通过抑制增殖性激酶cdk4和cdk6保护肾组织免于局部缺血的制作方法

通过抑制增殖性激酶cdk4和cdk6保护肾组织免于局部缺血的制作方法
【专利摘要】本发明公开的主题涉及保护细胞和或组织免受由于局部缺血的损伤的方法和组合物。具体地，本发明公开的主题涉及向已暴露于局部缺血或有局部缺血的风险的个体给药的细胞周期蛋白依赖性激酶4/6(CDK4/6)抑制剂的保护作用。
【专利说明】通过抑制增殖性激酶CDK4和CDK6保护肾组织免于局部缺血
[0001]优先权声明
[0002]本申请要求2010年11月17日提交的美国临时专利申请系列号61/458，140的权益，其公开整体援引加入本文。
[0003]政府利益.[0004]本发明公开的主题是在美国国立卫生研究院授予的基金号R43A1084284的美国政府支持下完成的。因此，美国政府享有本发明公开的主题的某些权利。
【技术领域】
[0005]本发明公开的主题涉及保护健康细胞免受局部缺血损伤的方法和组合物。例如，本发明公开的主题涉及使用细胞周期蛋白依赖性激酶4/6(CDK4/6)抑制剂以诱导哺乳动物个体内某些组织和/或细胞如肾中的药理静止，从而增强该个体的临床结果。
[0006]简写
[0007]%=百分比
[0008]μ g=微克
[0009]μ L=微升
[0010]μ M=微摩尔
[0011 ]BrdU=5-溴 _2_ 脱氧尿苷
[0012]CAT=计算机化轴向断层扫描
[0013]⑶K=细胞周期蛋白依赖性激酶
[0014]⑶K4/6=细胞周期蛋白依赖性激酶4和/或细胞周期蛋白依赖性激酶6
[0015]CT=计算机断层扫描
[0016]dL=l/10 升
[0017]DMSO= 二甲基亚砜
[0018]g=克
[0019]h=小时
[0020]IC50=50% 抑制浓度
[0021]1.p.=腹腔内
[0022]IRI=局部缺血再灌注损伤
[0023]kg=千克
[0024]mg=毫克
[0025]nM=纳摩尔
[0026]PD=6-乙酰基-8-环戊基-5-甲基_2_ (5-哌嗪_1_基-吡啶_2_基氨基)_8H_吡啶并_[2，3-d]-嘧啶-7-酮(也称为PD0332991)
[0027]RLU=相对光单位
[0028]SEM=平均标准误差【背景技术】
[0029]由于不存在证实保护肾免于缺血性损伤的疗法，所以管理目前包括支持患者直至肾能够自愈的时间。管理策略包括使用利尿剂以调节体积状态、磷结合剂以及在需要时透析。值得注意的是，这些疗法均不改变肾修复过程的自然历史，并且一些证据表明利尿剂和透析可能甚至使肾损伤恶化。因此，对实用方法有持续需要以保护有计划发生、有风险发生或已发生局部缺血和/或其相关事件的个体。

【发明内容】

[0030]在一些实施方案中，本发明公开的主题提供一种在细胞或组织暴露于局部缺血和/或相关事件之前或之后缓解需要治疗的个体中的所述细胞或组织中源自局部缺血和/或相关事件的损伤的方法，其中所述方法包括向所述个体给药药学有效量的抑制细胞周期蛋白依赖性激酶4 (CDK4)和/或细胞周期蛋白依赖性激酶6 (CDK6)的化合物，并且其中所述细胞或组织的特征在于损伤后的增殖是CDK4/6依赖性的。
[0031]在一些实施方案中，本发明公开的主题提供一种在肾细胞或肾组织暴露于局部缺血和/或相关事件之前或之后缓解需要治疗的个体中的所述细胞或肾组织中源自局部缺血和/或相关事件的损伤的方法，其中所述方法包括向所述个体给药药学有效量的抑制细胞周期蛋白依赖性激酶4(CDK4)和/或细胞周期蛋白依赖性激酶6 (CDK6)的化合物。
[0032]在一些实施方案中，在个体暴露于局部缺血和/或相关事件之前、在个体暴露于局部缺血和/或相关事件的同时、或者在个体暴露于局部缺血和/或相关事件之后向个体给药抑制CDK4和/或CDK6的化合物。在一些实施方案中，在个体暴露于局部缺血和/或相关事件之后约24小时至约48小时之间向个体给药抑制CDK4和/或CDK6的化合物。
[0033]在一些实施方案中，抑制⑶K4和/或⑶K6的化合物为选择性⑶K4和/或⑶K6抑制剂。在一些实施方案中，所述选`择性CDK4/6抑制剂是除CDK4和/或CDK6以外的细胞周期蛋白依赖性激酶的不良抑制剂。
[0034]在一些实施方案中，诱发局部缺血的事件是心脏手术，或者与低血压性发作相关的其他手术。在一些实施方案中，诱发局部缺血的事件是给药用于CT扫描、幽门成形术(pylorogram)和冠状动脉造影术(artiography)的放射性造影剂。在一些实施方案中，诱发局部缺血的事件是与血容量减少(例如，由于失血)和/或低血压时期相关的创伤。
[0035]在一些实施方案中，诱发局部缺血的事件是给药减少肾血流的药物或物质，如阿司匹林、布洛芬、他克莫司和/或环胞素。在一些实施方案中，诱发局部缺血的事件是由动脉栓塞或者原位动脉或静脉血栓形成引起的急性组织局部缺血或梗死。在一些实施方案中，诱发局部缺血的事件是肠扭结的扭曲或者器官血流的其他短暂解剖学中断。在一些实施方案中，诱发局部缺血的事件是在移植之前收获、转运和/或冷藏肾同种异体移植物。
[0036]本发明公开的主题的目的是提供通过向个体给药有效量的CDK4/6抑制剂化合物来保护所述个体中的健康细胞免受局部缺血的影响的方法。
[0037]本发明公开的主题的目的已在上文中陈述，并且其全部或部分通过本发明公开的主题来实现，当连同下文最佳描述的附图进行描述时，其他目的会变得明显。【专利附图】

【附图说明】
