专利名称：一种氧化石墨烯双靶向药物载体材料的制备方法和负载的药物的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种氧化石墨烯双靶向药物载体材料的制备方法，本发明还涉及该载体材料负载的药物。
背景技术：
作为世界上最薄的新型二维纳米材料，石墨烯独特的结构使其在生物医学、复合材料、传感器、能源等领域具有重要的应用前景，成为近年来纳米领域研究的热点。由于石墨烯具有单原子层结构，其理论比表面积高达^K)0m2/g，非常适合用作药物载体。同时其两个基面都可以吸附药物，所以具有其他纳米材料无可比拟的超高载药率。在生物医学领域应用较多的石墨烯衍生物主要是功能化的氧化石墨烯。由于氧化石墨烯上含有大量的含氧活性基团，因此具有良好的生物相容性和水溶液稳定性，同时有利于采用共价修饰方法实现药物分子的负载。除了共价键功能化外，还可以利用n-n相互作用、离子键和氢键等非共价键作用，实现药物分子在石墨烯表面的装载。研究显示，氧化石墨烯对药物的装载可以达到238%，远远超过普通载药材料。基于石墨烯具有超高的载药量，学者们继而把目光转向其在药物靶向输送及可控释放领域的应用。石墨烯的肿瘤靶向应用主要是通过石墨烯与肿瘤靶向物质的嫁接，将药物分子靶向输送至肿瘤病灶，实现对肿瘤细胞特异性的杀伤作用。石墨烯基肿瘤靶向载体材料使药物分子聚集在靶部位并平稳释放，提高靶部位的药物浓度，增强治疗效果；同时使药物在非病灶部位的浓度降低，从而降低药物的毒副作用。目前广泛使用的纳米药物载体多为核壳结构或多层结构。核部分通过亲水疏水相互作用、JI-JI相互作用、离子键和共价键等作用力包裹负载药物；壳部分主要起到靶向及控制释放的作用。此类纳米药物载体结构复杂，合成成本高，效率低，难以大规模制备。
发明内容
本发明的目的是提供一种氧化石墨烯双靶向药物载体材料的制备方法，以解决已有纳米药物载体结构复杂，合成成本高，效率低，难以大规模制备的问题。本发明方法包括下述步骤第一步羧甲基化氧化石墨烯的制备；详细过程如下将0. 5 5. Og的氧化石墨分散于100 1000mL、浓度为0. 2mol/L的NaOH溶液中，超声分散10 60min ；接着向上述溶液中加入2 20g氯乙酸，搅拌反应2 IOh ；然后在16000r/min速度下离心10 30min，水洗至pH为7 8，最后真空干燥得到羧甲基化氧化石墨烯(G0-C00H)；第二步氧化石墨烯-生物靶向分子复合物的制备；详细过程如下将80 800mgG0-C00H分散于0. 2 2L的40mmol/L的2-(N-吗啉)乙磺酸(MES)缓冲液中，搅拌下加入0. 4 4g N-羟基丁二酰胺(NHS)并超声分散10 30min，然后搅拌下加入0. 2 2g的1-(3- 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二甲胺(EDC)并超声分散10 30min ；接着加入 0. 1 Ig生物靶向分子至上述溶液中并超声分散10 30min ；随后把混合溶液搅拌反应6 12h ；在16000r/min速度下离心10 30min，水洗至pH为7 8，最后真空干燥得氧化石墨烯-生物靶向分子复合物；第三步氧化石墨烯双靶向药物载体材料的制备；详细过程如下将40 400mg 的氧化石墨烯-生物靶向分子复合物分散在200 2000ml pH值为12的NaOH溶液中，超声分散2 4小时；把上述溶液用截留分子量为7000的透析袋透析至透析外液呈中性，浓缩溶液至 20 200ml ；氮气氛下，将 100 IOOOmg 的 FeCl3. 6H20 及 200 2000mg 的 FeCl2. 4H20 溶解于5-50ml水中，并在氮气氛下将上述两种溶液混合反应12 Mh ；采用16000r/min 速度下离心10 30min，分离出固体，水洗除去多余的盐；把固体重新分散到25 250ml 水中，在队气氛下，将4 40ml浓度为3mol/L的NaOH滴加至溶液中，在65°C温度下反应 2 4小时；所得产物在16000r/min速度下离心10 30min，最后将所得固体真空干燥。本发明涉及的氧化石墨烯双靶向药物载体材料采用生物靶向分子及纳米磁性粒子四氧化三铁作为双靶向介质，实现药物的靶向输送。与传统纳米药物载体相比，本发明具有靶向作用强，载药高效，合成简单，易于大规模制备等优点。本发明还涉及该载体材料负载的药物，所述药物为含有π-JI共轭体系的药物。
