含有透明质酸的人工唾液的制作方法
【专利摘要】本发明提供含有透明质酸（HA）的人工唾液。由于该人工唾液在人唾液的生理范围内并表现出足够的抗菌活性，该人工唾液可用于治疗口腔干燥或口腔念珠菌病，而且可有效地用于预防或治疗唾液分泌减少所引起的并发症。
【专利说明】含有透明质酸的人工唾液
【技术领域】
[0001]本发明涉及含有透明质酸的人工唾液。
【背景技术】
[0002]透明质酸(HA)是由单位D-葡糖醛酸和N-乙酰-D-氨基葡萄糖相交替组成的糖胺聚糖。D-葡糖醛酸与N-乙酰-D-氨基葡萄糖是通过β (I — 3)键相链接的，而N-乙酰-D-氨基葡萄糖与D-葡糖醛酸是通过β (I — 4)键相链接的。在眼睛的玻璃体液、关节的骨膜液以及细胞外基质中富含ΗΑ。由于它先天的生物相容性和独特的物理性质，已在药物传递、生物相容性物质的制备、用于干眼病患者的人工眼泪、以及用于缓解骨关节炎症的物质中使用了 ΗΑ。
[0003]有报告称,在人唾液中存在ΗΑ，而且唾液中的HA有助于唾液的润滑性能及治愈性能并协助保护口腔粘膜。还有报告称，HA能起到抗念珠菌活性的作用。由于它的粘弹性和无免疫原性，HA已被认为是代替口腔干燥患者唾液的候选物质，并在一定浓度上表现出与人唾液类似的物理性质。
[0004]已知唾液中的HA的减少与口腔干燥的发病有关，这能证明HA能够保护并润滑口腔粘膜。此外，HA的伤口愈合活性和潜在抗念珠菌活性可进一步有利于患有口干的、弱于口腔粘膜损伤和念珠菌病的患者。
[0005]一直以来，人们试图用市场上可见的口腔卫生产品来强化及复原唾液的抗菌能力。在口腔卫生产品中使用最广的抗菌蛋白质包括溶菌酶(Iysozyme)和乳过氧化物酶(lactoperoxidase)。在唾液替代物中引入所述抗菌蛋白质，以复原患有口干的、易受念珠菌病侵害的患者的唾液抗菌能力 。人们已了解溶菌酶的抗真菌活性和过氧化物酶的抗真菌活性的系统。众所周知，通过将溶菌酶与过氧化物酶一起使用来增强杀伤念珠菌的活性。还未确定的是，将体外实验所得物以相同方法应用到体内环境中时，抗菌增补剂可能会减缓口腔干燥患者体内的念珠菌病的发展。
[0006]口腔能提供唾液替代物与唾液分子可共存的环境。因此，所述唾液替代物HA分子也会与人唾液的抗菌分子相互作用。在现有技术文献中已提到HA-溶菌酶复合物(VanDamme et al.Binding of Hyaluronan to Lysozyme at Various PHSAj BiochemistryInternational, 1991 Julj 24(4)， 605-13 ; Van Damme et al.Binding Properties ofGlycosaminoglycans to Lysozyme-Effect of Salt and Molecular Weight, Archives ofBiochemistry and Biophysics, 1994 April, 310(1)， 16-24 ; Moss etal.Dependenceof Salt Concentration on Glycosaminoglycan-Lysozyme Interactions in Cartilage,Archives of Biochemistry and Biophysics, 1997 December 1， 348(1)， 49-55)和HA-过氧化物酶复合物(Green et al.Depolymerization of Synovial Fluid HyaluronicAcid(HA) by the Complete Myeloperoxidase (MPO) System May Involve the Formationof a HA-MPO 1nic Complex, The Journal of Rheumatology, 1990， 17:12， 1670-5)的存在。[0007]然而，还不清楚的是，HA将何以影响溶菌酶和过氧化物酶的抗念珠菌活性，以及HA会影响什么。