[0038]图1A为示出CDK4/6抑制诱导原代人肾近端小管上皮细胞中的G1停滞的一组直方图。用不同浓度(0nM、10nM、30nM、100nM、300nM或ΙμΜ)的6-乙酰基-8-环戊基-5-甲基-2- (5-哌嗪-1-基-吡啶-2-基氨基)-8Η-吡啶并-[2，3-d]嘧啶-7-酮(PD0332991)处理16小时的原代人肾近端小管上皮细胞的细胞周期分析的代表性直方图。将细胞收获、固定、染色并通过流式细胞术分析。利用Verity (Verity SoftwareHouse, Topsham, Maine, United States of America)的 Mod-Fit? 软件拟合数据。渐增浓度的⑶K4/6抑制剂产生“完全的” Gl-停滞而没有细胞毒性的迹象。
[0039]图1B为示出CDK4/6抑制诱导原代人肾近端小管上皮细胞中的G1停滞的线图。用不同浓度(0nM、10nM、30nM、100nM、300nM或ΙμΜ)的6-乙酰基-8-环戊基-5-甲基-2-(5-哌嗪-1-基-吡啶-2-基氨基)-8H-吡啶并-[2，3-d]嘧啶~7~酮(PD0332991)处理16小时的原代人肾近端小管上皮细胞的细胞周期分析。将细胞收获、固定、染色并通过流式细胞术分析。利用 Verity (Verity Software House, Topsham, Maine, United Statesof America)的Mod-Fit?软件拟合数据。Gl (菱形)、G2/M(正方形)和S(三角形)中的细胞的相应％在图上示出。
[0040]图2为示出CDK4/6抑制阻断原代人肾近端小管上皮细胞的增殖的条形图。将细胞用不同浓度(0nM、10nM、30nM、100nM、300nM或ΙμΜ)的6-乙酰基-8-环戊基-5-甲基-2-(5-哌嗪-1-基-吡啶-2-基氨基)-8Η-吡啶并-[2，3-d]嘧啶_7_酮(PD0332991)处理72 小时。温育之后，利用 CellTitei'-Glo? (Promega, Madison, Wisconsin, United States
of America)定量细胞增殖。数据代表4个重复的平均值(相对光单位，RLU)+/-标准差。
[0041]图3A为示意图，其示出CDK4/6抑制剂单一剂量给药后局部缺血再灌注损伤之后5-溴-2-脱氧尿苷(BrdU)掺入上皮细胞的研究的剂量给药计划。局部缺血再灌注损伤之前将小鼠用6-乙酰基-8-环戊基-5-甲基-2- (5-哌嗪-1-基-吡啶-2-基氨基)-8H-吡啶并-[2，3-d]嘧啶-7-酮(PD0332991;150mg/kg)或媒介物(乳酸钠缓冲液)通过口服管饲法处理I小时。损伤后21小时将BrdU(100mg/kg)通过1.p.注射给药。BrdU注射后3小时将小鼠处死，并且定量BrdU掺入肾上皮细胞。
[0042]图3B为示意图，其示出2个剂量的⑶K4/6抑制剂后局部缺血再灌注损伤之后5-溴-2-脱氧尿苷(BrdU)掺入上皮细胞的研究的剂量给药计划。局部缺血再灌注损伤之前将小鼠用6-乙酰基-8-环戊基-5-甲基-2- (5-哌嗪-1-基-吡啶-2-基氨基)-8H-吡啶并-[2，3-d]嘧啶-7-酮(PD0332991;150mg/kg)或媒介物(乳酸钠缓冲液)通过口服管饲法处理I小时。损伤后21小时将BrdU(100mg/kg)通过1.p.注射给药。另外2小时后，将小鼠用PD0332991或媒介物第二次处理。第二次剂量给药后22小时，小鼠接受BrdU的第二次注射。第二次注射BrdU后3小时，将小鼠处死，并且定量BrdU掺入肾上皮细胞。
[0043]图4A为示出局部缺血性损伤后24小时用⑶K4/6抑制剂处理防止上皮细胞进入S-期的条形图。图的右边示出来自局部缺血再灌注损伤(IRI)前I小时根据图3A所示的剂量给药计划用媒介物(浅色阴影柱)处理的5只小鼠和用6-乙酰基-8-环戊基-5-甲基-2-(5-哌嗪-1-基-吡啶-2-基氨基)-8H-吡啶并-[2，3-d]嘧啶~7~酮(PD0332991 ；深色阴影柱)处理一次的6只小鼠的5-溴-2-脱氧尿苷(BrdU)阳性细胞的平均数据。双向AN0VA, 001 (Bonferroni’ s事后检验)。图的左边示出用媒介物(浅色阴影柱)或Η)0332991(深色阴影柱)处理但不进行局部缺血再灌注损伤(CLK)的小鼠的数据。
[0044]图4B为示出局部缺血性损伤后48小时用⑶K4/6抑制剂处理防止上皮细胞进入S-期的条形图。图的右边示出来自进行局部缺血再灌注损伤(IRI)并根据图3B所示的剂量给药计划用媒介物(浅色阴影柱，n=5)或用6-乙酰基-8-环戊基-5-甲基-2-(5-哌嗪-1-基-吡啶-2-基氨基)-8H-吡啶并-[2，3-d]嘧啶-7-酮(PD0332991 ;深色阴影柱，n=6)处理两次的小鼠的5-溴-2-脱氧尿苷(BrdU)阳性细胞的平均数据。双向ANOVA, 001 (BonferroniJ s事后检验)。图的左边示出根据剂量给药计划用媒介物(浅色阴影柱)或Η)0332991(深色阴影柱)处理，仅不进行局部缺血再灌注损伤(CLK)的小鼠的数据。
[0045]图5为示出用6-乙酰基-8-环戊基-5-甲基-2-(5-哌嗪-1-基-吡啶_2_基氨基)-8!1-吡啶并-[2，3-(1]嘧啶-7-酮(PD0332991)处理在双侧局部缺血再灌注损伤后24小时显著降低血清肌酸酐水平。手术前7天采集基线血清肌酸酐水平，并且媒介物处理组与药物处理组之间没有可察觉的基线差异(分别为.050mg/dL±0.027和0.044mg/dL±0.044)。手术后24小时，媒介物组中的血清肌酸酐为2.27mg/dL±0.0732，而药物处理组中的血清肌酸酐为1.74mg/dL±0.143。在媒介物组中N=8，而在药物处理组中N=9。通过双向ANOVA用Bonferroni事后检验分析的001。