图1是实施方式4中合成的叶酸-Fe3O4-氧化石墨烯双靶向药物载体的红外光谱分析图片，图2是实施方式4中合成的叶酸-Fe3O4-氧化石墨烯双靶向药物载体的透射电镜图片，图3是实施方式4中合成的双靶向药物载体进行细胞靶向实验所得到的荧光光谱图，图4是实施方式5中制备的负载有盐酸阿霉素的双靶向药物载体对细胞活力的影响示意图。
具体实施例方式具体实施方式
一本实施方式包括下述步骤第一步羧甲基化氧化石墨烯的制备；详细过程如下将0. 5 5. Og的氧化石墨分散于100 1000mL、浓度为0. 2mol/L的NaOH溶液中，超声分散10 60min ；接着向上述溶液中加入2 20g氯乙酸，搅拌反应2 IOh ；然后在16000r/min速度下离心10 30min，水洗至pH为7 8，最后真空干燥得到羧甲基化氧化石墨烯(G0-C00H)；氧化石墨按照Hummer法制备。第二步氧化石墨烯-生物靶向分子复合物的制备；详细过程如下将80 800mgG0-C00H分散于0. 2 2L的40mmol/L的2-(N-吗啉)乙磺酸(MES)缓冲液中，搅拌下加入0. 4 4g N-羟基丁二酰胺(NHS)并超声分散10 30min，然后搅拌下加入0. 2 2g的1-(3- 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二甲胺(EDC)并超声分散10 30min ；接着加入 0. 1 Ig生物靶向分子至上述溶液中并超声分散10 30min ；随后把混合溶液搅拌反应 6 12h ；在16000r/min速度下离心10 30min，水洗至pH为7 8，最后真空干燥得氧化石墨烯-生物靶向分子复合物；第三步氧化石墨烯双靶向药物载体材料的制备；详细过程如下将40 400mg 的氧化石墨烯-生物靶向分子复合物分散在200 2000ml pH值为12的NaOH溶液中，超声分散2 4小时；把上述溶液用截留分子量为7000的透析袋透析至透析外液呈中性，浓缩
5溶液至 20 200ml ；氮气氛下，将 100 IOOOmg 的 FeCl3. 6H20 及 200 2000mg 的 FeCl2. 4H20 溶解于5-50ml水中，并在氮气氛下将上述两种溶液混合反应12 Mh ；采用16000r/min 速度下离心10 30min，分离出固体，水洗除去多余的盐；把固体重新分散到25 250ml 水中，在队气氛下，将4 40ml浓度为3mol/L的NaOH滴加至溶液中，在65°C温度下反应 2 4小时；所得产物在16000r/min速度下离心10 30min，最后将所得固体真空干燥。本发明提供一种氧化石墨烯双靶向药物载体材料的制备方法。利用氧化石墨烯的结构特点，使其与生物靶向分子(叶酸等)及四氧化三铁磁性纳米粒子复合，制备氧化石墨烯双靶向药物载体材料。负载药物分子后，氧化石墨烯双靶向药物载体材料在生物靶向分子及磁场的双重作用下发生有序运动，实现药物分子的双重靶向输送。所述药物为含有π-π共轭体系的各种药物，优选为具有良好水分散性的药物， 如盐酸阿霉素、紫衫醇、羟基喜树碱、道诺霉素等。氧化石墨烯双靶向药物载体材料负载的药物可是上述药物中的一种或多种。
具体实施方式
二 本实施方式与实施方式一的不同之处是第二步中的生物靶向分子为叶酸，制得的是氧化石墨烯叶酸复合物(FA-GO)；第三步骤中得到的是氧化石墨烯叶酸四氧化三铁复合物(FA-Fe3O4-GO)。
具体实施方式
三本实施方式与实施方式一的不同之处是所述生物靶向分子是分子结构中含氨基或羟基的多肽或抗体。
具体实施方式
四采用以下途径制备FA-Fe3O4-GO15一、氧化石墨按照Hummer法制备。将0. 5g的氧化石墨分散于IOOmL 0. 2mol/L的 NaOH溶液中，超声分散30min。向上述溶液中加入2g氯乙酸，搅拌反应4h。在16000r/min 速度下离心lOmin，水洗至pH为7，真空干燥得G0-C00H。二、将80mg GO-COOH分散于40mmol/L2- (N-吗啉)乙磺酸(MES)缓冲液中，搅拌下加入400mg N-羟基丁二酰胺(MB)并超声分散lOmin。搅拌下加入200mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二甲胺(EDC)并超声lOmin。