专利名称：一种胰蛋白酶抑制剂及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及一种胰蛋白酶抑制剂及其制备方法和该抑制剂在制备抗癌药物中的应用。
背景技术：
GRP78(glucose-regulated protein, GRP78)在正常细胞中与 ATF—6、 IREl(inosito Ir equiring enzyme 1)禾口 PERK(double st randed RNA activated protein kinase like ER kinase)结合形成无活性状态复合体。当非折叠蛋白增多，GRP78 即与该复合体分离激活，将信号传递到细胞核中从而启动非折叠蛋白反应促进蛋白质的正确折叠，防止非折叠蛋白的累积，靶向降解错误折叠蛋白。有研究表明，GRP78在肿瘤细胞中通常发生过表达，并且可以特异的存在于肿瘤细胞的表面，而正常细胞膜表面不含GRP78。 因此，肿瘤细胞表面的GRP78可以作为抗肿瘤的特异性的分子靶点。有研究通过噬菌体展示技术发现，多肽片段可以与肿瘤细胞表面的GRP78特异结合并通过GRP78进入细胞内部， 可以作为抗肿瘤靶向药物的导肽。人类蛋白酶体CP的沉降系数为20S，分子量约700 750kD。它由α环和β环组成，每个环各有7个相同的亚单位，不同的β亚单位的催化活性尽管不同，但能互相协调使蛋白酶体具有多种蛋白酶活性，如类糜蛋白酶活性(chymotrypsin-like，ChTL)、类胰蛋白酶活性(trypsin-like，TL)、肽-谷氨酰肽水解酶活性(post-glutamyl-p印tide hy drο 1 y ζ i η g，PGPH)、支链氨基酸肽酶活性、中性氨基酸切割活性。由于蛋白酶体活性状态对细胞执行不同的功能是非常重要的，因此蛋白酶体将成为影响细胞功能的重要药物靶标，而其抑制剂有可能成为抗肿瘤的先导药物。泛素-蛋白酶体系统是细胞内调节蛋白平衡的蛋白降解系统，在细胞的生命活动中发挥了关键作用。蛋白酶体含有胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶和肽-谷氨酰肽水解酶活性，其活性的抑制可以诱导细胞凋亡。硼替佐米(Bortezomib)是第一种用作化学治疗药物的蛋白酶体抑制剂，由千年制药公司 (Millennium Pharmaceuticals)开发，市场名称为Velcade。硼替佐米主要被用于多发性骨髓瘤的治疗。值得一提的是，多发性骨髓瘤会导致血清中蛋白酶体水平的提高，而成功的化疗可以将蛋白酶体的水平恢复到正常范围。硼替佐米在治疗B细胞相关癌症的临床前和早期临床研究已经开始，但是，Bortezomib在肿瘤的治疗中表现出了许多副作用，对癌细胞的杀伤专一性不够强，因此，研发对癌细胞具特异杀伤的药物迫在眉睫，对肿瘤的预防具有重要的和深远的意义。有文献报道，已经发现一肽段可与肿瘤细胞表面的GRP78特异结合，其序列为 WIFPffIQL0本实验室通过基因工程手段将绿豆胰蛋白酶抑制剂赖氨酸活性区域与该GRP78 结合肽段(glucose-regulated protein binding ρ印tide)，通过设计一个相同的限制性内切酶位点，构建成融合蛋白，制备能够通过与肿瘤细胞表面GRP78结合，且靶向抑制肿瘤细胞蛋白酶体的靶向抗癌药物(GBP-K33)。
发明内容
本发明的目的是提供一种胰蛋白酶抑制剂及其制备方法和该抑制剂在制备抗癌药物中的应用。本发明提供的一种胰蛋白酶抑制剂，其氨基酸序列为SEQ ID NO :1，该抑制剂对癌细胞增殖有抑制作用，对癌细胞的凋亡有促进作用，对正常细胞却没有任何毒副作用。编码所述胰蛋白酶抑制剂的基因，其核苷酸序列为SEQ ID NO :2。该核苷酸序列由123个核苷酸组成。一种载体，含有上述所述的核苷酸序列。它是将编码GBP-K33的核苷酸片段克隆至原核表达载体后获得的重组子PGEX-4T-1-GBP-K33。所述的载体，是一种质粒。一种工程菌，含有上述所述的载体。是将重组子PGEX-4T-1-GBP-K33转化至一种菌中，例如大肠杆菌BL21中，构建成工程菌。胰蛋白酶抑制剂的制备方法，包括如下步骤化学合成基因GBP片段和K33，将这两段序列连接到PGEX-4T-1载体上，获得重组子PGEX-4T-1-GBP-K33，将该重组子转化到大肠杆菌BL21，构建大肠杆菌工程菌pGEX-4T-l-GBP-K33/BL21，将该工程菌接种在含氨苄青霉素的LB培养基中，37°C振荡培养至A 600nm为0. 4-0. 6，加入IPTG使终浓度为0. 5mmol/ L，诱导表达3-5小时，收集菌体，将上清液经亲和层析纯化获得目的蛋白。胰蛋白酶抑制剂在制备抗癌药物中的应用。用MTT法和DAPI染色方法研究 GBP-K33的生物学活性，实验证明GBP-K33特异的作用于癌细胞，能有效的抑制结肠癌细胞的活力。用DAPI进行细胞核染色发现GBP-K33在诱导结肠癌细胞凋亡方面有明显的促进作用。