【发明内容】
[0008]技术问题
由此，本发明的一个目的，在于提供含有透明质酸(HA)的人工唾液。
[0009]本发明的另一个目的，在于提供作为人工唾液所适合的HA浓度，以及抗菌添加剂溶菌酶和过氧化物的浓度。
[0010]技术问题
本发明提供含有0.4~0.6mg/mlHA的人工唾液，其特征在于，所述人工唾液包含基于100重量份HA的10~12重量份的溶菌酶、和7 — 9重量份的过氧化物酶。
[0011]根据本发明的一个实施例，在所述人工唾液中溶菌酶的基于人工唾液总量的浓度可为50~6(^g/ml，或过氧化物酶的基于人工唾液总量的浓度可为36~43Pg/ml。
[0012]根据本发明的另一个实施例，所述HA的分子量可在IOODa~10，OOOKDa范围内，但本发明不会特别限于此范围。
[0013]本发明的人工唾液可用于治疗口腔干燥或口腔念珠菌病，而且还可以用于预防或治疗唾液分泌减少所引起的并发症。因此，本发明提供用于治疗口腔干燥或口腔念珠菌病的人工唾液，或者提供用于预防或治疗唾液分泌减少所引起的并发症的人工唾液，其中所述人工唾液含有HA。
[0014]有益效果
本发明的人工唾液可用于治疗口腔干燥或口腔念珠菌病，而且由于所述人工唾液在人唾液的生理范围内并表现出足够的抗菌活性，可有效地用于预防或治疗唾液分泌减少所引起的并发症。
【专利附图】
【附图说明】
[0015]图1为说明HA对人白色念珠菌ATCC10231生长的抑制作用的图。
[0016]图2为说明HA对人白色念珠菌ATCC18804生长的抑制作用的图。
[0017]图3为说明HA对人白色念珠菌ATCC11006生长的抑制作用的图。
【具体实施方式】
[0018]下面，将结合实施例和对比实施例详细地描述本发明。然而，本发明不限于这些实施例。
[0019]本发明提供含有0.4~0.6mg/ml透明质酸(HA)的人工唾液,其特征在于,所述人工唾液含有基于100重量份HA的溶菌酶10~12重量份；和过氧化物酶7 — 9重量份。
[0020]在本发明中，由于所述HA在概念上同时含有HA和其盐，在本发明中所用的术语“HA”指透明质酸、透明质酸盐(hyaluronate)、或透明质酸与透明质酸盐的混合物。所述透明质酸盐同时包括如透明质酸钠、透明质酸钾、透明质酸钙、透明质酸镁、透明质酸锌或透明质酸钴的无机盐、以及如四丁基透明质酸(hyaluronate tetrabutyIammonium)的有机盐。必要时，可使用它们的组合物。[0021]溶菌酶是能水解细菌细胞壁上的多糖中的N-乙酰胞壁酸(N-acetylmuramicacid，NAM)与N-乙酰葡萄糖氨(NAG)之间的β_1，4_糖苷键的酶。通常，在鸡蛋清、动物组织、鼻粘膜、痰、胃液、流泪等中含有所述溶菌酶，而且所述溶菌酶具有杀菌及抗菌活性。
[0022]过氧化物酶是指能催化氧化反应以使单胺、多胺、单酚、多酚、无色颜料、抗坏血酸、细胞色素C，HI等可用以下反应式H2O2 (或CH3OOH):Η202+ΑΗ2 — 2Η20+Α表达的酶。
