA，其中所述YFVprME多肽从所述基因盒的表达处于selP启动子的控制之下。
24.根据权利要求8所述的重组MVA，其中所述YFVprME多肽从所述基因盒的表达处于selP启动子的控制之下。
25.一种重组MVA，其 包含SEQ ID NO:1所示的YFV-17D prME基因盒。
26.一种重组MVA，其包含SEQ ID NO: 3所示的YFV-17D prME基因盒。
27.根据权利要求1所述的重组MVA，其中将所述prME基因盒在缺失I区域、缺失II区域、缺失III区域、缺失IV区域、胸苷激酶基因座、D4/5基因间区域或HA基因座中插入所述MVA。
28.根据权利要求2所述的重组MVA，其中将所述prME基因盒在缺失I区域、缺失II区域、缺失III区域、缺失IV区域、胸苷激酶基因座、D4/5基因间区域或HA基因座中插入所述MVA。
29.根据权利要求3所述的重组MVA，其中将所述prME基因盒在缺失I区域、缺失II区域、缺失III区域、缺失IV区域、胸苷激酶基因座、D4/5基因间区域或HA基因座中插入所述MVA。
30.根据权利要求4所述的重组MVA，其中将所述prME基因盒在缺失I区域、缺失II区域、缺失III区域、缺失IV区域、胸苷激酶基因座、D4/5基因间区域或HA基因座中插入所述MVA。
31.根据权利要求5所述的重组MVA，其中将所述prME基因盒在缺失I区域、缺失II区域、缺失III区域、缺失IV区域、胸苷激酶基因座、D4/5基因间区域或HA基因座中插入所述MVA。
32.根据权利要求6所述的重组MVA，其中将所述prME基因盒在缺失I区域、缺失II区域、缺失III区域、缺失IV区域、胸苷激酶基因座、D4/5基因间区域或HA基因座中插入所述MVA。
33.根据权利要求7所述的重组MVA，其中将所述prME基因盒在缺失I区域、缺失II区域、缺失III区域、缺失IV区域、胸苷激酶基因座、D4/5基因间区域或HA基因座中插入所述MVA。
34.根据权利要求8所述的重组MVA，其中将所述prME基因盒在缺失I区域、缺失II区域、缺失III区域、缺失IV区域、胸苷激酶基因座、D4/5基因间区域或HA基因座中插入所述MVA。
35.根据权利要求9所述的重组MVA，其中将所述prME基因盒在缺失I区域、缺失II区域、缺失III区域、缺失IV区域、胸苷激酶基因座、D4/5基因间区域或HA基因座中插入所述MVA。
36.根据权利要求10所述的重组MVA，其中将所述prME基因盒在缺失I区域、缺失II区域、缺失III区域、缺失IV区域、胸苷激酶基因座、D4/5基因间区域或HA基因座中插入所述MVA。
37.根据权利要求11所述的重组MVA，其中将所述prME基因盒在缺失I区域、缺失II区域、缺失III区域、缺失IV区域、胸苷激酶基因座、D4/5基因间区域或HA基因座中插入所述MVA。
38.根据权利要求12所述的重组MVA，其中将所述prME基因盒在缺失I区域、缺失II区域、缺失III区域、缺失IV区域、胸苷激酶基因座、D4/5基因间区域或HA基因座中插入所述MVA。
39.根据权利要求13所述的重组MVA，其中将所述prME基因盒在缺失I区域、缺失II区域、缺失III区域、缺失IV区域、胸苷激酶基因座、D4/5基因间区域或HA基因座中插入所述MVA。
40.根据权利要求14所述的重组MVA，其中将所述prME基因盒在缺失I区域、缺失II区域、缺失III区域、缺失IV区域、胸苷激酶基因座、D4/5基因间区域或HA基因座中插入所述MVA。
41.根据权利要求15所述的重组MVA，其中将所述prME基因盒在缺失I区域、缺失II区域、缺失III区域、缺失IV区域、胸苷激酶基因座、D4/5基因间区域或HA基因座中插入所述MVA。
42.根据权利要求16所述的重组MVA，其中将所述prME基因盒在缺失I区域、缺失II区域、缺失III区域、缺失IV区域、胸苷激酶基因座、D4/5基因间区域或HA基因座中插入所述MVA。
43.根据权利要求17所述的重组MVA，其中将所述prME基因盒在缺失I区域、缺失II区域、缺失III区域、缺失IV区域、胸苷激酶基因座、D4/5基因间区域或HA基因座中插入所述MVA。