【具体实施方式】
[0046]参考所附实施 例(其中示出代表性实施方案)，现在在下文中更充分地描述本发明公开的主题。但是，本发明公开的主题可以以不同的形式体现，并且不应当解释为受限于本文所示的实施方案。更确切地，提供这些实施方案以使本公开充分且完整，并且这些实施方案会向本领域技术人员充分传达本发明的实施方案的范围。
[0047]除非另外限定，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所述主题所属领域的技术人员的通常理解相同的含义。本文提及的所有出版物、专利申请、专利及其他参考文献整体援引加入本文。
[0048]在整个说明书和权利要求中，给定的化学式或化学名应当包括所有活性的旋光异构体和立体异构体，以及外消旋混合物(若存在此类异构体和混合物)。
[0049]在一些实施方案中，本发明公开的主题允许保护肾免受局部缺血和诱发局部缺血的肾毒素的急性毒性作用。在肾损伤之前、期间或之后立即给药可口服和无毒的小分子激酶抑制剂以在较晚的时间点增强肾再生。
[0050]据证实对肾损伤应答诱导肾增殖。如本文第一次公开的，看来局部缺血后的肾增殖依赖于⑶K4/6的激酶活性。例如，如图4A和4B所示，通过⑶K4/6抑制剂的给药可以减少局部缺血后的肾细胞增殖。此外，在肾损伤附近的一段时间中，某些循环肾毒素可以以细胞周期依赖性方式进一步增加肾损伤。因此，通过药理使用CDK4/6抑制剂将肾上皮细胞短暂维持在Gl (药理静止或PQ)可以在清除循环肾毒素后允许增强的肾修复。参见图5。在局部缺血性损伤时短暂PQ会增强随后的肾恢复。因此，本发明公开的主题利用这样的发现，增殖的细胞对外毒素高度敏感，因此短暂PQ是治疗性的。本发明公开的主题可以包括在肾局部缺血性损伤之前、同时或之后(如20小时内)给药(例如，口服或IV)CDK4/6抑制剂(例如，选择性CDK4/6抑制剂)。可以维持CDK4/6抑制剂的治疗水平直至诱发肾损伤的条件已逆转(一般24-48小时)。然后可以撤走CDK4/6抑制剂(利用不被肾完全清除的化合物)，并且肾再生性增殖可以继而发生。例如，可以在与低血压相关的手术(例如心脏搭桥手术)之前或者在转运肾同种异体移植物(例如肾移植中的冷-局部缺血)之前或者在使用包含碘的放射性造影剂(其诱发肾局部缺血)之前诱导PQ。这样的损伤后24-48小时在肾毒素已清除和/或全身血压已恢复时PQ可以逆转。
[0051]因此， 本发明公开的主题部分涉及这样的观察，药理静止提供保护防止形成肾损伤，特别是肾局部缺血。例如，肾局部缺血可以由任何原因(例如手术或创伤性休克期间)的低血压所致，并且还是几种肾毒性药物(例如但不限于用于CAT扫描的包含碘的造影剂)的损伤机制。
[0052]1.定义
[0053]虽然我们认为本领域技术人员完全理解以下术语，但是为了便于说明本发明公开的主题解释以下定义。
[0054]遵循长期的专利法常规，术语“一个(a) ”、“一个(an) ”和“这个(the) ”在本申请包括权利要求中使用时是指“一个(种)或多个(种)”。因此，例如，提及“化合物”或“细胞”包括多个这样的化合物或细胞等。
[0055]与“包括”、“含有”或“特征是”同义的术语“包含”是包容性或开放性的，并且不排除额外的未列举的元素或方法步骤。“包含”是用于权利要求语言的专门术语，其表示所列举的元素是必不可少的，但是可以加入其他元素，并且仍然形成权利要求的范围内的构成。
[0056]在本文中使用时，短语“由…组成”排除权利要求中未指明的任何元素、步骤或成分。当短语“由…组成”出现在权利要求的主体中而不是紧接在前序之后时，其仅限制该主体所列出的元素；其他元素并未从整个权利要求排除。
[0057]在本文中使用时，短语“基本上由…组成”将权利要求的范围限制在指定的物质或步骤，加上不会实质上影响所要求保护的主题的基本和新特征的物质或步骤。
[0058]关于术语“包含”、“由…组成”和“基本上由…组成”，当本文中使用这三个术语中的一个时，本发明公开和要求保护的主题可以包括另外两个术语的使用。
[0059]术语“和/或”，当用于描述两种项目或情况，例如CDK4和/或CDK6时，是指两种项目或情况均存在或均适用的情况，以及仅所述项目或情况之一存在或适用的情况。因此，⑶K4和/或⑶K6抑制剂可以是抑制⑶K4和⑶K6的化合物、仅抑制⑶K4的化合物或者仅抑制⑶K6的化合物。
[0060]“健康细胞”或“正常细胞”是指个体中的不表现出疾病(例如但不限于癌症或其他增殖性疾病)的特征、症状和/或标志的任何细胞。在一些实施方案中，所述健康细胞是肾细胞。在一些实施方案中，所述健康细胞是组织如肾中的细胞。在一些实施方案中，所述细胞或组织的特征在于损伤后的增殖是⑶K4/6依赖性的，并且在一些实施方案中，所述损伤是局部缺血相关的。