加入IOOmg叶酸至上述溶液中并超声分散 IOmin0混合溶液搅拌反应12h。在16000r/min速度下离心lOmin，水洗至pH为7，真空干燥得FA-GO。三、40mg的FA-G0分散在200ml pH值为12的NaOH溶液中超声2小时。上述溶液用截留分子量为7000的透析袋透析至透析外液呈中性，浓缩溶液至20ml。氮气氛下，将 IOOmg的FeCl3. 6H20及200mg的!^eCl2. 4H20溶解于5_10ml水中，并在氮气氛下将上述两种溶液混合反应12h。采用16000r/min速度下离心10 30min，分离出固体，水洗除去多余的盐。固体重新分散到25ml水中，在N2气氛下，将NaOHGml，3mol/L)滴加至溶液中，65°C 反应2小时。产物在16000r/min速度下离心10 30min。所得FA-Fe3O4-GO真空干燥。图1显示了合成的FA-Fe3O4-GO的红外光谱，从结果可知FA-Fe3O4-GO的红外光谱显示出了 G0、FA和!^e3O4的特征吸收峰，证明叶酸及!^e3O4已经成功连接到了 GO的表面。图 2显示了 FA-Fe3O4-GO的透射电镜图片。从图中可以看出，！^e3O4纳米颗粒均勻的覆盖在GO 表面，再一次证明了狗304在GO表面的负载。把小鼠神经瘤母细胞(N2a)与人乳腺癌细胞(MCF-7)接种于六孔板中，培养48h。 将200 μ g罗丹明B加入至IOmL浓度为500 μ g/mL的FA-Fe3O4-GO水溶液中，室温下避光搅拌12h。向六孔板每孔加入上述溶液lmL，37°C并在磁场作用下哺育3h。后用磷酸缓冲溶液清洗细胞，除去未与细胞结合的FA-Fe53O4-GO11检测细胞悬浮液中罗丹明B的荧光光谱，激发光波长设定为300nm。实验结果显示(图3)，MCF-7细胞的荧光信号显著大于Nh细胞， 说明FA-Fe3O4-GO具有特定的靶向作用。
具体实施方式
五本实施方式给出了负载有盐酸阿霉素的双靶向药物载体的制备方法。具体过程为将200mL浓度为0. 4mg/mL的FA-Fe3O4-GO水溶液与200mL浓度为0. 8mg/ mL的盐酸阿霉素水溶液混合，室温避光搅拌12小时。采用16000r/min速度下离心20min， 用紫外-可见光谱仪测定上清液中盐酸阿霉素的浓度。计算盐酸阿霉素在FA-Fe3O4-GO上的负载量为1. 04mg/mgo把小鼠神经瘤母细胞(N2a)与人乳腺癌细胞(MCF-7)接种于96孔板中，培养48h。 将不同浓度的实施例5中负载有盐酸阿霉素的FA-Fe3O4-GO加入至细胞培养液中，37°C并在磁场作用下哺育Mh。后用磷酸缓冲溶液清洗细胞，除去负载有盐酸阿霉素的FA-Fe3O4-GO15 采用MTT法检测细胞活力。实验结果显示(图4)，随着浓度的增加Nh细胞及MCF-7细胞的活力均减小。同时FA-Fe3O4-GO显示出明显的靶向细胞毒性，MCF-7细胞活力减小的幅度要明显大于N2a细胞。
权利要求
1.一种氧化石墨烯双靶向药物载体材料的制备方法，其特征在于它包括如下步骤第一步羧甲基化氧化石墨烯的制备；详细过程如下将0. 5 5. Og的氧化石墨分散于100 1000mL、浓度为0. 2mol/L的NaOH溶液中，超声分散10 60min ；接着向上述溶液中加入 2 20g氯乙酸，搅拌反应2 IOh ；然后在16000r/min速度下离心10 30min，水洗至pH 为7 8，最后真空干燥得到羧甲基化氧化石墨烯(G0-C00H)；第二步氧化石墨烯-生物靶向分子复合物的制备；详细过程如下将80 800mgG0-C00H分散于0. 2 2L的40mmol/L的2-(N-吗啉)乙磺酸(MES)缓冲液中，搅拌下加入0. 4 4g N-羟基丁二酰胺(NHS)并超声分散10 30min，然后搅拌下加入0. 2 2g的1-(3- 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二甲胺(EDC)并超声分散10 30min ；接着加入 0. 