44.根据权利要求18所述的重组MVA，其中将所述prME基因盒在缺失I区域、缺失II区域、缺失III区域、缺失IV区域、胸苷激酶基因座、D4/5基因间区域或HA基因座中插入所述MVA。
45.根据权利要求19所述的重组MVA，其中将所述prME基因盒在缺失I区域、缺失II区域、缺失III区域、缺失IV区域、胸苷激酶基因座、D4/5基因间区域或HA基因座中插入所述MVA。
46.根据权利要求20所述的重组MVA，其中将所述prME基因盒在缺失I区域、缺失II区域、缺失III区域、缺失IV区域、胸苷激酶基因座、D4/5基因间区域或HA基因座中插入所述MVA。
47.根据权利要求21所述的重组MVA，其中将所述prME基因盒在缺失I区域、缺失II区域、缺失III区域、缺失IV区域、胸苷激酶基因座、D4/5基因间区域或HA基因座中插入所述MVA。
48.根据权利要求22所述的重组MVA，其中将所述prME基因盒在缺失I区域、缺失II区域、缺失III区域、缺失IV区域、胸苷激酶基因座、D4/5基因间区域或HA基因座中插入所述MVA。
49.根据权利 要求23所述的重组MVA，其中将所述prME基因盒在缺失I区域、缺失II区域、缺失III区域、缺失IV区域、胸苷激酶基因座、D4/5基因间区域或HA基因座中插入所述MVA。
50.根据权利要求24所述的重组MVA，其中将所述prME基因盒在缺失I区域、缺失II区域、缺失III区域、缺失IV区域、胸苷激酶基因座、D4/5基因间区域或HA基因座中插入所述MVA。
51.根据权利要求25所述的重组MVA，其中将所述prME基因盒在缺失I区域、缺失II区域、缺失III区域、缺失IV区域、胸苷激酶基因座、D4/5基因间区域或HA基因座中插入所述MVA。
52.根据权利要求26所述的重组MVA，其中将所述prME基因盒在缺失I区域、缺失II区域、缺失III区域、缺失IV区域、胸苷激酶基因座、D4/5基因间区域或HA基因座中插入所述MVA。
53.根据权利要求1所述的重组MVA，其中将所述prME基因盒在缺失III区域中插入所述MVA。
54.根据权利要求2所述的重组MVA，其中将所述prME基因盒在缺失III区域中插入所述MVA。
55.根据权利 要求3所述的重组MVA，其中将所述prME基因盒在缺失III区域中插入所述MVA。
56.根据权利要求4所述的重组MVA，其中将所述prME基因盒在缺失III区域中插入所述MVA。
57.根据权利要求5所述的重组MVA，其中将所述prME基因盒在缺失III区域中插入所述MVA。
58.根据权利要求6所述的重组MVA，其中将所述prME基因盒在缺失III区域中插入所述MVA。
59.根据权利要求7所述的重组MVA，其中将所述prME基因盒在缺失III区域中插入所述MVA。
60.根据权利要求8所述的重组MVA，其中将所述prME基因盒在缺失III区域中插入所述MVA。
61.根据权利要求9所述的重组MVA，其中将所述prME基因盒在缺失III区域中插入所述MVA。
62.根据权利要求10所述的重组MVA，其中将所述prME基因盒在缺失III区域中插入所述MVA。
63.根据权利要求11所述的重组MVA，其中将所述prME基因盒在缺失III区域中插入所述MVA。
64.根据权利要求12所述的重组MVA，其中将所述prME基因盒在缺失III区域中插入所述MVA。
65.根据权利要求13所述的重组MVA，其中将所述prME基因盒在缺失III区域中插入所述MVA。
66.根据权利要求14所述的重组MVA，其中将所述prME基因盒在缺失III区域中插入所述MVA。
67.根据权利要求15所述的重组MVA，其中将所述prME基因盒在缺失III区域中插入所述MVA。
68.根据权利要求16所述的重组MVA，其中将所述prME基因盒在缺失III区域中插入所述MVA。
69.根据权利要求17所述的重组MVA，其中将所述prME基因盒在缺失III区域中插入所述MVA。
70.根据权利要求18所述的重组MVA，其中将所述prME基因盒在缺失III区域中插入所述MVA。
71.根据权利要求19所述的重组MVA，其中将所述prME基因盒在缺失III区域中插入所述MVA。