[0023]将HA制成在具有与唾液类似组成物的缓冲液(模拟唾液缓冲液)的浓度为0.5mg/ml时，在流变学上HA是最合适的唾液替代物。此外，作为抗菌添加剂，溶菌酶可加入基于100重量份HA的10~12重量份的量，而过氧化物酶可加入基于100重量份HA的7~9重量份的量。此时，人工唾液在人唾液的生理范围内，并表现出足够的抗菌活性。
[0024]在本发明中，所述术语“重量份”是指重量比。
[0025]当抗菌添加剂溶菌酶的量少于基于100重量份HA的10重量份，或过氧化物酶的量少于基于100重量份HA的7重量份时，所述人工唾液的抗真菌活性可能会不够。
[0026]根据本发明的一个实施例，所述人工唾液中的溶菌酶的浓度可以为基于人工唾液总量的50~6(^g/ml，或所述人工唾液中的过氧化物酶的浓度可以为基于人工唾液总量的36 ~43M<g/ml。
[0027]根据本发明的另一个实施例，所述HA的分子量可在100~10，OOOkDa范围内，但本发明不会特别限制于此。
[0028]本发明的人工唾液可以用来治疗口腔干燥或口腔念珠菌病，而且可以用来预防或治疗由唾液减少而引起的并发症。因此，本发明提供用于治疗口腔干燥或口腔念珠菌病的人工唾液，还提供用于预防或治疗由唾液减少而引起的并发症的人工唾液，其中该人工唾液包含HA。
【具体实施方式】
[0029]为能更好地理解，下面将进一步详细地描述本发明的示例性实施例。然而，这里提出的描述仅以说明优选实施例为目的，不会限制本发明的范围，从而应当理解成，在不超出本发明的范围内可作出其他等同物和修饰物。
[0030]设计下面的制备实施例以提供常用于本发明实施例的制备实施例。
[0031]制备实施例1:HA溶液
将HA (I, 630kDa, Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯)溶解在与唾液具有类似成分的缓冲液(模拟唾液缓冲液，包括SSB、0.021M的Na2HP04/NaH2P04、pH7.0、36mM的NaCl和0.96mM的CaCl2)或RPMI1640培养基中，形成三种不同的浓度(0.5、1.0和2.0mg/ml)。
[0032]制备实施例2:溶菌酶和过氧化物酶
将分别用作本发明的溶菌酶和过氧化物酶的鸡蛋清溶菌酶(HEWL)和牛乳过氧化物酶(bLPO) (Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯)溶解于SSB中。为作分析，使用浓度为30.0μδ/πι1 的 HEWL，或使用浓度为 25.0μδ/πι1 的 bLPO 。
[0033]实施例1:HA的真菌生长抑制活性
在本实验中使用了人白色念珠菌(Candida albicans)ATCC10231、18804和11006。在沙氏葡萄糖培养基(Sabouraud dextrose medium)内接种一个人白色念珠菌的菌落,其中每个人白色念珠菌生长于沙氏葡萄糖琼脂(SDA冲，然后在37°C下边搅拌培养18小时。采集，清洗细胞，然后在RPMI1640培养基中使之再悬浮，其浓度为IxlO5个细胞/ml。为检测HA的真菌生长抑制活性，将HA以不同浓度(0.5，1.0和2.0 mg/ml)溶解在100ml含有人白色念珠菌的RPMI1640培养基中，然后在37°C下边搅拌进行培养。在600nm下每隔I小时测量培养基的光密度而确定增殖期，然后将所述培养基的光密度与无HA培养基的光密度作比较。此实验重复做4次。
[0034]HA表现出对人白色念珠菌生长的抑制作用，而且该抑制作用与此实验中所用的HA的浓度成比例。所述HA对人白色念珠菌ATCCl 1006细胞株的抑制作用最强，而对人白色念珠菌ATCC18804细胞株的抑制作用最弱(见图1、2和3)。
[0035]实施例2:HA的念珠菌杀伤活性