1 Ig生物靶向分子至上述溶液中并超声分散10 30min ；随后把混合溶液搅拌反应 6 12h ；在16000r/min速度下离心10 30min，水洗至pH为7 8，最后真空干燥得氧化石墨烯-生物靶向分子复合物；第三步氧化石墨烯双靶向药物载体材料的制备；详细过程如下将40 400mg的氧化石墨烯-生物靶向分子复合物分散在200 2000ml pH值为12的NaOH溶液中，超声分散2 4小时；把上述溶液用截留分子量为7000的透析袋透析至透析外液呈中性，浓缩溶液至 20 200ml ；氮气氛下，将 100 IOOOmg 的 FeCl3. 6H20 及 200 2000mg 的 FeCl2. 4H20 溶解于5-50ml水中，并在氮气氛下将上述两种溶液混合反应12 Mh ；采用16000r/min 速度下离心10 30min，分离出固体，水洗除去多余的盐；把固体重新分散到25 250ml 水中，在队气氛下，将4 40ml浓度为3mol/L的NaOH滴加至溶液中，在65°C温度下反应 2 4小时；所得产物在16000r/min速度下离心10 30min，最后将所得固体真空干燥。
2.根据权利要求1所述的一种氧化石墨烯双靶向药物载体材料的制备方法，其特征在于第一步中的氧化石墨按照Hummer法制备。
3.根据权利要求1或2所述的一种氧化石墨烯双靶向药物载体材料的制备方法，其特征在于第二步中的生物靶向分子为叶酸，制得的是氧化石墨烯叶酸复合物；第三步骤中得到的是叶酸-Fe3O4-氧化石墨烯复合物。
4.根据权利要求1所述的一种氧化石墨烯双靶向药物载体材料的制备方法，其特征在于所述生物靶向分子是分子结构中含氨基或羟基的多肽或抗体。
5.根据权利要求1所述的一种氧化石墨烯双靶向药物载体材料的制备方法，其特征在于它的过程如下一、氧化石墨按照Hummer法制备；将0. 5g的氧化石墨分散于 IOOmLO. 2mol/L的NaOH溶液中，超声分散30min ；向上述溶液中加入2g氯乙酸，搅拌反应 4h ；在16000r/min速度下离心lOmin，水洗至pH为7，真空干燥得G0-C00H ；二、将80mgG0-C00H分散于40mmol/L2-(N-吗啉)乙磺酸(MES)缓冲液中，搅拌下加入400mg N-羟基丁二酰胺(MB)并超声分散IOmin ；搅拌下加入200mg 1_(3_ 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二甲胺(EDC)并超声lOmin。加入IOOmg叶酸至上述溶液中并超声分散 IOmin ；混合溶液搅拌反应12h ；在16000r/min速度下离心lOmin，水洗至pH为7，真空干燥得氧化石墨烯叶酸复合物；三、40mg的氧化石墨烯叶酸复合物分散在200mlpH值为12的NaOH溶液中超声2小时； 上述溶液用截留分子量为7000的透析袋透析至透析外液呈中性，浓缩溶液至20ml。氮气氛下，将IOOmg的FeCl3. 6H20及200mg的!^eCl2. 4H20溶解于5-lOml水中，并在氮气氛下将上述两种溶液混合反应12h ；采用16000r/min速度下离心10 30min，分离出固体，水洗除去多余的盐；固体重新分散到25ml水中，在队气氛下，将細1浓度为3mol/L的NaOH滴加至溶液中，65°C反应2小时；产物在16000r/min速度下离心10 30min ；所得叶酸-Fe3O4-氧化石墨烯双靶向药物载体真空干燥。
6.根据权利要求1、2、4或5所述的一种氧化石墨烯双靶向药物载体材料的制备方法得到的载体材料，所负载的药物为盐酸阿霉素、紫衫醇、羟基喜树碱、道诺霉素中的一种或多种。
7.根据权利要求3所述的一种氧化石墨烯双靶向药物载体材料的制备方法得到的载体材料，所负载的药物为盐酸阿霉素、紫衫醇、羟基喜树碱、道诺霉素中的一种或多种。
全文摘要
一种氧化石墨烯双靶向药物载体材料的制备方法和负载的药物，本发明涉及一种氧化石墨烯双靶向药物载体材料的制备方法，本发明还涉及该载体材料负载的药物。用于制备载体材料和负载药物。它解决了已有纳米药物载体结构复杂，合成成本高，效率低，难以大规模制备的问题。制备方法包括如下步骤羧甲基化氧化石墨烯的制备；氧化石墨烯-生物靶向分子复合物的制备；氧化石墨烯双靶向药物载体材料的制备；所负载的药物为盐酸阿霉素、紫衫醇、羟基喜树碱、道诺霉素中的一种或多种。
文档编号A61P35/00GK102552932SQ20121002807
公开日2012年7月11日 申请日期2012年2月9日 优先权日2012年2月9日
发明者唐培毅, 张丽, 李翠云, 李艳伟, 胡桢, 黄玉东 申请人:哈尔滨工业大学