72.根据权利要求20所述的重组MVA，其中将所述prME基因盒在缺失III区域中插入所述MVA。
73.根据权利要求21所述的重组MVA，其中将所述prME基因盒在缺失III区域中插入所述MVA。
74.根据 权利要求22所述的重组MVA，其中将所述prME基因盒在缺失III区域中插入所述MVA。
75.根据权利要求23所述的重组MVA，其中将所述prME基因盒在缺失III区域中插入所述MVA。
76.根据权利要求24所述的重组MVA，其中将所述prME基因盒在缺失III区域中插入所述MVA。
77.根据权利要求25所述的重组MVA，其中将所述prME基因盒在缺失III区域中插入所述MVA。
78.根据权利要求26所述的重组MVA，其中将所述prME基因盒在缺失III区域中插入所述MVA。
79.—种药物组合物，其包含根据权利要求1-79中任一项所述的重组MVA。
80.一种药物组合物，其包含根据权利要求77或78所述的重组MVA。
81.一种诱导个体的对YFV的免疫反应的方法，其包括给所述个体施用包含根据权利要求1-79中任一项所述的重组MVA的药物组合物。
82.根据权利要求81所述的方法，其中以单剂施用所述药物组合物。
83.一种用于诱导个体的对YFV的免疫反应的药物组合物，所述方法包括给所述个体施用包含根据权利要求1-79中任一项所述的重组MVA的药物组合物的步骤。
84.根据权利要求83所述的药物组合物，其中以单剂施用所述药物组合物。
85.一种产生表达SEQ ID勵:1所示的￥ ￥-170 prME基因盒的重组MVA的方法，所述方法包括步骤: a)利用MVA感染原代鸡胚细胞或永久性禽细胞系， b)利用包含SEQID NO:1所示的prME基因盒和包含侧翼连接所述基因盒的DNA的质粒转染所述感染的细胞，所述DNA与MVA基因组的非必需区域同源， c)生长所述细胞以允许所述质粒在所述MVA在所述感染的细胞中复制的过程中与所述MVA基因组重组，从而将所述prME基因盒在所述非必需区域中插入所述MVA基因组，以及 d)获得产生的重组MVA。
86.一种产生表达SEQ ID N0:3所示的YFV-17D prME基因盒的重组MVA的方法，所述方法包括步骤: a)利用MVA感染原代鸡胚细胞或永久性禽细胞系， b)利用包含SEQID NO: 3所示的prME基因盒和包含侧翼连接所述基因盒的DNA的质粒转染所述感染的细胞，所述DNA与所述MVA基因组的非必需区域同源， c)生长所述细胞以允许所述质粒在所述MVA在所述感染的细胞中复制的过程中与所述MVA基因组重组，从而将所述prME基因盒在所述非必需区域中插入MVA基因组，以及 d)获得产生的重组MVA。
87.根据权利要求85所述的方法，其中所述非必需MVA区域为缺失I区域、缺失II区域、缺失III区域、缺失IV区域、胸苷激酶基因座、D4/5基因间区域或HA基因座。
88.根据权利要求86所述的方法，其中所述非必需MVA区域为缺失I区域、缺失II区域、缺失III区域、缺失IV区域、胸苷激酶基因座、D4/5基因间区域或HA基因座。
89.根据权利要求85所述的方法，其中所述非必需MVA区域为缺失III区域。
90.根据权利要求86所述的方法，其中所述非必需MVA区域为缺失III区域。
91.一种重组D4R-缺陷型痘苗病毒(dVV)，其包含编码黄热病毒(YFV)prME多肽的基因盒。
92.根据权利要求91所述的重组dVV，其中所述基因盒编码SEQID NO:2所示的YFVprME氨基酸序列。
93.根据权利要求91所述的重组dVV，其中所述基因盒编码SEQID NO:5所示的YFVprME氨基酸序列。
94.根据权利要求91所述的重组dVV，其中所述基因盒编码SEQID NO:6所示的YFVprME氨基酸序列。
95.根据权利要求91所述的重组dVV，其中所述基因盒编码SEQID NO:7所示的YFVprME氨基酸序列。
96.根据权利要求91所述的重组dVV，其中所述基因盒编码SEQID NO:8所示的YFVprME氨基酸序列。
97.根据权利要求91所述的重组dVV，其中所述基因盒编码SEQID NO:9所示的YFVprME氨基酸序列。
98.根据权利要求91所述的重组dVV，其中所述基因盒编码SEQID NO: 10所示的YFVprME氨基酸序列。