[0061]“局部缺血”可以指组织或器官供血不足，这导致所述组织或器官不能满足代谢的需要。向局部缺血性器官或组织再灌注(恢复血流)可以导致产生过量的活性氧物质(ROS)和活性氮物质(RNS)，因而引起氧化应激，这导致一系列的事件如线粒体氧化磷酸化的改变，ATP的减少(这还在局部缺血期间发生并作为局部缺血的结果)，胞内钙的增加以及蛋白激酶、磷酸酶、蛋白酶、脂肪酶和核酸酶的激活，导致细胞功能/完整性的丧失。[0062]局部缺血再灌注损伤(IRI)指在经历局部缺血(例如，当器官在移植或自体移植中通过手术切除和重新连接时)的组织中血液循环重新开始后发生的损伤。通过额外的实例而不是限制的方式，这样的损伤还在血液循环为了器官移植中断后重新开始时发生；在心肌梗死后用经皮腔内冠状动脉成形术(PTCA)、支架或搭桥处理冠状动脉后发生；以及在向中风患者给药溶栓剂后发生。另一实例是在为了心脏手术暂时中断心脏血流时，通常通过心脏停跳溶液的同时给药。另一实例是当在四肢上充气止血带时由整形外科医生在无血区域中为了手术中断四肢的血流。这样的损伤可以在许多组织中发生，例如但不限于肾、肠、心脏、肝、脑、甲状腺、皮肤、肠粘膜、听觉系统、肺、膀胱、卵巢、子宫、睾丸、肾上腺、胆囊、胰、胰岛、胃、血管或肌肉(例如，骨骼肌、平滑肌或心肌)组织以及它们的组合。在一些实施方案中，所述损伤在心脏、肺、肾组织或它们的组合中发生。在一些实施方案中，患有所述损伤的细胞或组织的特征在于损伤后的增殖是CDK4/6依赖性的。
[0063]在一些实施方案中，损伤发生在肾细胞或组织中。因此，在一些实施方案中，通过本发明公开的主题治疗(例如，减轻或预防)的IRI可以包括肾局部缺血再灌注损伤。在一些实施方案中，肾细胞或组织的特征在于损伤后的增殖是⑶K4/6依赖性的。
[0064]“有风险暴露于局部缺血”是指预定在将来暴露于局部缺血的个体，或者有机会在将来无意地暴露于局部缺血的个体。
[0065]“化合物的药学有效量”是指在个体中有效提供有益结果的量。在一些实施方案中，有效量是暂时(例如，几小时或几天)诱导个体中的细胞的静止状态所需的量。
[0066]在一些实施方案中，抑制⑶K4和/或⑶K6的化合物没有脱靶(off-target)效应，例如但不限于长期毒性、抗氧化效应和/或雌激素效应。“没有”可以指CDK4/6抑制剂化合物不具有不期望的或脱靶效应，特别是当其在体内使用或者通过基于细胞的测定进行评价时。
[0067]在一些实施方案 中，“没有”可以指选择性CDK4/6抑制剂不具有脱靶效应，例如但不限于长期毒性、抗氧化效应、雌激素效应、酪氨酸激酶抑制效应、对除CDK4/6之外的CDK的抑制效应；和/或非CDK4/6依赖性细胞中的细胞周期停滞。
[0068]“基本上没有”脱靶效应的选择性⑶K4/6抑制剂是这样的⑶K4/6抑制剂，其可以具有一些较小(minor)的脱靶效应，所述脱靶效应不干扰所述抑制剂提供对抗CDK4/6依赖性细胞中的细胞毒性化合物的保护作用的能力。例如，“基本上没有”脱靶效应的⑶K4/6抑制剂可以对其他⑶K具有一些较小的抑制效应(例如，对⑶Kl或⑶K2的IC50>0.5 μ Μ; >1.0 μ M或者>5.0 μ Μ),只要所述抑制剂提供⑶Κ4/6依赖性细胞中的选择性Gl停滞。
[0069]“减轻”或“预防”或其语法变体分别是指，减少效应或者完全防止效应发生。“缓解”可以指减轻和/或预防。
[0070]“药理性静止”是指细胞周期的暂时停滞。
[0071]在一些实施方案中，本发明公开的主题中所治疗的个体期望是人个体，但是应当理解本文所述的方法对所有脊椎动物物种(例如，哺乳动物、鸟类等)有效，术语“个体”旨在包括所有脊椎动物物种。
[0072]更具体地，本文提供哺乳动物的治疗，例如，人，以及由于濒危而具有重要性的那些哺乳动物(例如西伯利亚虎)、对人类具有经济重要性(为了供人食用而在农场饲养的动物)和/或社会重要性(作为宠物饲养或在动物园中饲养的动物)的那些哺乳动物，例如，除了人之外的食肉动物(例如猫和狗)、猪类(猪、肉猪和野猪)、反刍动物(例如牛、公牛、绵羊、长颈鹿、鹿、山羊、野牛和骆驼)和马。因此，本文所述的方法的实施方案包括家畜的治疗，包括但不限于家养猪(猪和肉猪)、反刍动物、马等。
[0073]在本文中使用时，术语“烷基”是指C1J(含端值)、线性的(即，“直链的”)、支链的、或环状的、饱和的、或者至少部分不饱和的以及在一些情况中完全不饱和的(即，烯基和炔基)经链，包括例如甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、戍基、己基、羊基、乙烯基、丙烯基、丁烯基、戍烯基、己烯基、羊烯基、丁二烯基、丙炔基、丁炔基、戍炔基、己块基、庚炔基和丙二烯基基团。“支链的”是指其中低级烷基基团例如甲基、乙基或丙基与直链烷基链相连的烷基基团。“低级烷基”是指含有1-约8个碳原子，例如1、2、3、4、5、6、7或8个碳原子的烷基基团(即Ci_8烷基)。“高级烷基”是指含有约10-约20个碳原子，例如
10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个碳原子的烷基基团。在某些实施方案中，“烷基”特指Ci_8直链烷基。在其他实施方案中，“烷基”特指Ci_8支链烷基。
[0074]烷基基团可以任选地由一个或多个烷基基团的取代基取代(“取代的烷基”)，所述取代基可以相同或不同。术语“烷基基团的取代基”包括但不限于烷基、取代的烷基、卤代、芳基氨基、酰基、羟基、芳氧基、烷氧基、烷硫基、芳硫基、芳烷基氧基、芳烷基硫基、羧基、烷氧基羰基、氧代和环烷基。可以沿着烷基链任选地插入一个或多个氧原子、硫原子或者取代或未取代的氮原子，其中氮的取代基是氢、低级烷基(本文也称为“烷基氨基烷基”)或芳基。
[0075]因此，在本文中使用时，术语“取代的烷基”包括本文定义的烷基基团，其中所述烷基基团的一个或多个原子或官能团被另外的原子或官能团(包括例如烷基、取代的烷基、卤素、芳基、取代的芳基、烷氧基、羟基、硝基、氣基、烷基氣基、二烷基氣基、硫酸酷和疏基)替代。