图1 :pGEX-4T-l-GBP_K33重组质粒的鉴定(其中泳道一为标准分子量，泳道二是阳性质粒，泳道三是重组质粒经BamH I和Bio I双酶切)图 2 :GBP_K33Glutathione Sepharose 4Fast Flow 亲和层析(其中泳道一为标准分子量，泳道二为纯化的GBP-K33，泳道三为GST-TI蛋白对照，泳道四为GST蛋白)图3 :GBP-K33胰蛋白酶抑制剂活力图4 :GBP-K33对细胞活力的影响图5GBP-K33对细胞凋亡的影响
具体实施例方式实施例1:GBP-K33片段编码基因的合成及重组表达质粒GBP-K33的构建根据文献报道的GBP-K33片段氨基酸序列，委托上海生物工程有限公司通过化学方法合成。GBP-K33片段的编码基因(两端插入BamH I和Bio I酶切位点)，BamH I和Bio I双酶切、胶回收目的基因片段，与同样BamH I和)(h0 I双酶切的pGEX_4T_l载体进行连接，得到重组表达质粒PGEX-4T-1-GBP-K33。通过双酶切及测序鉴定重组质粒(见图1)。GBP-K33片段蛋白的表达及纯化将重组表达质粒pGEX-4T-l-GBP-K33入大肠杆菌BL21中，筛选阳性克隆，挑取单菌落接种于5mL LB培养基中过夜培养，然后接种于IL的培养基中，37°C振荡培养至A600nm 达到0. 5时，加入浓度为0. 5mol/L的IPTG，继续培养4h收集菌体。用PBS缓冲液重新悬浮菌体后超声破碎，收集上清。采用GST亲和层析法纯化上清(见图幻。待总蛋白充分吸附以后，用PBS(pH 7.4)缓冲液清洗亲合柱，洗至紫外吸收值为0时停止洗涤。50mmol/L的 Tris-HCKpH 8.0，10mM&GSH，)缓冲液洗脱，收集洗脱液，考马斯亮蓝法测定蛋白浓度。实施例2 胰蛋白酶抑制剂活力测定以BAPA (苯甲酰-dl-Arg-P-硝基酰替苯胺盐酸盐)为底物，加入不同浓度的融合蛋白各58 μ L，用紫外吸收法于410nm处测定胰蛋白酶抑制剂的活力(见图3)。实施例3 =MTT法检测对细胞增殖影响指数生长期的SW620、DLDl、HL-7702和HEK293细胞以IX IO4个/孔传入96孔培养板，37°C含5%的C02培养箱孵育24h后，加入不同浓度的融合蛋白至终浓度依次为 5. 0 μ M、10. 0 μ Μ、20. 0 μ Μ,每个浓度设四个复孔，并用含GST蛋白和GST-TI作为对照。孵育24h后吸弃孔内液体。PBS洗涤后加入新培养基，每孔加MTT溶液(5mg/ml) 20 μ 1，继续孵育4h后终止培养。小心吸弃孔内培养上清液，每孔加150 μ 1 DMS0，振荡lOmin，使结晶物充分融解。570nm波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值(见图4)。实施例4 细胞核的DAPI染色将DLDl和SW620两种结肠癌细胞以10-20X IO5个/孔密度接种到含载玻片的6 孔板上，细胞贴壁并形成单层细胞后。PBS洗涤，重新加入新鲜的含血清培养基，同时实验组加入终浓度为5 μ M的GBP-K33，对照组加入相同浓度的GST蛋白和GST-TI蛋白。孵育24h 后显微镜下观察细胞核的变化(见图5)。
权利要求
1.一种胰蛋白酶抑制剂，其氨基酸序列为SEQ ID NO :1。
2.编码权利要求1所述胰蛋白酶抑制剂的基因，其核苷酸序列为SEQID NO :2。
3.一种载体，含有权利要求2所述的核苷酸序列。
4.一种工程菌，含有权利要求3所述的载体。
5.如权利要求1所述的胰蛋白酶抑制剂的制备方法，包括如下步骤化学合成基因GBP 片段和K33，将这两段序列连接到pGEX-4T-l载体上，获得重组子pGEX-4T-l-GBP_K33，将该重组子转化到大肠杆菌BL21，构建大肠杆菌工程菌pGEX-4T-l-GBP-K33/BL21，将该工程菌接种在含氨苄青霉素的LB培养基中，37°C振荡培养至A 60011!11为0.4-0.6，加入IPTG使终浓度为0. 5mmol/L，诱导表达3_5小时，收集菌体，将上清液经亲和层析纯化获得目的蛋白。
6.如权利要求1所述的胰蛋白酶抑制剂在制备抗癌药物中的应用。
全文摘要
本发明提供了一种胰蛋白酶抑制剂及其获得方法。化学合成葡萄糖调节蛋78(GRP78)的结合肽段(GBP)和胰蛋白酶抑制剂活性片段K33的基因序列，将这两个序列通过限制性酶切位点融合连接到pGEX-4T-1载体上，获得重组子。将该重组子转化到大肠杆菌BL21，筛选获得工程菌pGEX-4T-1-GBP-K33/BL21。将该工程菌接种到含氨苄青霉素的LB培养基中，37℃振荡培养，经IPTG诱导表达，收集菌体，分离纯化获得目的蛋白。该蛋白可有效的促进结肠癌细胞凋亡，对正常细胞无作用，可在制备抗癌药物中应用。
文档编号A61K38/56GK102558360SQ20121001218
公开日2012年7月11日 申请日期2012年1月15日 优先权日2012年1月15日
发明者史通麟, 李卓玉, 李宗伟, 李汉卿, 赵超 申请人:山西大学