99.根据权利要求91所述的重组dVV，其中所述YFVprME多肽从基因盒的表达处于mH5启动子的控制之下。
100.根据权利要求92所述的重组dVV，其中所述YFVprME多肽从所述基因盒的表达处于mH5启动子的控制之下。
101.根据权利要求93所述的重组dVV，其中所述YFVprME多肽从所述基因盒的表达处于mH5启动子的控制之下。
102.根据权利要求94所述的重组dVV，其中所述YFVprME多肽从所述基因盒的表达处于mH5启动子的控制之下。
103.根据权利要求95所述的重组dVV，其中所述YFVprME多肽从所述基因盒的表达处于mH5启动子的控制之下。
104.根据权利要求96所述的重组dVV，其中所述YFVprME多肽从所述基因盒的表达处于mH5启动子的控制之下。
105.根据权利要求97所述的重组dVV，其中所述YFVprME多肽从所述基因盒的表达处于mH5启动子的控制之下。
106.根据权利要求98所述的重组dVV，其中所述YFVprME多肽从所述基因盒的表达处于mH5启动子的控制之下。
107.根据权利要求91所述的重组dVV，其中所述YFVprME多肽从所述基因盒的表达处于selP启动子的控制之下。
108.根据权利要求92所述的重组dVV，其中所述YFVprME多肽从所述基因盒的表达处于selP启动子的控制之下。
109.根据权利要求93所述的重组dVV，其中所述YFVprME多肽从所述基因盒的表达处于selP启动子的控制之下。
110.根据权利要求94所述的重组dVV，其中所述YFVprME多肽从所述基因盒的表达处于selP启动子的控制之下。
111.根据权利要求95所述的重组dVV，其中所述YFVprME多肽从所述基因盒的表达处于selP启动子的控制之下。
112.根据权利要求96所述的重组dVV，其中所述YFVprME多肽从所述基因盒的表达处于selP启动子的控制之下。
113.根据权利要求97所述的重组dVV，其中所述YFVprME多肽从所述基因盒的表达处于selP启动子的控制之下。
114.根据权利要求98所述的重组dVV，其中所述YFVprME多肽从所述基因盒的表达处于selP启动子的控制之下。
115.一种重组dVV，其包含SEQ ID NO:1所示的YFV-17D prME基因盒。
116.一种重组dVV，其包含SEQ ID NO:3所示的YFV-17D prME基因盒。
117.根据权利要求91所述的重组dVV，其中所述prME基因盒替代所述dVV中的D4R基因。
118.根据权利要求92所述的重组dVV，其中所述prME基因盒替代所述dVV中的D4R基因。
119.根据权利要求93所述的重组dVV，其中所述prME基因盒替代所述dVV中的D4R基因。
120.根据权利要求94所述的重组dVV，其中所述prME基因盒替代所述dVV中的D4R基因。
121.根据权利要求95所述的重组dVV，其中所述prME基因盒替代所述dVV中的D4R基因。
122.根据权利要求96所述的重组dVV，其中所述prME基因盒替代所述dVV中的D4R基因。
123.根据权利要求97所述的重组dVV，其中所述prME基因盒替代所述dVV中的D4R基因。
124.根据权利要求98所述的重组dVV，其中所述prME基因盒替代所述dVV中的D4R基因。
125.根据权利要求99所述的重组dVV，其中所述prME基因盒替代所述dVV中的D4R基因。
126.根据权利要求100所述的重组dVV，其中所述prME基因盒替代所述dVV中的D4R基因。
127.根据权利要求101所述的重组dVV，其中所述prME基因盒替代所述dVV中的D4R 基因。
128.根据权利要求102所述的重组dVV，其中所述prME基因盒替代所述dVV中的D4R基因。
129.根据权利要求103所述的重组dVV，其中所述prME基因盒替代所述dVV中的D4R基因。
130.根据权利要求104所述的重组dVV，其中所述prME基因盒替代所述dVV中的D4R基因。
131.根据权利要求105所述的重组dVV，其中所述prME基因盒替代所述dVV中的D4R基因。