[0076]本文使用的术语“芳基”是指芳香族部分，其可以是单个芳香环，或者稠合的、共价连接的或连接至共有基团(例如但不限于亚甲基或亚乙基部分)的多个芳香环。所述共有的连接基团还可以是羰基(如在二苯甲酮中)、氧(如在二苯醚中)或氮(如在二苯胺中)。术语“芳基”具体地包括杂环芳香化合物。芳香环可以包括苯基、萘基、联苯基、二苯醚、二苯胺和二苯甲酮等。在特定的实施方案中，术语“芳基”是指含有约5-约10个碳原子(例如5、6、7、8、9或10个碳原子)并且包含5元-和6-元烃和杂环芳香环的环状芳香基团。
[0077]芳基基团可以任选地由一个或多个芳基基团的取代基取代(“取代的芳基”)，所述取代基可以相同或不同，其中“芳基基团的取代基”包括烷基、取代的烷基、芳基、取代的芳基、芳烷基、羟基、烷氧基、芳氧基、芳烷基氧基、羧基、羰基、酰基、卤代、硝基、烷氧基羰基、芳氧基羰基、芳烷氧基羰基、酰氧基、酰基氨基、芳酰基氨基、氨基甲酰基、烷基氨基甲酰基、二烷基氨基甲酰基、芳硫基、烷硫基、亚烷基和-NR’R"(其中R’和R"可以各自独立地为氢、烷基、取代的烷基、芳基、取代的芳基和芳烷基)。
[0078]因此，在本文中使用时，术语“取代的芳基”包括本文定义的芳基基团，其中所述芳基基团的一个或多个原子或官能团被另外的原子或官能团(包括例如烷基、取代的烷基、卤素、芳基、取代的芳基、烷氧基、羟基、硝基、氣基、烷基氣基、二烷基氣基、硫酸酷和疏基)替代。[0079]芳基基团的具体实例包括但不限于环戊二烯基、苯基、呋喃、噻吩、吡咯、吡喃、批啶、咪唑、苯并咪唑、异噻唑、异噁唑、吡唑、吡嗪、三嗪、嘧啶、喹啉、异喹啉、喷哚、咔唑等。
[0080]术语“杂芳基”是指其中芳香环或环的骨架中的至少一个原子是除碳以外的原子的芳基基团。因此，杂芳基基团含有一个或多个选自包括但不限于氮、氧和硫的非碳的原子。
[0081]在本文中使用时，术语“酰基”是指其中羧基基团的-OH已被另一个取代基替代的有机羧酸基团(即，由RCO—表示，其中R是本文定义的烷基或芳基基团)。因此，术语“酰基”具体地包括芳基酰基基团，例如乙酰基呋喃和苯甲酰甲基基团。酰基基团的具体实例包括乙酰基和苯甲酰基。
[0082]“环状的”和“环烷基”是指含有约3-约10个碳原子(例如3、4、5、6、7、8、9或10
个碳原子)的非芳香的单环或多环体系。环烷基基团任选地可以是部分不饱和的。环烷基基团还可以任选地由本文定义的烷基基团的取代基、氧代和/或亚烷基取代。沿着环烷基链可以任选地插入一个或多个氧原子、硫原子或者取代或未取代的氮原子，其中氮的取代基是氢、烷基、取代的烷基、芳基或取代的芳基，由此得到杂环基团。代表性的单环环烷基环包括环戊基、环己基和环庚基。多环的环烷基环包括金刚烷基、八氢萘基、萘烷、樟脑、莰烷和降金刚烷基(noradamantyl)。
[0083]术语“杂环”或“杂环的”是指其中环状环的骨架碳原子中的一个或多个被杂原子(例如氮、硫或氧)替代的环烷基基团(即，上文所述的非芳香的环状基团)。杂环的实例包括但不限于四氢呋喃、四氢吡喃、吗啉、二氧杂环己烷、哌啶、哌嗪和吡咯烷。
[0084]“烷氧基(alkox yl) ”或“烷氧基(alkoxy) ”是指烷基_0_基团,其中烷基如上所述。在本文中使用时，术语“烷氧基”可以指例如甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基、丁氧基、叔丁氧基和戍氧基。术语“氧基烷基”可以与“烷氧基”互换使用。
[0085]“芳氧基(aryloxyl) ”或“芳氧基(aryloxy) ”是指芳基_0_基团,其中芳基基团如上所述，包括取代的芳基。在本文中使用时，术语“芳氧基”可以指苯氧基或己氧基，以及被烷基、取代的烷基、卤代或烷氧基取代的苯氧基或己氧基。
[0086]“芳烷基”是指芳基-烷基-基团，其中芳基和烷基如上所述并且包括取代的芳基和取代的烷基。示例性芳烷基基团包括苄基、苯乙基和萘甲基。
[0087]“芳烷基氧基(aralky1xyI) ”或“芳烷基氧基(aralky1xy) ”是指芳烷基_0_基团，其中所述芳烷基基团如上所述。示例性芳烷基氧基基团是苄氧基。
[0088]术语“氨基”是指-NR’ R”基团，其中R’和R”各自独立地选自包括以下基团的组:H以及取代和未取代的烷基、环烷基、杂环、芳烷基、芳基和杂芳基。在一些实施方案中，氨基基团是-NH2。“氨基烷基”和“氨基芳基”是指-NR’ R”基团，其中分别地，R’如上文关于氨基所定义的，R”是取代或未取代的烷基或芳基。
[0089]“酰氨基”是指酰基-NH-基团，其中酰基如上所述。
[0090]术语“羰基”是指-(C=O) _，或者与上文命名的母体基团的碳原子连接的成双键的
氧取代基。
[0091]术语“羧基”是指-C00H基团。
[0092]在本文中使用时，术语“卤代”、“卤化物”或“卤素”是指氟、氯、溴和碘基团。
[0093]术语“羟基(hydroxyl) ”和“羟基(hydroxy) ”是指-0H基团。[0094]术语“氧代”是指其中碳原子被氧原子替代的上文已述的化合物。
[0095]术语“氰基”是指-CN基团。
[0096]术语“硝基”是指-NO2基团。
[0097]术语“硫代”是指其中碳或氧原子被硫原子替代的上文已述的化合物。
[0098]I1.化合物和方法