在IOml的RPMI1640培养基中接种人白色念珠菌ATCC10231、18804以及11006的菌落各一个，然后在37°C下边搅拌培养18小时。采集，清洗细胞，然后在SSB中使之再悬浮，其浓度为IxlO5个细胞/ml。为检测HA的念珠菌杀伤活性，将20μ1细胞悬浮液以不同浓度加入到40μ1 HA (最终浓度:0.5、1.0和2.0mg/ml)中。在37°C下将样本培养1.5小时，然后每隔15分钟进行混合。将最终培养样本稀释10倍，而后在SDA板上接种50μ1 (167个细胞)稀释培养样本，各弄成3份，然后在37°C下培养一夜。通过比较实验板与无HA对照板上的菌落数量，而检测出念珠菌杀伤活性。此外，计算细胞存活率的损失(1-实验板上的菌落数/对照板上的菌落数X 100)。此实验重复做6次。
[0036]HA (最终浓度:0.5、1.0和2.0mg/ml)表现出无可测的念珠菌杀伤活性,而且表现出所述实验板的所有细胞株与对照组(无HA)相比在菌落数量上无明显差异。
[0037]实施例3:HA对溶菌酶和过氧化物酶的念珠菌杀伤活性的作用(HA与念珠菌细胞一起培养，然后用抗菌酶进行处理)
将上述培养的白念珠菌的细胞悬浮液用于SSB中，其浓度为IxlO5个细胞/ml，然后将20μ1细胞悬浮液加入到等量HA(最`终浓度:0.5、1.0和2.0mg/ml)中。在37°C下，将样本边搅拌培养I小时。40μ1所述细胞悬浮液与2(^1HEWL (最终浓度:30μ8/πι1)混合，或与20μ1过氧化物酶(最终浓度:25Pg/ml的bLPO，ImM的KSCN和ΙΟΟμΜ的H2O2)混合，然后在37°C下边搅拌培养I小时。在培养结束时，将样本稀释10倍，而后在SDA板上接种50μ1 (167个细胞)稀释培养样本，各弄成三份，然后在37°C下培养一夜。计算念珠菌杀伤活性及细胞存活率的损失。此实验重复做8次。
[0038]HA表现出对溶菌酶和过氧化物酶系统中的念珠菌杀伤活性的抑制作用，而且所述抑制作用与HA的浓度成比例。根据所述人白色念珠菌细胞株，其抑制程度也不同，但HA在
1.0-2.0mg/ml时，可完全抑制本实验中所用的溶菌酶和过氧化物酶系统中的念珠菌杀伤活性。【表1】
【权利要求】
1.含有0.4~0.6mg/ml透明质酸的人工唾液，所述人工唾液包含基于100重量份透明质酸的: 10~12重量份的溶菌酶，和 7、重量份的过氧化物酶。
2.根据权利要求1所述的人工唾液，其特征在于，所述人工唾液中溶菌酶的基于人工唾液总量的浓度为50~6(^g/ml。
3.根据权利要求1所述的人工唾液，其特征在于，所述人工唾液中过氧化物酶的基于人工唾液总量的浓度为36~43Pg/ml。
4.根据权利要求1~3中任何一项所述的人工唾液，其特征在于，所述透明质酸为透明质酸本身、透明质酸盐、或透明质酸与透明质酸盐的混合物，且所述透明质酸盐为无机盐如透明质酸钠、透明质酸钾、透明质酸钙、透明质酸镁、透明质酸锌或透明质酸钴，或为有机盐如四丁基透明质酸。
5.根据权利要求1~3中任一项所述的人工唾液，其特征在于，所述透明质酸的分子量为 100 ~10，000 kDa。
6.根据权利要求1~3中任一项所述的人工唾液，其特征在于，所述人工唾液可用于治疗口腔干燥或口腔念珠菌病。
7.根据权利要求1~3中任一项所述的人工唾液，其特征在于，所述人工唾液可用于预防或治疗唾液分泌减少所引起的 并发症。
【文档编号】A61P27/04GK103491967SQ201180068991
【公开日】2014年1月1日 申请日期:2011年4月1日 优先权日:2011年1月5日
【发明者】高弘燮, 朴文秀 申请人:首尔大学校产学协力团