132.根据权利要求106所述的重组dVV，其中所述prME基因盒替代所述dVV中的D4R基因。
133.根据权利要求107所述的重组dVV，其中所述prME基因盒替代所述dVV中的D4R基因。
134.根据权利要求108所述的重组dVV，其中所述prME基因盒替代所述dVV中的D4R基因。
135.根据权利要求109所述的重组dVV，其中所述prME基因盒替代所述dVV中的D4R基因。
136.根据权利要求110所述的重组dVV，其中所述prME基因盒替代所述dVV中的D4R基因。
137.根据权利要求111所述的重组dVV，其中所述prME基因盒替代所述dVV中的D4R基因。
138.根据权利要求112所述的重组dVV，其中所述prME基因盒替代所述dVV中的D4R基因。
139.根据权利要求113所述的重组dVV，其中所述prME基因盒替代所述dVV中的D4R基因。
140.根据权利要求114所述的重组dVV，其中所述prME基因盒替代所述dVV中的D4R基因。
141.根据权利要求115所述的重组dVV，其中所述prME基因盒替代所述dVV中的D4R基因。
142.根据权利要求116所述的重组dVV，其中所述prME基因盒替代所述dVV中的D4R基因。
143.一种药物组合物，其包含根据权利要求91-142中任一项所述的重组dVV。
144.一种药物组合物，其包含根据权利要求141或142所述的重组dVV。
145.一种诱导个体的对YFV的免疫反应的方法，包括给所述个体施用包含根据权利要求91-142中任一项所述的重组dVV的药物组合物。
146.根据权利要求145所述的方法，其中以单剂施用所述药物组合物。
147.一种用于诱导个体的对YFV的免疫反应的药物组合物，所述方法包括给所述个体施用包含根据权利要求91-142中任一项所述的重组dVV的药物组合物的步骤。
148.根据权利要求147所述的药物组合物，其中以单剂施用所述药物组合物。
149.一种产生 表达SEQ ID勵:1所示的￥ ￥-170 prME基因盒的重组dVV的方法，包括步骤: a)利用野生型痘苗病毒(VV)感染D4R-互补性细胞系， b)利用包含SEQID NO:1所示的prME基因盒和包含侧翼连接所述基因盒的DNA的质粒转染所述感染的细胞，所述DNA与所述野生型VV基因组的D3R和D5R区域同源， c)生长所述感染的细胞以允许所述质粒在所述病毒基因组在D4R-互补性细胞系中复制的过程中与所述病毒基因组重组，从而将所述prME基因盒插入所述D3R与D5R区域之间的病毒基因组，以及 d)获得产生的重组dVV。
150.一种产生表达SEQ ID勵:3所示的￥ ￥-170 prME基因盒的重组dVV的方法，其包括步骤: a)利用野生型VV感染D4R-互补性细胞系， b)利用包含SEQID NO: 3所示的prME基因盒和包含侧翼连接所述基因盒的DNA的质粒转染所述感染的细胞，所述DNA与所述VV基因组的D3R和D5R区域同源， c)生长所述感染的细胞以允许所述质粒在所述病毒基因组在D4R-互补性细胞系中复制的过程中与所述病毒基因组重组，从而将所述prME基因盒插入所述D3R与D5R区域之间的病毒基因组，以及 d)获得产生的重组dVV。
151.根据权利要求149所述的方法，其中所述D4R-互补性细胞系为兔RK44.20细胞系或非洲绿猴cVero-22细胞系。
152.根据权利要求150所述的方法，其中所述D4R-互补性细胞系为兔RK44.20细胞系或非洲绿猴cVero-22细胞系。
全文摘要
本发明涉及重组病毒载体和使用所述重组病毒载体诱导对黄热病毒的免疫反应的方法。本发明提供了基于非复制改良安卡拉痘苗病毒或基于D4R-缺陷型痘苗病毒的重组病毒载体。当根据本发明的方法施用时，重组病毒载体诱导广泛的对黄热病毒的免疫反应并且显示优良的安全特性。
文档编号A61K39/12GK103200962SQ201180053873
公开日2013年7月10日 申请日期2011年9月22日 优先权日2010年9月23日
发明者法尔考-京特·法尔科内尔, 比尔吉特·沙弗尔, 格奥尔格·霍泽尔, P·诺尔·巴尔莱特, 哈特穆特·埃尔利希 申请人:巴克斯特国际公司, 巴克斯特医疗保健股份有限公司