[0099]在一些实施方案中，本发明公开的主题允许保护肾免受局部缺血和诱发局部缺血的肾毒素的急性毒性作用。在肾损伤之前、期间或之后立即给药可口服和无毒的小分子激酶抑制剂以在较晚的时间点增强肾再生。对肾损伤应答而诱导肾增殖。见图4A和4B。在肾损伤附近的一段时间中，某些循环肾毒素会以细胞周期依赖性方式进一步增加肾损伤。因此，通过药理使用CDK4/6抑制剂将肾上皮细胞短暂维持在Gl (药理静止或PQ)会在清除循环肾毒素后允许增强的肾修复。见图5。在局部缺血性损伤时短暂PQ会增强随后的肾恢复。该发现利用这样的发现，增殖细胞对外毒素高度敏感，因此短暂PQ是治疗性的。所述方法可以包括在肾局部缺血性损伤之前、同时或之后(例如20小时内)给药(口服或IV)CDK4/6抑制剂。所述CDK4/6抑制剂可以是选择性CDK4/6抑制剂。可以维持CDK4/6抑制剂的治疗水平直至诱发肾损伤的条件已逆转(一般24-48小时)。然后可以撤走CDK4/6抑制剂(利用不被肾专门清除的化合物)，并且肾再生性增殖会继而发生。例如，可以在与低血压相关的手术(例如心脏搭桥手术)之前或者在使用包含碘的放射性造影剂之前诱导PQ0这样的损伤后24-48小时在肾毒素已清除和/或全身血压已恢复时PQ可以逆转。
[0100]肾通常是静止的器官，但是其在损伤时能够通过细胞增殖来极大地修复。肾对减少的血流以及减少肾血流的毒素所致的局部缺血特别敏感。局部缺血性损伤之后，肾上皮细胞增殖显著增加。如本文 所示，局部缺血性损伤之后的增殖可以被诱导PQ的CDK4/6抑制剂所抑制。见图4A和4B。在损伤后12-72小时持续的PQ允许清除肾损伤时产生的循环肾毒素，从而促进肾恢复。
[0101]Davis等人的美国专利第6, 369.086号(下称“‘086专利”)看来描述:选择性⑶K抑制剂可以用于限制细胞毒性剂的毒性并且可以用来防止化疗诱发的脱发。具体地，‘086专利描述了作为特异性CDK2抑制剂的羟吲哚化合物。相关的期刊文献(参见Davis etal.，Science, 291，134-137 (2001))看来描述:⑶K2的抑制产生细胞周期停滞，降低上皮细胞对细胞周期活性的抗肿瘤药的敏感性，并且可以预防化疗诱发的脱发。但是，该期刊文献由于不可再现结果而后被撤回。不同于这些标榜的选择性CDK2抑制剂的保护效应(通过撤回所述期刊文章而对其质疑)，在一些实施方案中，本发明公开的主题涉及保护组织和/或细胞如肾组织和/或细胞免受局部缺血的影响。
[0102]可以通过用抑制剂预治疗(即，预定暴露于局部缺血或有风险暴露于局部缺血的个体的先前CDK4/6抑制剂治疗)来向个体提供CDK4/6抑制剂的保护效果。
[0103]在一些实施方案中，诱发局部缺血的事件是心脏手术，或者与低血压性发作相关的其他手术。在一些实施方案中，诱发局部缺血的事件是给药用于CT扫描、幽门成形术和冠状动脉造影术的放射性造影剂。在一些实施方案中，局部缺血的诱发性发作是肾同种异体移植物收获(例如，尸体的肾同种异体移植物收获)，具有在血流不存在下转运和/或储存肾期间诱发的冷-局部缺血。在一些实施方案中，诱发局部缺血的事件是与血容量减少(例如，由于出血、脱水等)和/或低血压时期相关的创伤。在一些实施方案中，诱发局部缺血的事件是给药减少血流量(例如，肾血流)的药物或物质，例如但不限于阿司匹林、布洛芬、他克莫司和/或环胞素。在一些实施方案中，诱发局部缺血的事件是由动脉栓塞或者原位动脉或静脉血栓形成引起的急性组织局部缺血或梗死。在一些实施方案中，诱发局部缺血的事件是肠扭结的扭曲或者器官血流的其他短暂解剖学中断。
[0104]在本文中使用时，术语“选择性CDK4/6抑制剂化合物”是指这样的化合物，其选择性抑制⑶K4和⑶K6中的至少一种，或者其主要的作用模式是通过抑制⑶K4和/或⑶K6。因此，选择性CDK4/6抑制剂是这样的化合物，其一般具有比对其他激酶或对其他酶更低的对⑶K4和/或⑶K6的50%抑制浓度(IC5tl)。在一些实施方案中，所述选择性⑶K4/6抑制剂对其他⑶K (例如⑶Kl和⑶K2)的IC5tl可以是所述化合物对⑶K4或⑶K6的IC5tl的至少
2、3、4、5、6、7、8、9或10倍。在一些实施方案中，所述选择性⑶K4/6抑制剂对其他⑶K的IC5tl可以是所述化合物对CDK4或CDK6的IC5tl的至少20、30、40、50、60、70、80、90或100倍。在一些实施方案中，所述选择性CDK4/6抑制剂对其他CDK的IC5tl可以是所述化合物对CDK4或⑶K6的IC5tl的100倍以上或1000倍以上。在一些实施方案中，所述选择性⑶K4/6抑制剂化合物是选择性抑制CDK4和CDK6的化合物。在一些实施方案中，所述CDK4/6抑制剂不是天然存在的化合物(例如，异黄酮)。在一些实施方案中，所述CDK4/6抑制剂是一种或多种酪氨酸激酶的较差的抑制剂(例如，>1 μ M体外IC5tl)。在一些实施方案中，所述⑶Κ4/6抑制剂是丝氨酸和/或苏氨酸激酶的高效抑制剂。在一些实施方案中，所述CDK4/6抑制剂是较差的⑶Kl抑制剂(例如，(例如，>1 μ M体外IC5tl)。在一些实施方案中，所述⑶Κ4/6抑制剂的特征是与CDKl相比具有10倍或50倍或100倍或更大的抑制CDK4或CDK6的相对效力。
[0105]在一些实施方案中，所述选择性CDK4/6抑制剂化合物是选择性诱导CDK4/6依赖性细胞中的Gl细胞周期停滞的化合物。因此，当按照本发明公开的方法用所述选择性CDK4/6抑制剂化合物处理时， 处于Gl期的CDK4/6依赖性细胞的百分比升高，而处于G2/M期和S期的⑶Κ4/6依赖性细胞 的 百分比降低。在一些实施方案中，所述选择性⑶Κ4/6抑制剂是这样的化合物，其诱导CDK4/6依赖性细胞中的基本上纯粹的(pure)(即“完全的(clean) ”)G1细胞周期停滞(例如，其中用所述选择性CDK4/6抑制剂处理诱导细胞周期停滞，以致按照标准方法(例如，碘化丙锭染色或其他)测定，大多数的细胞停滞于G1，处于G2/M和S期的细胞群体合计为总细胞群体的20%、15%、12%、10%、8%、6%、5%、4%、3%、2%、1%或更少)。
[0106]虽然已报告非特异性激酶抑制剂星形孢菌素在一些细胞类型中间接地诱导Gl停滞(参见 Chen et al.，J.Nat.Cancer Inst.，92，1999-2008 (2000))，但是选择性 CDK4/6 抑制剂可以直接且选择性地诱导细胞(例如肾上皮细胞)中的Gl细胞周期停滞以提供保护，具有减低的长期毒性，并且不需要在暴露于局部缺血之前用所述抑制剂长时(例如，48小时或更长)治疗。具体地，虽然一些非选择性激酶抑制剂可以通过降低CDK4蛋白水平引起一些细胞类型中的Gl停滞，但是，不拘于任何一种理论，认为本发明公开的方法的益处至少部分归因于选择性CDK4/6抑制剂能够直接抑制细胞(例如，肾细胞)中的CDK4/6的激酶活性而不降低它们的细胞浓度。
[0107]在一些实施方案中，所述选择性CDK4/6抑制剂化合物是基本上没有脱靶效应(特别是与抑制除CDK4和/或CDK6之外的激酶相关)的化合物。在一些实施方案中，所述选择性⑶K4/6抑制剂化合物是除⑶K4/6之外的⑶K(例如，⑶Kl和⑶Κ2)的较差的抑制剂(例如，>1 μ M IC50)。在一些实施方案中，所述选择性⑶Κ4/6抑制剂化合物在非⑶Κ4/6依赖性细胞中不诱导细胞周期停滞。在一些实施方案中，所述选择性CDK4/6抑制剂化合物是酪氨酸激酶的较差的抑制剂(例如，>1μΜ IC5tl)。其他不期望的脱靶效应包括但不限于长期毒性、抗氧化效应和雌激素效应。
[0108]抗氧化效应可以通过本领域已知的标准测定进行测定。例如，无显著抗氧化效应的化合物是不显著地清除自由基例如氧自由基的化合物。可以将化合物的抗氧化效应与抗氧化活性已知的化合物例如染料木黄酮比较。因此，无显著的抗氧化活性的化合物可以是抗氧化活性为染料木黄酮的抗氧化活性的约1/2、1/3、1/5、1/10、1/30或1/100的化合物。雌激素活性也可以通过已知的测定进行测定。例如，非雌激素化合物是不显著地结合和激活雌激素受体的化合物。基本上没有雌激素效应的化合物可以是雌激素活性为具有雌激素活性的化合物(例如，染料木黄酮)的约1/2、1/3、1/5、1/10、1/20或1/100的化合物。
[0109]可以按照本发明公开的方法使用的⑶Κ4/6抑制剂包括任何已知的小分子(例如，<1000道尔顿，<750道尔顿、或者少于〈500道尔顿)⑶Κ4/6抑制剂，或者其药学可接受的盐。在一些实施方案中，所述抑制剂是非天然存在的化合物(即，自然界中未发现的化合物)。已报道几类化合物具有CDK4/6抑制能力(例如，在无细胞测定中)。用于本发明公开的方法的选择性CDK4/6抑制剂可以包括但不限于，吡啶并[2，3-d]嘧啶(例如，吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-酮和2-氨基-6-氰基-吡啶并[2，3-d]嘧啶-4-酮)、三氨基嘧啶、芳基[a]吡咯并[3，4-d]咔唑、含氮的杂芳基取代的脲、5-嘧啶基-2-氨基噻唑、苯并噻二嗪、吖啶硫酮和异喹啉酮。
[0110]在一些实施方案中，所述吡啶并[2，3-d]嘧啶为吡啶并[2，3-d]嘧啶酮。在一些实施方案中，所述吡啶并[2，3-d]嘧啶酮为吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-酮。在一些实施方案中，所述吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-酮由氨基芳基或氨基杂芳基基团取代。在一些实施方案中，所述吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-酮由氨基吡啶基团取代。在一些实施方案中，所述吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-酮为2-(2-吡啶基)氨基吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-酮。例如，所述吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-酮化合物可以具有Barvian等人的美国专利公开第2007/0179118号中所述的式(II)的结构，该专利公开整体援引加入本文。在一些实施方案中，所述吡啶并[2，3-d]嘧啶化合物为6-乙酰基-8-环戊基-5-甲基-2-(5-哌嗪-1-基-吡啶-2-基氨基)-8H-吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-酮(B卩，TO0332991)或其药学可接受的盐。参见Toogoodet al.，J.Med.Chem.，2005，48，2388-2406。
[0111]在一些实施方案中，所述吡啶并[2，3-d]嘧啶酮为2-氨基-6-氰基-吡啶并[2，3-d]嘧啶-4-酮。例如，Tu等人描述了包括2-氨基-6-氰基-吡啶并[2，3-d]嘧啶-4-酮在内的选择性CDK4/6抑制剂。参见Tu et al.，Bioorg.Med.Chem.Lett.,2006, 16, 3578-3581。[0112]在本文中使用时，“三氨基嘧啶”是其中嘧啶环中的至少三个碳原子由具有式-NR1R2的基团取代的嘧啶化合物，其中R1和R2独立地选自H、烷基、芳烷基、环烷基、杂环、芳基和杂芳基。每个R1和R2的烷基、芳烷基、环烷基、杂环、芳基和杂芳基基团可以进一步由一个或多个羟基、卤代、氨基、烷基、芳烷基、环烷基、杂环、芳基或杂芳基基团取代。在一些实施方案中，所述氨基基团中的至少一个是具有-NHR结构的烷基氨基基团，其中R为C1-C6烷基。在一些实施方案中，至少一个氨基基团是环烷基氨基基团或羟基取代的环烷基氨基基团，具有式-NHR，其中R是由或不由羟基基团取代的C3-C7环烷基。在一些实施方案中，至少一个氨基基团是杂芳基取代的氨基烷基基团，其中所述杂芳基基团可以进一步由芳基基团取代基取代。
[0113]芳基[a]吡咯并[3, 4-d]咔唑包括但不限于萘基[a]吡咯并[3，4_c]咔唑、喷哚并[a]吡咯并[3，4_c]咔唑、喹啉基[a]吡咯并[3，4_c]咔唑和异喹啉基[a]吡咯并[3, 4-c]咔唑。参见例如 Engler et al..Bioorg.Med.Chem.Lett..2003.13.2261-2267: Sanchez-Martinez et al., Bioorg.Med.Chem.Lett., 2003, 13, 3835-3839;Sanchez-Martinez et al., Bioorg.Med.Chem.Lett., 2003, 13, 3841-3846: Zhu et al., Bioorg.Med.Chem.Lett., 2003, 13, 1231-1235; and Zhu et al., J.Med Chem., 2003, 46, 2027-2030。合适的芳基[a]吡咯并[3，4-d]咔唑还公开于美国专利公开第2003/0229026号和第2004/0048915号中。
[0114]含氮的杂芳基取代的脲是包含脲部分的化合物，其中脲氮原子之一由含氮的杂芳基基团取代。含氮的杂芳基基团包括但不限于包含至少一个氮原子的5-10元芳基基团。因此，含氮的杂芳基基团包括例如吡啶、吡咯、喷哚、咔唑、咪唑、噻唑、异噁唑、吡唑、异噻唑、吡嗪、三唑、四唑、嘧啶、哒嗪、嘌呤、喹啉、异喹啉、喹喔啉、噌啉、喹唑啉、苯并咪唑、苯邻二甲酰亚胺等。在一些实施方案中，所述含氮的杂芳基基团可以由一个或多个烷基、环烷基、杂环基、芳烷基、芳基、杂芳基、羟基、卤代、羰基、羧基、硝基、氰基、烷氧基或氨基基团取代。在一些实施方案中，所述含氮的杂芳基取代的脲为吡唑-3-基脲。所述吡唑可以进一步由环烷基或杂环基团取代。在一些实施方案中，所述吡唑-3-基脲为:
[0115]
【权利要求】
1.一种在细胞或组织暴露于局部缺血和/或相关事件之前或之后缓解需要治疗的个体中的所述细胞或组织中源自局部缺血和/或相关事件的损伤的方法，所述方法包括向所述个体给药药学有效量的抑制细胞周期蛋白依赖性激酶4(CDK4)和/或细胞周期蛋白依赖性激酶6 (CDK6)的化合物，其中所述细胞或组织的特征在于损伤后的增殖是CDK4/6依赖性的。
2.一种在肾细胞或肾组织暴露于局部缺血和/或相关事件之前或之后缓解需要治疗的个体中的所述细胞或组织中源自局部缺血和/或相关事件的损伤的方法，所述方法包括向所述个体给药药学有效量的抑制细胞周期蛋白依赖性激酶4(CDK4)和/或细胞周期蛋白依赖性激酶6 (⑶K6)的化合物。
3.权利要求1或2的方法，其中在所述个体暴露于所述局部缺血和/或相关事件之前、在所述个体暴露于所述局部缺血和/或相关事件的同时、或者在所述个体暴露于所述局部缺血和/或相关事件之后向所述个体给药抑制CDK4和/或CDK6的化合物。
4.权利要求1-3中任一项的方法，其中在所述个体暴露于局部缺血和/或相关事件之后约24小时至约48小时之间向所述个体给药抑制CDK4和/或CDK6的化合物。
5.权利要求1-4中任一项的方法，其中所述抑制CDK4和/或CDK6的化合物为选择性CDK4/6抑制剂。
6.权利要求5的方法，其中所述选择性CDK4/6抑制剂是除CDK4和/或CDK6以外的细胞周期蛋白依赖性激酶的不良抑制剂。
7.权利要求1-6中任一 项的方法，其中所述诱发局部缺血的事件是心脏手术，或者与低血压性发作相关的其他手术。
8.权利要求1-6中任一项的方法，其中所述诱发局部缺血的事件是给药用于CT扫描、幽门成形术和冠状动脉造影术的放射性造影剂。
9.权利要求1-6中任一项的方法，其中所述诱发局部缺血的事件是与血容量减少和/或低血压时期相关的创伤。
10.权利要求1-6中任一项的方法，其中所述诱发局部缺血的事件是给药减少肾血流的药物或物质，如阿司匹林、布洛芬、他克莫司和/或环胞素。
11.权利要求1-6中任一项的方法，其中所述诱发局部缺血的事件是由动脉栓塞或者原位动脉或静脉血栓形成引起的急性组织局部缺血或梗死。
12.权利要求1-6中任一项的方法，其中所述诱发局部缺血的事件是肠扭结的扭曲或者器官血流的其他短暂解剖学中断。
13.权利要求1-6中任一项的方法，其中所述诱发局部缺血的事件是植入肾移植受者之前的肾收获和/或转运。
【文档编号】A61P7/06GK103501789SQ201180065126
【公开日】2014年1月8日 申请日期:2011年11月17日 优先权日:2010年11月17日
【发明者】D·P·迪洛克, N·E·沙普尔斯, J·C·斯特鲁姆, J·E·比希, P·J·罗伯茨, B·D·汉弗莱斯, K-K·王 申请人:北卡罗来纳大学查珀尔希尔分校, 布赖汉姆妇女医院, G1疗法公司